四川省草莓灰霉病菌对咯菌腈的抗性测定及其机制

【目的】灰霉病是草莓生产过程中的一种重要病害,严重影响了其产量和品质。论文旨在明确四川省草莓灰霉病菌对咯菌腈的抗性频率以及抗性机制,为草莓灰霉病的药剂防治提供理论依据。【方法】2016—2017年从四川成都、德阳、眉山、乐山及雅安等地采集草莓灰霉病样本,并分离纯化得到188株草莓灰霉病菌菌株。采用区分计量法测定188株灰霉病菌对咯菌腈的敏感性水平,采用菌丝生长速率抑制法测定咯菌腈对代表性菌株的毒力和渗透压敏感性,采用甘油铜比色法测定经咯菌腈处理的抗性菌株和敏感菌株甘油含量,采用分段测序对抗性菌株和敏感菌株Ⅲ型组氨酸激酶基因BOS1(BC1G_00374)扩增测序,采用Swissmodle和I-TASSER预测和评价突变对BOS1的结构影响。【结果】188株灰霉病菌菌株中有8株表现为高抗,9株为中抗,43株为低抗,其余表现为敏感;咯菌腈对代表性菌株的EC50介于0.03—0.62μg·mL~(-1),代表性菌株的抗性倍数范围为2.2—45.9。NaCl浓度在1.25—10 g·L~(-1)可刺激敏感菌株生长,浓度在1.25—20 g·L~(-1)范围可刺激抗性菌株生长,但40 g·L~(-1)时则抑制菌丝生长,尤其对抗性菌株,抗性越高抑制作用越强;在正常条件下各代表性菌株甘油含量介于0.0025—0.0148μg·mL~(-1),且菌株的甘油含量与咯菌腈抗性没有明显的关联性,但在使用咯菌腈处理(0.1μg·mL~(-1))抗性菌株和敏感菌株后,甘油含量均上升,且抗性菌株甘油含量上升幅度明显低于敏感菌株。低抗菌株YAHY-13、CDCZ-2以及中抗菌株CDCZ-42在TAR和HAMP区域均发生突变,中抗菌株CDCZ-20和高抗菌株MYFC-10、CDCZ-43在TAR和REC区域均有突变,但CDCZ-20菌株在TAR区域位点是I365N,而两株高抗菌株在TAR区域位点是I365S。不同突变位置对BOS1区域结构有不同程度的影响,其中F127S、I365N、I365S、V1136I、A1259T均处于BOS1区域结构的无规则卷曲,但TAR区域I365N和I365S使区域结构无规则卷曲发生整体偏移。【结论】四川省已有部分地区草莓灰霉病菌对咯菌腈产生了抗性;相比敏感菌株,田间抗性菌株对渗透压的耐受能力增加,但当浓度超过耐受范围后对渗透胁迫高度敏感,药剂胁迫下田间抗性菌株甘油含量增加量显著小于敏感菌株;组氨酸激酶BOS1突变的位置和方式与灰霉病菌菌株对咯菌腈的抗性水平存在必然联系。     

丙烷脒衍生物的合成及其抑菌活性测定

【目的】寻找更高活性的芳香二脒类抑菌化合物。【方法】以对氰基苯酚、1,3-二溴丙烷和1,4-二溴丁烷为原料,合成了A3、B3、B4、C3、C4、D3、D4和E3 8个丙烷脒衍生物,用1H-NMR和MS鉴定了其结构,用生长速率法和黄瓜真叶法测定了其活性,并与丙烷脒进行了比较。【结果】生长速率法测试表明,8种丙烷脒衍生物对番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)菌丝生长均具有较强的抑制作用,其中N,N-二正丙基丙烷脒(B3)、N,N-二正丙基丁烷脒(B4)、N,N-二异丙基丙烷脒(C3)、N,N-二异丁基丁烷脒(D3)对番茄灰霉病菌生长抑制的毒力均高于丙烷脒,其EC50为0.304 3~3.473 0 mg/L;黄瓜真叶法测定表明,50 mg/L剂量下B3、B4、C3的3 d保护效果均在60%以上,优于丙烷脒处理的57.55%;B3、B4的3 d治疗效果分别为71.70%和68.87%,与丙烷脒防效(64.15%)相当。【结论】B3、B4较丙烷脒抑菌活性有较大提高,有望成为丙烷脒产品的更新品种。     

丙烷脒对灰霉病菌菌丝形态和超微结构的影响

【目的】杀菌剂对病菌菌丝形态和超微结构的影响，是进行杀菌剂作用机理研究的基础。【方法】采用扫描电镜和透射电镜，研究了丙烷脒对灰霉病菌菌丝形态和超微结构的影响。【结果】药剂处理1 d后，菌丝局部不规则膨胀，菌丝隔膜间距变短；药剂处理3 d，菌丝局部严重膨大，且膨胀部位失水畸形。透射电镜观察表明，药剂处理1 d后，菌丝细胞线粒体体积增大、数目增多，细胞核的结构已不明显，细胞内出现囊泡；3 d后，各细胞器结构紊乱，并含有大量的无膜透明内含物，有较大的空腔形成，细胞壁外围沉积大量的外渗物，菌丝组织坏死。【结论】丙烷脒对灰霉病菌菌丝形态和超微结构的影响不同于常用杀菌剂品种，预示丙烷脒的作用机理独特。对丙烷脒作用机理进行深入研究，有望发现杀菌剂新的作用靶标，为杀菌剂新品种的开发提供依据。     

抗速克灵灰霉病菌菌株电导率变化及对渗透压的敏感性

比较了灰霉病菌高抗速克灵菌株和敏感菌株电导率变化及对渗透压的敏感性。结果表明:敏感菌株在葡萄糖浓度80g/L或NaCl浓度5g/L之前,菌落直径随渗透压提高而增大,超过此浓度界线随渗透压提高而减小;抗药菌株在本试验的浓度范围内,在两种培养基上的菌落直径均随渗透压提高而减小,且小于同等条件下敏感菌株的菌落直径。表明敏感菌株对低渗透压和高渗透压表现敏感,抗药菌株仅对高渗透压表现敏感,且抗药菌株与敏感菌株相比,对渗透压更敏感。抗药菌株的相对电导率值大于敏感菌株,说明抗药菌株膜透性比敏感菌株大。     

土壤中抗真菌放线菌LH33发酵提取物活性研究

【目的】对抗真菌放线菌LH33菌株发酵提取物的活性进行初步测定,为后续的生防制剂研发提供科学依据。【方法】制备从渭北旱塬轮作土壤中筛选出的放线菌菌株LH33的发酵提取物,检测其对番茄灰霉病菌孢子萌发的抑制作用及对番茄灰霉病的防治和番茄的促生作用,并采用生长速率法测定其抑菌谱。【结果】在离体条件下,LH33发酵提取物对番茄灰霉病菌孢子的萌发具有强烈的抑制作用。在温室条件下,LH33发酵提取物对蕃茄灰霉病具有很好的预防和治疗效果,100 mg/L的LH33发酵提取物对番茄灰霉病菌预防和治疗效果最高,分别为94.2%和80.4%。LH33提取物对大多数供试病原真菌都有很好的抑制效果,其中1 mg/L药液对部分病原真菌抑制率在45%以上。菌株LH33发酵提取物能促进番茄的生长,番茄植株鲜质量的增幅可达到95.1%。【结论】菌株LH33可防治水稻、番茄、小麦、棉花等多种植物真菌病,并对植物的生长有促进作用。     

大蒜鳞茎中抗番茄灰霉病内生菌的筛选及其防治效果

【目的】筛选拮抗番茄灰霉病的内生菌菌株,研究其生防效果,为开发有应用潜力的微生物农药奠定基础。【方法】用平板对峙法从大蒜鳞茎内筛选具有拮抗作用的内生菌,测定拮抗菌株对番茄离体叶片、果实、胚根和盆栽植株灰霉病的防治效果,以及对7种常见病原真菌的抑菌活性。【结果】从分离纯化的63株候选菌株中获得了22株具有一定抑菌活性的内生菌,其中有4株内生菌(D6,D10,D21,Y3)对番茄灰霉病有显著的抑制效果,抑菌率最高可达77.5%。4株拮抗菌均有较强的抑菌活性,对番茄离体叶片、果实和胚根上番茄灰霉病菌的生长抑制率最高分别达92%,71.13%和70.3%;对盆栽植株番茄灰霉病菌的抑制率最高可达96.2%;这4株菌对西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)、玉米弯孢病菌(Curvularia lunata)、烟草赤星病菌(Alternaria longipes)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、苹果炭疽病菌(Glomerella cingulata)、稻瘟病菌(Pyricularia oryzae Cav.)和棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporun f.sp.vasinfectum)均有一定的抑菌活性,抑制率最高达83.1%。【结论】大蒜鳞茎中的内生菌对番茄灰霉病有明显的抑制作用,这为内生菌在番茄灰霉病防治方面的应用提供了理论依据。     

赣南地区番茄青枯菌菌系多样性分析

【目的】分离鉴定赣南地区番茄青枯病菌,明确菌系分化,为当地番茄抗青枯病育种和病害防治奠定基础。【方法】从江西省赣南地区采集番茄青枯病病株,经选择性平板分离、纯化和分子鉴定,获得不同地理来源的青枯菌Ralstonia solanacearum菌株。通过生理生化测定和接种番茄试验,鉴定青枯菌的生化变种和致病类型。PCR扩增内切葡聚糖酶基因egl序列,明确青枯菌的演化型和序列变种。双层平板培养法测定其对8个不同噬菌体的敏感性。【结果】获得了来自赣南地区9个市(县)的番茄青枯菌菌株44个,其中,41个菌株为生化变种Ⅲ,3个菌株为生化变种Ⅳ;致病力测定结果聚为I、II和III类,其致病力分别为强、中和弱,其中,强致病力菌株占65.9%。所有菌株属于亚洲分支演化型(Ⅰ),并进一步划分为Sequevar13、14、15、17、18、34、44和48等8个序列变种。大部分菌株对供试的8个噬菌体敏感。【结论】赣南地区番茄青枯菌以生化变种III和强致病力菌株为主,对噬菌体较敏感,存在8个序列变种,具有明显的菌系分化现象和遗传多样性。     

新型杀菌剂丙烷脒开发研究

丙烷脒属烷基脒类化合物,该类化合物在医药上早有应用和研究。美国NZYM公司在一次偶然事件中发现了该类化合物中的戊烷脒对草莓灰霉病菌(Botrytiscirerea)的抑菌活性,通过一系列的室内试验,戊烷脒的抑菌活性得到了确证。自1999年起,西北农林科技大学无公害农药研究服务中心与NZYM公司合作,开始致力于将该类化合物开发成为农用杀菌剂的研究。经过近6年的研究,已将该类化合物中的丙烷脒开发成了一个新型杀菌剂品种,完成了丙烷脒原药和2%丙烷脒水剂的农药产品登记,申请了国家农药发明专利,使丙烷脒成为了我国有自主知识产权的农药品种。丙烷脒同系物的活性研究戊烷脒的抑菌活性最先被发现,在一系列的室内外试验中,其对灰霉病菌表现出优异的活性,但对其进一步研究发现,戊烷脒存在合成原料供应困难、合成收率低和成本高等问题,限制了戊烷脒在农用杀菌剂方面的开发应用。能否在戊烷脒同系物中筛选出合成原料易得、合成收率高,同时又具有较高生物活性的化合物,成为该类化合物能否开发成农用杀菌剂品种的关键。为了解决戊烷脒开发研究中存在的问题,合成了戊烷脒同系物乙烷脒、丙烷脒和丁烷脒,并对各化合物的抑菌活性进行了系统研究。以番茄灰霉病菌(Boty...     

不同生长条件对番茄早疫病菌抗腈菌唑菌株生长的影响

通过改变生长条件,如碳氮源、pH和渗透压等研究其对番茄早疫病菌抗腈菌唑菌株生长的影响。结果表明,与对敏感菌株生长的影响相比,碳氮源、pH和NaC1渗透压的变化对抗性菌株的生长无明显影响,而葡萄糖渗透压的变化对抗性菌株的影响要比对敏感菌株的明显。由此可推断抗性菌株在自然环境中可能会与敏感菌株形成竞争关系,甚至会成为优势种群而影响腈菌唑的药效。     

丙烷脒类似物抑菌活性研究初报

丙烷脒是一新发现的杀菌剂,具有高效、低毒、作用机理独特等特点。以番茄灰霉病菌和白菜黑斑病菌等植物病原菌作为供试生物,用抑制菌丝生长速率法测定了合成的9个丙烷脒类似物的抑菌活性。结果表明：在供试浓度为10mg／L时,化合物A1～A5对番茄灰霉病菌、白菜黑斑病菌、苹果干腐病菌和烟草赤星病菌菌丝生长抑制率均在80％以上;化合物B5对小麦纹枯病菌菌丝生长抑制率为82．2％,值得进一步研究。     

辽宁省番茄灰霉病菌对啶酰菌胺敏感性的研究（英文）

[目的]避免和延缓番茄灰霉病菌对啶酰菌胺抗药性的产生。[方法]采用菌丝生长速率法测定辽宁省番茄灰霉病菌对啶酰菌胺的敏感性,明确不同地区番茄灰霉病菌对啶酰菌胺敏感性差异的分布。[结果]辽宁省不同番茄灰霉病菌菌株的EC_(50)值分布在0.080 0~7.787 2μg/ml,敏感性最低和最高的菌株EC50值相差97.34倍。将符合正太分布的158株番茄灰霉病菌的平均EC_(50)值1.973 1μg/ml初步定为辽宁省番茄灰霉病菌对啶酰菌胺的敏感基线。[结论]开展番茄灰霉病菌对啶酰菌胺抗药性风险评估很重要。     

丙烷脒对番茄灰霉病菌超微结构的影响

    利用电子显微技术研究了丙烷脒(propamidine)对番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers.)菌丝形态和细胞结构的影响.研究发现丙烷脒不仅影响菌丝的生长,而且引起菌丝形态和细胞结构一系列的变化.丙烷脒处理番茄灰霉病菌菌丝后,引起病菌菌丝形态和细胞结构的变化主要包括:菌丝分枝增多,并呈不规则的膨大和缢缩,细胞壁出现不规则的加厚,顶端加厚尤其严重,线粒体数目急剧增多且出现不规则的膨大现象,随着处理时间的延长,细胞出现空泡化和电子致密度增加现象.这些细胞学变化特征最终导致菌丝细胞解体死亡.     

加工番茄系统抗性诱导促生菌的筛选鉴定及其促生防病效果

【目的】 筛选具有诱导番茄系统抗性的促生菌并验证其对加工番茄早疫病、灰霉病的防效,为新疆加工番茄病害的生物防治提供理论依据和菌种资源。【方法】 采用稀释涂布法,分离番茄等作物的根部土壤细菌,以无菌生理盐水和稀释至10⁴倍数未接菌的NB培养基为空白对照,利用发芽实验初筛加工番茄促生菌;用菌株发酵液灌根处理加工番茄幼苗,以清水处理为空白对照,测量叶片中茉莉酸含量,复筛系统抗性诱导菌株,分别挑战接种番茄早疫病、灰霉病病原菌,统计疫情指数和诱抗效果。测定菌株16S rDNA序列,初步进行菌种鉴定。【结果】 共分离到147株细菌,筛选得到19株显著(P<0.05)促进加工番茄种子萌发、增加根长的促生菌,有4株促生菌显著(P<0.05)提高加工番茄叶片中茉莉酸含量,防病验证最终得到3株能同时有效防治加工番茄早疫病、灰霉病的菌株,诱抗防效在27.59%~39.44%。菌株FY10、FY12、FY93鉴定为Bacillus atrophaeus,Pseudomonas wadenswilerensis和Bacillus pumilus。【结论】 获得3株具有系统抗性诱导功能且有效防治加工番茄早疫病、灰霉病的促生菌。     

番茄灰霉菌啶酰菌胺抗性菌株生理特性初探

[目的]对番茄灰霉病菌敏感菌株和抗啶酰菌胺菌株苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(PDD)的生理生化特性的测定,以及菌株适应度评价和致病性测定分析。[方法]经不同浓度啶酰菌胺处理后,分别测定了抗性与敏感性菌株0~24h内PAL和POD活性变化;同时在PDA上培养这2种菌株,并分析了的菌落大小、菌丝干重及产孢量;利用体外接种番茄果实分析致病性强弱。[结果]发现药剂处理后,2种类型菌株PAL和POD活性都有升高趋势,但是抗性突菌株PAL和POD活性上升幅度较敏感菌株高。其中,2种类型菌株的PAL活性均在1.5h达到峰值,而后呈下降趋势;其POD活性在药剂处理后一直呈现上升趋势,在24h达到最大值。适应度评估显示抗性菌株与敏感性菌株的在菌落大小、菌丝干重及产孢量方面无明显差异,体外接种实验也表明两者致病力没有明显差异。[结论]啶酰菌胺抗性菌株比敏感性菌株具有较高的POD及PAL活性,而两者菌落大小、菌丝干重、产孢量及致病性方面无明显差异。     

微生物源挥发性化合物苯并噻唑对灰霉病菌的抑制效应

【目的】评价挥发性化合物苯并噻唑防治灰霉病的应用潜力,为进一步开发利用提供依据。【方法】采用密封盘菌丝生长速率法测定山东省73株灰霉病菌(Botrytis cinerea)对苯并噻唑的敏感性,并比较不同地区和不同表现型菌株(多菌灵抗性和敏感菌株:Car~R,Car~S;腐霉利抗性和敏感菌株:Prc~R,Prc~S;嘧霉胺抗性和敏感菌株:Pyr~R,Pyr~S;啶酰菌胺抗性和敏感菌株:Bos~R,Bos~S)间的敏感性差异;测定苯并噻唑与多菌灵、啶酰菌胺室内混用对灰霉病菌的抑制作用。通过离体黄瓜叶片接种试验验证苯并噻唑对黄瓜灰霉病的保护、治疗效果以及不同熏蒸剂量和时间对灰霉病菌致病力的影响,并用扫描电子显微镜观察苯并噻唑对灰霉菌丝形态的影响。【结果】苯并噻唑对灰霉病菌菌丝的EC50范围为0.38—1.08μL·L~(-1),均值为0.62μL·L~(-1),不同地区之间无敏感性差异;山东地区多菌灵、腐霉利、嘧霉胺、啶酰菌胺抗性和敏感灰霉病菌对苯并噻唑均比较敏感,说明这4种杀菌剂与苯并噻唑无交互抗性;在苯并噻唑0.1—3μL·L~(-1)范围内,菌丝比孢子对其更敏感;2μL·L~(-1)苯并噻唑对菌丝的抑制率高达86.12%,对芽管伸长的抑制率为55.15%,而对孢子萌发的抑制率仅为19.30%。可见,病菌不同生长阶段对此化合物的敏感性不同。苯并噻唑与多菌灵混用防治黄瓜灰霉病无增效或相加作用,两者混用时哪种药剂发挥主要抑菌作用与各组分在混用中使用的浓度和比例有关;苯并噻唑与啶酰菌胺混用有显著增效作用,其田间实际应用方式、效果以及增效机制还有待进一步明确。离体叶片试验表明,苯并噻唑对黄瓜灰霉病兼具保护和治疗防效,2μL·L~(-1)的治疗防效为91.01%,高于对照药剂啶酰菌胺300 mg·L~(-1)(78.90%),并显著高于48.25%的保护防效。苯并噻唑能够显著降低灰霉病菌菌丝的致病力,受抑制程度与苯并噻唑浓度呈正相关。扫描电镜观察发现,苯并噻唑能够使菌丝形态异常,菌丝干瘪,分枝增多,表面凹陷。【结论】苯并噻唑对山东省不同地区的灰霉病菌均有较高的毒力,适合作为防治灰霉病的熏蒸剂使用。     

番茄早疫病菌抗感异菌脲菌株特性研究

测定不同营养条件、温度和pH值对番茄早疫病菌抗感异菌脲菌株生长的影响。结果表明,抗感菌株均在以蛋白胨为氮源的培养基中生长最快,敏感菌株在以可溶性淀粉为碳源的培养基中生长最快,突变体和抗性菌株在以乳糖为碳源的培养基上生长最快。突变体在pH值为7时生长最快而敏感菌株在pH值为6时生长最快,在不同pH值条件下,敏感菌株都比突变体生长速度快。在4～35℃菌丝均能生长,以20～25℃生长最快。测定抗感菌株对渗透压的敏感性和菌丝内的甘油、可溶性糖含量。结果发现,突变体比亲本菌株对渗透压具有较高的敏感性,所有抗性菌株在含高于10g/LNaCl的PDA平板上菌落直径随着NaCl质量浓度的升高而减小,在含高于40g/LNaCl的平板上停止生长。含药培养液中敏感菌株菌丝内甘油合成大量增加和积累,突变体和抗性菌株菌丝内甘油含量增加较少或有所下降,菌丝内可溶性糖含量变化不明显。     

辣椒炭疽病菌抗啶氧菌酯突变体渗透压敏感性及交互抗性

为了探讨辣椒炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides敏感菌株与抗啶氧菌酯突变体对渗透压敏感性的差异,室内诱导获得了C.gloeosporioides对啶氧菌酯的抗性突变体,在此基础上,对其抗感菌株渗透压敏感性及交互抗性进行了研究。结果表明,抗感菌株在供试葡萄糖浓度下均可生长,相比无糖培养基,在含有葡萄糖的培养基上菌落直径显著增加;随着培养基中NaCl浓度的升高,抗感菌株菌丝生长均受到抑制,且敏感菌株与不同抗性水平抗性突变体对高浓度NaCl渗透压均敏感,但渗透压敏感性没有显著差异。啶氧菌酯与嘧菌酯、醚菌酯、多菌灵、咪鲜胺的交互抗性测定结果显示,啶氧菌酯与同属甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的嘧菌酯、醚菌酯之间存在正交互抗性,与多菌灵、咪鲜胺之间均无交互抗性产生。该研究结果可为指导生产中合理用药提供理论依据。     

番茄灰霉病菌对嘧霉胺抗药性的试验

从辽宁省不同地区保护地采集番茄灰霉病菌。经单胞分离获得代表性菌株35株，彩菌丝生长速率法测定各菌株对嘧霉胺的敏感性。结果表明，番茄灰霉病菌已对嘧霉胺产生中等水平抗药性，抗性频率为22.9%。不同地区存在差异，嘧霉胺使用较多的锦州和瓦房店地区抗药性频率较高。在离体条件下，抗药性菌株具有良好的遗传稳定性，与敏感菌株相似适应能力。     

啶酰菌胺和咯菌腈对番茄灰霉病菌不同菌株的毒力（初报）

为了明确啶酰菌胺和咯菌腈对番茄灰霉病菌不同菌株的毒力,采用菌丝生长速率法测定了从河北和山东采集的番茄灰霉病菌菌株对啶酰菌胺及咯菌腈的敏感性。结果表明：2008～2010年,从河北定州采集的番茄灰霉病菌对啶酰菌胺和咯菌腈的敏感性差异不显著;而2010年,从河北徐水采集的菌株对啶酰菌胺和咯菌腈的敏感性显著低于从河北定州和山东寿光采集的菌株,但啶酰菌胺和咯菌腈对所有菌株均有很强的抑制作用。啶酰菌胺和咯菌腈可替代生产中普遍发生抗药性问题的多菌灵、乙霉威、异菌脲和嘧霉胺防治番茄灰霉病的药剂。室内筛选药剂时,应选择不同菌株进行毒力测定,以提高筛选准确率。     

丙烷脒防治番茄灰霉病效果初报

采用室内毒力测定和田间药效试验方法,对丙烷脒防治番茄灰霉病(Botrytiscirerea)进行了研究。丙烷脒对灰霉病茵茵丝生长和孢子萌发的EC50分别为2．1599mg/L和2．7510mg/L;在组织法测定中,丙烷脒对灰霉病表现出较高的保护和治疗作用;田间药效试验表明,丙烷脒在施用剂量为(a．i．)90-180g／hm2施药4次、间隔7d的条件下对番茄、黄瓜、草莓等作物的灰霉病有良好的防治效果．防效优于对照药剂嘧霉胺和腐霉利,与菌核净的防效相当。