应用RT-PCR技术快速检测鉴定猪瘟病毒

根据所有已报道的猪瘟病毒株（HCV）和牛病毒性腹泻病毒株（BVDV）的序列设计了3条引物Pa,Pb,Pc。应用RT-PCR技术，引物对Pa/Pb从猪瘟HCLV株，猪瘟Thiveral株，3株猪瘟野毒株都扩增出了预期185bp的片断，Pa/Pc从BVDVOregonC24V株中也扩增出了240bp的片断，而Pa/Pb与牛睾九原代细胞，PK-15细胞，BVDVOregonC24V株均无反应，Pa/Pc也不与所试验的5株猪瘟毒株反应。采用多重PCR可以从同时含有HCV和BVDV核酸的样品中扩增出各自的特异性条带。针对猪瘟兔化弱毒疫苗株（HCLV）的特异性插入序列。设计了引物Pr,Pra,Prb，可以从HCLV细胞毒或用HCLV人工感染的兔脾组织毒中扩增出预期200bp的片断，而Pr,Pra,Prb与猪瘟Thiveral株和3株猪瘟野毒株均不反应，通过含毒量梯度试验，得出了RT-PCR可检测猪瘟病毒量的下限为200RID或200TCID50。     

RT-PCR检测菊花B病毒的研究

根据菊花B病毒（CVB）的外壳蛋白基因序列设计、合成引物,以感病组织5和健康组织总RNA为模板,进行cDNA合成和PCR扩增,结果从感病组织中扩增出与预期的776bp大小一致的目标片段,而健康组织无此扩增产物;将PCR产物插入pGEM-T载体克隆并测序,序列分析表明与CVB的相应序列同源性达到85％;将感病组织总RNA以10x梯度稀释成不同浓度,测出RT－PCR检测CVB的灵敏度为10^-4x;PCR产物克隆作为RT－PCR反应的阳性对照,解决了毒源保存和传播的问题,从而建立了CVB快速、灵敏、准确的RT－PCR鉴定和检测技术。     

应用 RT-PCR 法快速检测马铃薯卷叶病毒

根据马铃薯卷叶病毒的外壳蛋白基因序列,设计合成了一对寡核苷酸引物,从感染ＰＬＲＶ的马铃薯病叶组织中提取出病毒的ＲＮＡ,进行ｃＤＮＡ合成及ＰＣＲ扩增,得到一条长度约６２０ｂｐ的特异ＰＣＲ扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致。建立了快速灵敏简便的ＰＬＲＶ检测的新方法,其灵敏度要比ＰＬＲＶ的血清学检测方法高１０＾４倍,在基因水平上为ＰＬＲＶ的检测提供了更新手段,并在农业部植物检疫实验所马铃薯病毒检     

应用RT-PCR检测番茄上的CMV和ToMV

建立了广东番茄花叶病主要病原CMV和ToMV的RT-PCR检测技术。应用该技术对采集于广东番茄主要产区的病样本进行检测,结果表明：10个采样地点中均检测到CMV,仅2个点检测到ToMV;在所采集的49个病样本中,CMV和ToMV所占的比例分别为79．6％和12．2％,说明广东番茄花叶病毒原主要是CMV,其次是ToMV。     

犬瘟热、犬冠状病毒联合RT-PCR检测方法的建立及应用

用CDV、CCV特异性引物对同一样品中CDV和CCV RNA模板进行联合RT－PCR扩增，并对扩增条件进行了优化。结果同时得到了两条大小与试验设计完全相符的特异性扩增带，且不扩增犬细小病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒、轮状病毒的核酸。敏感性试验表明，该联合PCR能检测出10^-4倍稀释的CDV模板（10^6.6TCID50/0.1mL)和10^-3倍稀释的CCV模板（10^5.9TCID50/0.1mL)。通过对7份临床发病犬病料的检测，其阳性检出率高于电镜负染检查。初步应用表明，此法具有高度敏感、特异、准确、快速等特点，适用于兽医临床对CDV、CCV的检测和鉴别诊断。     

甘蔗黄叶病毒病早期快速RT-PCR诊断和鉴定

甘蔗黄叶病毒病（YLS）是一种由黄症病毒（Luteorirus）引起,随种蔗传带的新病害。利用由黄症病毒组特征片段克隆测序设计的特异性引物对YLSR462和YLSF111开发出一种可以早期快速检测无症甘蔗繁殖材料带毒情况的反转录多聚酶链式反应技术（RT-PCR）。对来自世界各地美国甘蔗主产区的140个甘蔗品种及育种材料进行了检测,黄症叶片样品RT-PCR阳性检出率为100%,而无症样品带毒率为55.17%。与DAS-ELIS相比,显症和无症样品的检测符合度分别为76.47%和56.24%,表明分子诊断较血清学方法灵敏。而单纯采用叶片糖分锤度单一指标诊断YLS是不可靠的。美国的主栽甘蔗品种和大部分育种材料（95.0%）对于YLS均表现感病或带毒。为引种和品种选育提供了参考依据。     

利用斑点杂交法和RT—PCR技术检测甘蔗花叶病毒

利用地高辛标记不同长度的ＤＮＡ探针通过斑点杂交法对甘蔗花叶病毒进行检测,结果表明,可检测出２００ｍｇ稀释度为１．１０＾４病叶中的病毒。但不同长度的探针表现出一定的差异,较长的探针显示出较高的灵敏度。根据克隆所得的病毒基因序列设计特异引物,利用反转录－聚合酶链式反应的方法进行检测,同样得到较好的检测效果,但灵敏度略低于杂交检测。     

水稻黑条矮缩病毒的RT-PCR检测

水稻黑条矮缩病毒(rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)病是一种以灰飞虱为主要介体进行传播的病毒病,主要侵染禾谷类作物和禾本科杂草[1 , 2 ].病株症状为浓绿矮缩,叶片僵直,不抽穗或穗小,叶背的叶脉和茎杆上有短条瘤状突起,该突起在发病初期呈腊白色,后变为黑褐色.发病田块一般减产10%～40%,重病田甚至颗粒无收[3 ～ 5].该病曾于20世纪60年代中期在我国华东诸省市不少地区广泛发生,此后20年发病面积逐年下降,但90年代以来,该病又迅速回升流行[6 ～ 8].该病毒属呼肠孤病毒科(Reoviruses)斐济病毒属(Fijivirus),有10条双链RNA[9].由于该病毒只能由特定的昆虫(以灰飞虱为主)带毒传播,在该病毒的科学研究和生产预测预报中,测定介体昆虫灰飞虱带毒率和水稻植株被感染率显得十分必要.本文根据该病毒的已知序列合成特异引物,建立了植株以及昆虫体内该病毒的RT-PCR检测法.     

小鼠肝炎病毒RT-PCR检测方法的研究

用4株小鼠肝炎病毒(MHV1,MHV3,A59,JHM)分别感染DBT细胞,收获病毒,提取病毒RNA。根据病毒基因的特异性保守序列设计引物,在最佳务件下进行RT—PCR,建立了RT—PCR检测方法,即两步法和一步法,分别扩增出600bp,375bp的特异性核酸片段,其中,一步法检测MHV更快速、简便。     

RT-PCR技术检测大豆花叶病毒的研究

利用聚合酶链式反应 (PCR)技术 ,体外扩增大豆花叶病毒 (SMV)的外壳蛋白基因 ,以建立检测SMV的新技术。从提纯的SMV病毒粒体中抽取RNA ,经反转录合成cDNA第一链 ,以此为模板 ,进行PCR扩增 ,组建了RT -PCR检测SMV的试剂盒。     

CTAB法用于染病烟草植株中烟草丛顶病毒RNA的提取

 CTAB法是一种广泛用于从染病植物中提取总核酸,并用于后续相关病原物PCR检测的核酸提取法,已普遍运用于DNA病毒、植原体、细菌、真菌侵染植物的总DNA提取和病原检测。本文尝试将CTAB法用于一种由RNA病毒（烟草丛顶病毒）引起的烟草丛顶病染病组织总核酸的提取,以总核酸进行烟草丛顶病毒的RT-PCR检测,并与常规RNA病毒核酸提取法——Trizol法作比较。结果表明CTAB法和Trizol法提取的核酸用于烟草丛顶病毒RT-PCR检测时,均能扩增到目的条带,检测结果一致。在对复合侵染材料进行检测时发现,CTAB法提取的染病植物组织总核酸既包括DNA也包含RNA,有利于对DNA和RNA病原物同时进行检测;CTAB法所用试剂较Trizol法便宜,毒性小,且提取的核酸量较多、保存时间较长。因此CTAB法是一种高效、简便、经济的从烟草丛顶病染病组织中提取烟草丛顶病毒RNA的方法。     

烟草丛顶病毒完整基因组上微卫星分布

为了提取并展示NCBI数据库中烟草丛顶病毒完整基因组(NC-004366.1)上微卫星分布特性,采用MATLAB软件和最优完全子图算法自编了计算机程序进行.结果表明,烟草丛顶病毒完整基因组上n-碱基组(n＝1-6)最大的重复出现次数随n增加而按指数函数减少.     

烟草丛顶病伴随RNA临沧分离物基因组全长序列测定和结构分析

[目的]对烟草丛顶病伴随RNA(TBTDaRNA)临沧分离物基因组全长序列进行测定,并对其进行结构分析。[方法]应用RT-PCR方法扩增烟草丛顶病伴随RNA临沧分离物的基因组,并进行全长序列的测定,同时对烟草丛顶病伴随RNA临沧分离物和龙陵分离物的基因组进行比较分析。[结果]烟草丛顶病伴随RNA临沧分离物和龙陵分离物的基因组全长序列一致性为95.4%;ORF1a编码产物的氨基酸序列一致性为93.1%;ORF1b编码产物的氨基酸序列一致性为98.3%;3’端非编码区的核苷酸序列一致性为95.5%。[结论]该研究为研究TBTDaRNA的分子变异奠定了基础。     

烟草丛顶病毒复制酶基因克隆及序列分析

烟草丛顶病是近年来在云南省西部的保山、大理等各大烟区频繁爆发流行的一类新的烟草病害。关于这类病害的病原 ,一直众说纷纭 ,有人认为这是一种植原体引起的“烟草丛枝病” ,有人认为这是一种病毒引起的病害。本课题组从 1 995年起对这类病害进行立项研究 ,并相继排除了植原体病原的可能 ,认为这应该是一类病毒或病毒类似物引起的病害。Ｍｏ等认为云南发生的这类烟草病害与津巴布韦发生的烟草丛顶病 (Ｔｏｂａｃｃｏｂｕｓｈｙｔｏｐｄｉｓ ｅａｓｅ)是同一种病害 ,并认为暂定为幽影病毒属(Ｕｍｂｒａｖｉｒｕｓ)的烟草丛顶病毒 (Ｔｏｂａ…     

黄瓜上烟草花叶病毒的RT-PCR检测

根据烟草花叶病毒TMV的外壳蛋白基因序列设计、合成引物,以感病组织和健康组织总RNA为模板进行cDNA合成和PCR扩增,对2002年采集的75份黄瓜病毒病样本进行了检测,结果从感病组织中扩增出与预期的425bp大小一致的目标片段而健康组织无此扩增产物;29份材料检测到TMV,检出率达38.67%。     

应用多重RT-PCR检测烟草上的TMV和CMV

根据烟草花叶病毒(TMV)复制酶蛋白和黄瓜花叶病毒(CMV)的外壳蛋白基因序列设计、合成引物,以感病组织和健康组织总RNA为模板,进行多重PCR反应。可以扩增出1.44 kb带和735 bp带,与预期结果完全一致。而健康对照则无任何扩增条带出现。对2005年从广东采集的18份检测样品进行检测,检测出TMV、CMV复合侵染的样本占总样品的44.44%。     

RT-PCR方法检测烟草环斑病毒的研究

 根据烟草环斑病毒（TRSV）外壳蛋白基因非编序列设计的引物P1,P2,用感病及健康组织总RNA为模板,进行cDNA 合成和PCR试验,感病组织中扩增出了600 bp的目的片段,而健康组织中无此扩增带。摸索各项实验条件,建立了RT-PCR检测烟草环斑病毒（TRSV）的方法。     

胶体金免疫层析试纸结合RT-PCR法快速检测烟草环斑病毒

利用烟草环斑病毒胶体金免疫层析检测试纸条,对烟草环斑病毒3个分离物进行了快速检测。结果表明,试纸条在10min内,可特异性检出烟草环斑病毒的3个分离物,对番茄环斑病毒、南芥菜花叶病毒、番茄黑环病毒和健康叶片无反应。剪下试纸条上显示的检测带,进行RT—PCR,能扩增到与预期大小相同的DNA条带。试纸条检测烟草环斑病毒粗提纯液,检测灵敏度在1μg·mL^-1,试纸条检测烟草环斑病毒的病汁液,检测灵敏度在10^-3（W／V）,试纸条检测灵敏度与DAS—ELISA方法灵敏度基本相同。     

一步法RT-PCR检测烟草环斑病毒试剂盒的研制与应用

根据烟草环斑病毒基因组序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术研制成一步法检测该病毒的试剂盒,并建立了操作程序。对试剂盒扩增到的预期产物进行测序验证,产物序列与目的序列间的同源性为97.8%,表明该试剂盒的准确性较高。试验结果还表明,该试剂盒在常温、4℃和-20℃下可分别保存2d、7d和60d;灵敏度是DAS-ELISA的100倍;质量控制试验结果一致,具有较高的重复性。     

攀枝花烟草病毒病检测与防治对策

采用酶联免疫反应检测技术(ELISA)对攀枝花烟区烟草病毒病发生情况进行检测,分析了该次病毒病发生原因,并有针对性地提出了综合防治措施。结果表明,从74份采集样品中检出烟草普通花叶病毒病(TMV)53份,检出率71.62%;黄瓜花叶病毒病(CMV)41份,检出率55.41%;马铃薯Y病毒病(PVY)37份,检出率50.00%;番茄花叶病毒病(ToMV)8份,检出率10.81%。74份检测样品中受2种或2种以上病毒复合侵染的样片有68份,检出比91.89%。该次病毒病发生原因主要包括气候因素、品种因素、病原因素和栽培管理因素;综合防治措施包括控制传染源、切断传播途径、选种抗性品种、加强田间管理和药剂防治。