甲型H1N1流感病毒血凝素基因的原核表达及用于胶体金检测方法的研究

根据GenBank公布的甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因序列,合成HA全长基因,构建原核表达载体pET-30 Xa/LIC-HA.阳性质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.对表达蛋白进行SDS-PAGE和Western blot检测的结果表明,HA基因获得表达,产物具有免疫学活性,分子质量约...     

抗猪甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备与特性分析

本研究旨在制备猪甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)蛋白的特异性单克隆抗体.采用RT-PCR方法扩增猪甲型H1N1流感病毒的HA基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGS上,获得重组质粒pCAGGS-HA,转染293T细胞,通过间接免疫荧光(IFA)检测表明HA蛋白在293T细胞中得到表达.将pCAGGS-HA以100 μg·只-1剂量免疫5周龄BALB/c小鼠,获得4株稳定分泌抗HA蛋白单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株,分别命名为11G7、3C10、3G3和2B11.其中11G7诱导小鼠产生的腹水HI效价为14log2,中和效价为1:8 192,HI试验结果进一步表明11G7只与甲型H1N1流感病毒发生反应,而不与其他H1N1、H1N2、H3N2、H5N1及H9N2亚型流感病毒反应.该MAb的制备将为建立猪甲型H1N1流感病毒与传统亚型SIV的鉴别诊断方法奠定基础.     

H3N2犬流感病毒M1蛋白的原核表达及鉴定

为制备犬流感病毒(H3N2) M1蛋白纯品,针对M1基因序列设计引物,用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因片段,扩增产物克隆至表达载体pET-SUMO中并转化至宿主菌BL21(DE3),诱导表达目的蛋白,探索纯化工艺,制备目的蛋白,并用Western blot检测纯化的M1目的蛋白。通过PCR成功扩增出大小为771 bp的M1基因,成功构建p ET-SUMO-M1表达载体,表达的融合蛋白相对分子量为41 kD,主要以可溶形式表达,纯化后获得蛋白纯品,Western blot检测显示用M1蛋白(28 k D)免疫小鼠制备的多抗能与制备的蛋白纯品发生特异性反应,从而证明蛋白纯品为M1目的蛋白。试验制备出的M1蛋白纯品可为进一步制备通用型抗犬流感病毒抗体提供纯品抗原。     

H3N2亚型猪流感病毒HA和HA1蛋白的原核表达

为原核表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)的HA和HA1蛋白,通过RT-PCR方法获得SIV的HA和HA1基因,克隆至原核表达载体pMAL-c5X,并转化至原核表达菌Rosetta(DE3)中,表达菌经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示,成功表达了H3亚型SIV的HA和HA1蛋白,目的蛋白均以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在,并与H3N2亚型SIV的HA单克隆抗体反应,说明HA和HA1蛋白具有良好的反应原性。     

甲型H1N1流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的初步建立

建立甲型H1N1流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法,通过优化IPTG浓度和诱导时间确定HA融合蛋白的最佳表达条件,并进行Western bloc和血凝试验鉴定.用纯化蛋白制备单克隆抗体,建立检测甲型H1N1流感病毒的双抗体夹心ELISA检测方法,对其交叉反应、符合率进行验证.结果表明,HA蛋白在BL21 (DE3)中...     

密码子优化的甲型H1N1流感病毒HA基因DNA疫苗在小鼠体内免疫保护效力研究

为了提高甲型H1N1流感病毒HA基因DNA疫苗的免疫原性,本研究将流感病毒rPan09(HA和NA来自A/California/04/09,其余6个片段来自PR8的重组病毒)的HA基因通过人工合成的方法将其密码子优化为哺乳动物体内偏嗜性密码子opti-HA,同未优化的rPan09的HA基因分别与真核表达载体pCAGGS连接构成重组质粒pCA-optiHA和pCA-HA转染293T细胞,48 h后采用间接免疫荧光的方法检测HA基因的体外表达情况,结果显示重组质粒pCA-optiHA的蛋白表达量明显高于pCA-HA。为评价这两种重组质粒的免疫及保护效力,选取6~8周龄雌性BALB/c小鼠,将质粒pCA-HA、pCA-optiHA以100μg/只的剂量,进行后腿肌肉多点注射,同时设立空载体pCAGGS对照,共免疫3次,每次间隔2周。结果表明DNA疫苗pCA-optiHA可显著提高小鼠的体液免疫和细胞免疫应答水平。三免2周后用107.45EID50的rPan09采用滴鼻方式进行攻毒,用Real-time PCR及制作肺组织石蜡切片检测DNA疫苗的保护效力。结果表明,pCA-optiHA免疫组的保护效力明显高于pCA-HA免疫组。本研究为进一步研究和设计有效的甲型流感病毒DNA疫苗奠定了基础。     

甲型H1N1流感病毒实验室生物风险评估

根据目前掌握的资料,从生物学特性、流行特点、临床表现以及实验室活动等方面对甲型H1N1流感病毒做了初步的风险评估,以期为从事甲型H1N1病毒有关操作的实验室做好相关的风险评估及生物安全防护工作提供依据。     

甲型H1N1流感病毒及其疫苗研究热点

2009年4月初,北美爆发一种新型甲型(H1N1)流感病毒,并通过各种途径迅速传播,引起了全球极大的恐慌。文章介绍了历史上历次甲型流感大流行,流感的分类与生物学特性,甲型H1N1流感的病原学特点和分子特征,甲型H1N1流感的传染源、传染性、传染途径和传染方式,甲型H1N1流感的临床特征和严重危害。最后指出疫苗是最经济有效的预防流感的手段,国内生产疫苗主要使用鸡胚作为生产基质,筛选出高丰度的流感病毒适应性细胞将成为研究的热点。     

甲型H1N1流感病毒NS1蛋白核仁定位的研究

为研究2009年甲型H1N1流感病毒的NS1蛋白的核仁定位情况,采用RT-PCR对其NS1基因进行了扩增,将其克隆至PEGX-KG载体,构建重组质粒KG-NS1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达重组蛋白.然后采用GST柱亲和层析方法纯化NS1重组蛋白,免疫家兔来制备多抗,Western blot检测抗体.通过间接免疫荧光对表达不同长度NS1 (NS1-219、NS1-230、NS1-237)的3种重组流感病毒进行了核仁定位的研究,3种重组毒的NS1蛋白存在于细胞核和细胞质,但都不能定位于核仁,说明NS1蛋白的截短与否并不影响其核仁定位,其生物学意义有待于进一步研究.     

H3N2亚型犬流感病毒HA1基因的原核表达及抗原性分析

为原核表达H3N2亚型犬流感病毒(CIV)HA1蛋白,本研究利用特异性引物扩增CIV H3分离株的HA1基因,将其克隆到pMD18-T载体后进行序列测定。再将其亚克隆于pET-32a(+)中构建重组表达质粒pET-HA1。将该质粒转化于大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析,表达的重组蛋白约为58 ku。纯化的HA1蛋白经western blot和Dot-ELISA鉴定表明,表达的重组HA1蛋白可以与H3N2亚型CIV阳性血清发生特异性反应。     

H5N1亚型禽流感基质蛋白M1基因的原核表达和纯化

为获得纯度大于90%的M1蛋白,构建重组质粒PET-22b-M1,将正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测分析表达形式和表达量,并经Ni2+柱亲和层析与柱层析纯化表达蛋白。结果表明:试验成功构建了pET-22b-M1表达载体;IPTG诱导后高效表达出分子质量约为28 ku的M1融合蛋白;纯化的目的蛋白在SDS-PAGE图谱上呈单一条带,且获得的M1蛋白纯度达95.4%。     

Prokaryotic Expression and Antigenic Analysis of H3N2 Swine Influenza Virus HA1 and HA2 Genes

Hemagglutinin protein plays an important role in disease prevention and treatment of the swine influenza virus (SIV).In order to clone and express subtype H3N2 SIV A/swine/Henan/1/2010 (H3N2) HA1 and HA2 genes with chicken embryo allantoic fluid containing the H3N2 SIV after extraction of RNA.The HA1 gene and HA2 gene were amplified from the total RNA using RT-PCR and they were inserted into prokaryotic expression vector pET-28a (+) to construct recombinant expression vector.Then the vector was transformed and expressed in E.coli BL21 (DE3) pLyS.Then the bacteria were induced by IPTG and their lysates were analyzed by SDS-PAGE and Western blotting,respectively.The monoclonal antibody 1C10,which was specific to HA protein,was used as primary antibody in Western blotting analysis.It was found that the expressed recombinant HA1 protein was 34.8 ku and recombinant HA2 protein was 23.2 ku analyzed by SDS-PAGE.As demonstrated by Western blotting,this HA1 expressed products showed the capacity of reacting with monoclonal antibody 1C10.All the results suggested that the expressed HA1 and HA2 proteins of H3N2 influenza virus would be very helpful in the development of rapid diagnosis method and vaccine development,which would facilitate further study on the function of HA at the same time.     

H3N2亚型猪流感病毒HA1、HA2基因的原核表达及抗原性分析

血凝素（hemagglutinin,HA）蛋白是猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）的一个重要蛋白,在疾病预防和治疗中具有重要作用。本试验旨在克隆和表达H3N2亚型猪流感病毒A/swine/Henan/1/2010（H3N2）的HA1和HA2基因。用含有H3N2亚型SIV的鸡胚尿囊液提取RNA,RT-PCR扩增后将目的基因定向克隆到pET-28a（+）原核表达载体上,并将其转入宿主菌BL21（DE3）pLyS进行表达,IPTG诱导后经SDS-PAGE检测并用该病毒重组HA蛋白制备的特异性单克隆抗体1C10作为一抗对两种蛋白进行Western blotting分析。SDS-PAGE结果显示,得到HA1和HA2大小分别为34.8、23.2 ku的重组蛋白,Western blotting结果表明,HA1蛋白与1C10单克隆抗体具有良好的反应原性,且1C10单克隆抗体表位在HA1蛋白上。本试验结果为进一步研究血凝素蛋白的结构和功能,以及建立快速诊断方法和基因工程疫苗提供材料。     

禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)HA基因序列分析

采用RT_PCR技术,以A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)RNA为模板,扩增了1.73kb 的HA 全基因cDNA。将HAcDNA克隆后进行了序列测定,测序结果表明所扩增的1728 个核苷酸片段包含了完整的HA基因的开放阅读框架和上下游引物序列、蛋白质合成的起始密码子和终止密码子。核苷酸序列比较分析结果表明:A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1) 与A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)有11 个核苷酸差异,同源率99.4% ;与A/HongKong/156/97(H5N1) 有25 个核苷酸差异,同源率98.6 % ;与A/Chicken/HongKong/258/97 (H5N1) 有30 个核苷酸差异,同源率98.3% ;它们的氨基酸序列同源率依次分别为99 .2 % 、98.6% 和98.1% 。受体结合位点的氨基酸序列完全一致;HA裂解位点氨基酸序列也完全一致,各有5 个碱性氨基酸插入。这说明上述4 个流感病毒分离株可能来自同一个祖先,具有相同的毒力和相似的生物学特性。     

H5N1亚型禽流感病毒RNA聚合酶PB1_P亚基片段的表达、纯化和结晶

 根据GenBank中H5N1亚型禽流感病毒RNA聚合酶PB1基因序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增H5N1亚型禽流感病毒的PB1_P基因,克隆到原核表达载体pET-28a载体中,经PCR、酶切和测序分析后,鉴定出阳性重组子。将阳性质粒pET-28a/PB1_P转化大肠杆菌BL21（DE3）,用0.5 mol/L IPTG,在37 ℃诱导表达4 h,经SDS PAGE和Western blot检测,获得重组蛋白PB1_P表达。并经Ni-NTA柱亲和层析与柱层析纯化表达蛋白,采用悬滴气相扩散法对纯化蛋白进行结晶。结果成功构建pET-28a/PB1_P重组质粒,SDS-PAGE结果显示重组蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,Western-blot证明表达的融合蛋白具有良好的免疫原性,经蛋白纯化、初筛结晶,得到PB1_P重组蛋白初筛晶体,为深入研究流感病毒聚合酶的生物学功能、开发新型H5N1亚型禽流感病毒检测试剂盒奠定了良好的基础。     

H1N1猪流感病毒血凝素蛋白抗原表位的筛选及其抗原性分析

本研究旨在对H1N1猪流感病毒血凝素蛋白抗原分子的模拟表位进行分离鉴定并分析其抗原性。用抗H1N1猪流感病毒血凝素蛋白小鼠血清IgG对噬菌体随机12肽库进行筛选,3轮亲和筛选后,特异性噬菌体得到了有效富集;对随机挑选的47个噬菌体克隆用ELISA进行鉴定,其中40个为阳性;对40个阳性克隆测序得到3种不同氨基酸序列;用Western blotting对获得的3个不同序列的噬菌体克隆进行抗原性分析,显示这3种噬菌体插入短肽能和H1N1猪流感病毒感染小鼠血清特异性结合。结果表明,本试验获得了3种H1N1猪流感病毒血凝素蛋白模拟抗原表位,它们都具有明显的抗原性,为H1N1猪流感病毒的疫苗研究和诊断奠定了基础。     

鹅源H5N1亚型禽流感病毒株HA基因的克隆与序列分析

本研究对1株鹅源H5N1亚型禽流感病毒血凝素（HA）基因进行了扩增、克隆及序列测定。结果表明：所扩增的片段长1707bp，包含完整的开放阅读框架，编码568个氨基酸。该毒株裂解位点的氨基酸序列为RRRKKR，具有高致病性的分子特征；该毒株有6个潜在糖基化位点；受体结合位点的氨基酸分别为YWIHELY，其左侧壁氨基酸为SGVSSA，右侧壁为NGQSGR。该毒株与国内外一些参考毒株的HA基因序列比较，核苷酸同源率为76.8％～98．1％，氨基酸同源率为85．7％～97．4％，属于欧亚种系。