青海省绵羊弓形虫病的ELISA诊断方法的建立及血清学调查

龚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生的重要机会致病性原虫,可寄生于人和动物的除红细胞外的有核细胞内,引起弓形虫病(Toxoplasmosis)[1].猫及猫科动物是惟一可从粪便排出弓形虫卵囊的动物,猫在弓形虫传播给绵羊和其他动物中起着重要作用.     

弓形虫感染对小鼠睾丸间质细胞睾酮分泌的影响及机制研究

为探究弓形虫RH株速殖子体外感染对小鼠睾丸间质细胞睾酮分泌的影响,构建了弓形虫与小鼠睾丸间质细胞共培养试验模型。将纯化后的弓形虫虫体与细胞按照0∶1、1∶5、1∶1、5∶1、10∶1、20∶1的比例共培养6 h,筛选最佳的弓形虫和细胞共培养比例。在弓形虫与细胞比例为20∶1条件下,共培养3 h、6 h、9 h和12 h,筛选最佳共培养时间。同时,使用瑞氏-吉姆萨染色液对细胞进行染色,观察共培养情况下细胞状态。培养结束,ELISA检测细胞上清的睾酮浓度,Western blot检测细胞内睾酮分泌相关蛋白StAR、CYP11A1、3β-HSD和CYP17A1的表达水平。结果表明,弓形虫与细胞共培养6 h,当弓形虫与细胞比例高于5∶1时,睾酮分泌量显著增加(P<0.05)。弓形虫与细胞比例为20∶1时,睾酮分泌量随培养时间的延长而增加,且感染组明显高于对照组(P<0.05)。染色结果发现,弓形虫1 h内即可进入MLTC-1细胞,12 h细胞内出现大量空泡,60 h左右细胞大量破裂。Western blot结果显示,共培养12 h时,感染组CYP11A1、3β-HSD和CYP17A...     

桦褐孔菌粗多糖对急性感染弓形虫小鼠的存活时间及SOD的影响

为探讨桦褐孔菌粗多糖(IOCP)对急性感染弓形虫小鼠的存活时间及血清、心、肝和肺中超氧化物歧化酶(SOD)含量的影响。采用昆明系小鼠80只,随机分为IOCP组、阳性对照组(蒿甲醚)、空白对照组和阴性对照组,每组20只。用RH株弓形虫建立小鼠病理模型,观察小鼠治疗后的存活时间,以及血清、心、肝和肺中SOD含量。结果:IOCP及阳性药物均可延长感染弓形虫小鼠的存活时间;可明显提高小鼠脏器SOD活性;与阳性对照组比较差异显著(P<0.05)。结论:IOCP能延长感染弓形虫小鼠的存活时间,并具有抗氧化损伤作用。     

IBDV不同野毒株鸡胚传代及各变异代次回归鸡后的致病性

对分离于河南省的YX08、YX12、YB02等3个传染性法氏囊病毒（IBDV）野毒株进行了鸡胚适应性培育,对各代病毒进行了生物学试验,并对其VP2高变区基因进行了RT-PCR扩增和序列分析。结果显示,各毒株随传代次数的增加,与经典毒株Cu-1及弱毒株P2的同源性有所增高;各毒株的变异代次和变异位点不尽相同,但232、233、234及253位氨基酸的密码子在传代过程中是易变密码子;各毒株对鸡胚的半数致死量随着传代均降低了2～3个稀释度;鸡胚中病毒的滴度在10代以后较传代初期均有提高。接种供试雏鸡后,各毒株的鸡胚毒出现的临床症状均较其法氏囊毒晚24～36 h,致死率有所下降,但各毒株鸡胚毒与其囊毒病理变化相似。     

不同断奶时间及代乳料对放牧羔羊生长的影响

试验设计3个不同断奶时间(30 d,45 d,60 d)和3个不同营养水平的代乳料,研究这两个因素对放牧条件下甘肃高山细毛羊羔羊生长性能的影响。结果表明:在45 d断奶时,饲喂代乳料Ⅲ的羔羊在60 d时体重比对照组高4.35 kg,差异极显著(P<0.01),该组平均每只羔羊比对照组的经济效益高27.58元;60 d断奶时,饲喂代乳料Ⅲ的羔羊在75 d时体重比对照组高5.26 kg,差异极显著(P<0.01),该组平均每只羔羊的经济效益比对照组高29.51元。     

高致病性PRRSV HuN4株不同代次病毒对仔猪胸腺损伤的研究

为研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)不同致弱代次病毒对断奶仔猪胸腺的损伤,本研究选用HP-PRRSV HuN4株在Marc-145细胞中传代致弱的F5、F15、F23、F30代及弱毒疫苗HuN4 F112代分别接种30日龄的PRRSV抗原及抗体阴性健康断奶仔猪。实验结果显示:HuN4 F30感染组胸腺的眼观病变、胸腺重量、病理组织学变化、病毒载量及胸腺细胞凋亡比例均与F23感染组有显著差别(p<0.05)。本实验结果表明,HuN4 F23代仍然能够引起仔猪胸腺萎缩并导致机体免疫抑制,而F30代已不能引起断奶仔猪胸腺萎缩现象。因此,HP-PRRSV HuN4 F23、F30代可以作为研究HP-PRRSV HuN4致胸腺萎缩的分子机制的关键代次。本研究为进一步研究HP-PRRSV感染诱导仔猪胸腺萎缩和胸腺细胞凋亡的分子机制奠定了基础。     

末次刈割时间对苜蓿根颈抗氧化系统及抗寒性的影响

为探究不同末次刈割时间对科尔沁沙地生境下紫花苜蓿抗寒性的影响及其与低温冷冻胁迫下抗氧化系统变化的关系,以‘公农1号’紫花苜蓿为材料,于翌年秋季进行不同末次刈割时间处理,越冬前期挖取越冬器官并进行-10,-15,-20,-25和-30℃低温冷冻胁迫处理,以低温冷藏(4℃)为对照,测定紫花苜蓿根颈的相对电导率及丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性的变化,利用相对电导率根据Logistic回归方程计算半致死温度,并对半致死温度与抗氧化特性进行相关分析。结果表明,未刈割和8月25日、9月5日、9月15日、9月25日、10月5日、10月15日、10月25日、11月5日末次刈割的苜蓿半致死温度分别为-18.03、-17.61、-17.03、-16.59、-15.80、-15.82、-16.83、-16.34、-17.12℃;紫花苜蓿根颈的半致死温度与-10℃低温冷冻胁迫条件下的POD活性呈显著负相关(P<0.05),与-20℃低温冷冻胁迫条件下的CAT活性呈显著负相关(P<0.05),与-15、-20、-25℃低温冷冻胁迫条件下...     

两株H4N3禽流感病毒全基因组序列分析及对小鼠的致病性研究

2009年在我国南方活禽交易市场进行流行病学调查时,从鸭体内分离到2株H4N3亚型禽流感病毒(AIV),DK/FJ/S1419/09(H4N3)(FJ/419/2009)和DK/HUN/S1010/09(H4N3)(HuN/010/2009)。为了解这2株H4N3亚型AIV的生物学特性,本研究对其进行全基因组分析及对小鼠致病性研究。结果显示:其HA基因来源于近两年流行的H4亚型病毒株,NA基因来源于其它亚型病毒株。内部基因来源较复杂,与FJ/419/2009内部基因同源性最高的病毒株均来自国内H5、H6等亚型分离株,但与HuN/010/2009同源的内部基因则差异较大,与PA、M和NS同源性最高的病毒株分别为A/wild/duck/Korea/UP122/2007(H1N1),A/muscovy/duck/Thailand/CU-LM1983/2009(H4N6)and A/avian/Japan 8KI0068/2008(H3N6)。用106EID50病毒剂量感染6周龄BALB/c小鼠,结果显示试验组小鼠感染后第3 d采脏器样品,仅在鼻甲和肺部能检测到病毒存在。以上数据表明,尽管这2株H4N3特殊亚型组合病毒来源复杂,但对小鼠的致病性较低。     

一株鸭源H11N3亚型禽流感病毒的遗传进化分析及对小鼠的致病性研究

为了解H11N3亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性,本研究对2020年在福州市某活禽市场鸭中分离的一株H11N3亚型AIV进行了全基因组测序、遗传进化分析和对BALB/c小鼠的致病性试验。测序结果显示,分离株HA裂解位点为PAIASR↓GLF,符合低致病性AIV分子特征;HA蛋白²²⁶L和²²⁸S突变显示病毒具有结合人源受体(SAα-2,6 Gal)的特征性氨基酸。PB1、PA、NP和M1蛋白均出现对哺乳动物致病性增强的特征性氨基酸。遗传进化分析显示,H11N3 AIV的8个基因节段均属于欧亚分支,其HA基因与A/duck/Fujian/SD061/2017 (H11N3)株HA基因序列相似性最高,而NA基因与A/EN/Fujian/02754/2016 (H3N3)株NA基因序列相似性最高。该病毒内部基因分别与浙江、福建和云南等地鸭和鸡体内分离的H7N9、H7N7、H1N2、H7N2、H7N7和H9N6等亚型AIV相关基因高度同源。小鼠致病性试验结果显示,该病毒未经适应即可在小鼠鼻甲和肺脏中高效复制,表明该病毒株具备感染哺乳动物的能力。上...     

不同硒源对育肥初期徐淮白山羊抗氧化能力、表观消化率及生长性能影响的研究撤回

旨在研究饲粮中添加不同硒源对育肥初期徐淮白山羊抗氧化能力、营养物质表观消化率及生长性能的影响。选取断奶健康徐淮白山羊50只,随机分为5组,每组2个重复,每个重复5只,对照组(C组)饲喂基础饲粮,试验组饲粮中分别添加以硒含量计算的0.3 mg/kg亚硒酸钠(0.3 SS组)、0.3 mg/kg酵母硒(0.3 SY组)、0.3 mg/kg硒代蛋氨酸(0.3 SM组)和0.5 mg/kg硒代蛋氨酸(0.5 SM组),预饲期15 d,试验期60 d。结果显示：1)血液抗氧化指标GSH-Px、T-AOC和SOD活性在0.3 SY和0.3 SM组均显著高于C组或0.3 SS组(P<0.05);0.3 SM组MDA含量最低,且显著低于C组或0.3 SS组(P<0.05)。2)各试验组CP、EE、NDF和ADF表观消化率均显著高于C组(P<0.05);0.3 SM组CP、NDF、ADF的表观消化率显著高于0.3 SY组(P<0.05);与0.3 SM组相比,0.5 SM组随着硒代蛋氨酸浓度的增加营养物质表观消化率有所降低。3)平均日增重0.3 SY组显著高于C组或0.3 SS组...     

弓形虫胚层发育相关蛋白的原核表达及免疫原性研究

试验旨在研究弓形虫胚层发育相关蛋白（TgERP）的免疫原性,以弓形虫RH株的基因组DNA为模板,扩增TgERP基因,将其连接于表达载体pET-30a(+)后,转化至Escherichia coli BL21（DE3）感受态细胞进行IPTG诱导表达,应用Western blotting对重组蛋白的反应原性进行分析,并用纯化后的TgERP蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。结果显示,在37 ℃条件下用1.0 mmol/L IPTG诱导6 h表达可溶性TgERP蛋白的量最大。SDS-PAGE结果显示,目的蛋白分子质量为16.7 ku,以可溶形式表达,纯化后蛋白条带单一。经Western blotting分析,TgERP蛋白有较好的反应原性;制备的多克隆抗体效价较高,可达1∶51200,表明该蛋白具有较好免疫原性。提示,TgERP蛋白可作为血清学诊断方法的候选抗原和弓形虫病疫苗的候选分子,为建立弓形虫新型诊断方法和研制新型弓形虫疫苗奠定了基础。     

屠宰羊弓形虫感染情况调查

为了保障羊肉制品的生物安全,对屠宰羊进行弓形虫感染情况调查以及对羊肉进行弓形虫检测。采用间接血凝试验,对677份屠宰羊的血清进行了弓形虫抗体检测。结果显示,弓形虫抗体阳性有47份,阳性率为6.9%。     

A Brief History and Overview of Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii was discovered by scientists working in North Africa and Brazil around 100 years ago. The parasite has since been found to be capable of infecting all warm‐blooded animals including humans making it one of the most successful parasitic organisms worldwide. The pathogenic potential of T. gondii was recognized in the 1920s and 1930s, in congenitally infected children presenting with the classic triad of symptoms, namely hydrocephalus, retinochoroiditis and encephalitis. In addition, around the same time T. gondii parasites were found to be associated with severe intraocular inflammation. In the 1980s, T. gondii emerged as a major cause of death in patients with acquired immunodeficiency syndrome, illustrating the importance of the immune system in controlling T. gondii infection. T. gondii was reported as a major cause of abortion in sheep in New Zealand in the 1950s, which raised questions about potential new transmission routes for the parasite. The discovery of the cat as the definitive host in the 1960s was a very important finding as it helped to complete our understanding of the parasite’s life cycle, and the oocyst stage of T. gondii shed in the faeces of infected cats was found to be an important source of infection for many intermediate hosts and helped to explain infection in herbivorous animals and people with a vegetarian diet. In addition, this stage of the parasite was very robust and could survive in the environment, depending on the climatic conditions, for up to 12–18 months. Knowledge of the parasite’s lifecycle, transmission routes, risk groups and host immune responses has helped in the development of strategies to control the disease, reduce transmission of the parasite and limit environmental contamination.     

Keratoconjunctivitis associated with Toxoplasma gondii in a dog

A 12-year-old Pug presented with a 3-mm corneal mass OD. The dog was currently being treated for keratoconjunctivitis sicca (KCS) and pigmentary keratitis OU. A superficial keratectomy followed by cryotherapy was performed OD. A histopathologic diagnosis of epithelial dysplasia and suppurative keratitis was made and the lesion resolved. Two months later, a yellow/tan conjunctival mass, diffuse chemosis and conjunctival thickening was discovered OD. Necrotizing conjunctivitis with protozoal parasites was diagnosed with histopathology. Complete blood count and a serum biochemistry panel were normal. Neospora caninum and Toxoplasma gondii titers were negative. The conjunctivitis resolved after a 6-week course of oral clindamycin. Two months later, the patient presented with a similar conjunctival mass OS. Toxoplasma gondii was confirmed as the etiologic agent with immunohistochemical staining. Repeat T. gondii titers were negative. Oral clindamycin was re-instituted. The corneal biopsy was re-reviewed and protozoal organisms were discovered. Three months later, a recurrence was suspected and oral ponazuril was initiated for 28 days. There has been no evidence of recurrence since this treatment. Ocular toxoplasmosis is rare in the dog but reports have included episcleritis, scleritis, retinitis, anterior uveitis, ciliary epithelium hyperplasia, optic neuritis and polymyositis. To our knowledge, this is the first confirmed report of toxoplasmosis causing only corneal and conjunctival disease in the dog. We hypothesize that these localized lesions may be associated with topical immunomodulating therapy for KCS. Toxoplasmosis should be considered as a differential for canine conjunctivitis and corneal disease and has the potential to manifest in one or both eyes.     

弓形虫Real-time PCR检测方法的建立和初步应用

根据已发表的弓形虫529 bp高拷贝序列,设计特异性引物和探针,建立TaqMan探针法的实时荧光定量PCR检测方法。将该方法用于360份临床样本的检测,并与常规PCR和环介导等温扩增(LAMP)技术进行对比分析。结果表明:Real-time PCR检测的阳性率(11.11%)高于LAMP(7.5%)和常规PCR(3.61%)。采用本实验室建立的Real-time PCR,对收集于不同地区4种动物的750份临床样本检测发现,不同种类动物血液样本中均可检测到弓形虫感染,其中羊的感染率最高(17.8%),猪次之(4.22%),牛较低(1.98%),犬最低(1.37%)。     

刚地弓形虫GRA3基因的克隆与表达

采用PCR方法扩增弓形虫GRA3基因,将扩增产物与pMD18-T Simple载体连接,重组质粒经PCR、双酶切鉴定后测序;构建pGEX-4T-1／GRA3表达载体,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western blot分析。结果显示,克隆的GRA3基因片段长687bp,含有1个669bp的开放阅读框,编码222个氨基酸,与GenBank中UK株（AF414079）的同源性为99．8％;表达的融合蛋白为50Ku,能被弓形虫阳性血清识别;表明该融合蛋白具有较好的免疫反应活性。     

不同中药方剂对弓形虫感染小鼠脾细胞分泌 IL-2活性的影响

通过观察不同方剂对小鼠感染弓形虫后脾 IL-2含量的影响,确定对弓形虫病治疗效果最佳的复方中药。将昆明系小鼠随机分为中药复方方剂组（A、B、C 组）、复方 SMZ 组（D 组）、模型组（E 组）和对照组（F 组）。用 RH 株弓形虫速殖子腹腔感染小鼠,2 h 后灌胃给药,其中 A、B、C 3个组每只每次0．5 mL 自拟弓形虫汤剂;D 组每只每次0．5 mL 复方 SMZ 混悬液300 mg／（kg· d－1）,疗程15 d。采用双抗夹心ELISA 法,观察不同方剂对小鼠脾细胞 IL-2含量的影响,并对照不同方剂之间的差异,采用 F 检验和 q 检验进行统计分析。结果表明,A、B、C 组和 D 组 IL-2活性水平均随着时间延长而逐渐升高;A、C、D 组与 F组有显著性差异;B 组 IL-2水平活性保持了较高值,与 E 组差异极显著。说明3种自拟中药复方方剂均能显著提高弓形虫感染小鼠脾细胞 IL-2的含量,增强小鼠免疫功能,其中复方二提高最显著,对 IL-2活性影响最大。     

细胞渗透肽TAT与3种弓形虫抗原的融合重组表达

为了探索新型弓形虫疫苗的传递系统,本试验分别构建了细胞渗透肽反式转录激活因子(TAT)与3种弓形虫抗原和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的重组质粒,即pET28a-TAT-EGFP,pET28a-TAT-SAG1,pET28a-TAT-GRA4和pET28a-TAT-AMA1质粒。重组质粒被转化到大肠杆菌中并通过IPTG诱导,成功进行了融合表达,表达产物采用Ni-NTA树脂进行纯化,然后进行SDS-PAGE分析。结果得到31 ku的TAT-EGFP融合蛋白、34 ku的TAT-SAG1融合蛋白、38 ku的TAT-GRA4融合蛋白和62 ku的TAT-AMA1融合蛋白,经过Western blotting分析,感染弓形虫的小鼠血清可特异性地识别融合TAT的SAG1、GRA4蛋白和微弱地识别TAT-AMA1蛋白。     

弓形虫致密颗粒蛋白6（GRA6）的研究进展

致密颗粒是由弓形虫致密颗粒细胞器分泌的一类具有免疫活性的蛋白质,它们在弓形虫的入侵,虫体在宿主细胞内的存活和繁殖方面起着重要作用。本文就致密颗粒蛋白6的分子结构、在虫体入侵中的作用、虫体基因分型以及在弓形虫病诊断和疫苗研制等方面的研究进展作一简要综述。     

弓形虫环介导等温扩增快速检测方法的建立

为了建立弓形虫的快速检测方法,本研究建立了一种灵敏、特异、快速的分子生物学检测方法——环介导等温扩增技术(LAMP)。用10倍系列稀释的DNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试,同时通过对扩增产物做内切酶验证;为证明LAMP技术的特异性,对新孢子虫、附红细胞体、瑟氏泰勒虫等病原体进行检测。结果显示:利用LAMP技术成功检测到弓形虫基因区,此方法的灵敏度可达到能检测5个拷贝DNA分子水平,酶切分析结果正确,并且特异性强,对新孢子虫、附红细胞体、瑟氏泰勒虫等病原体检测均为阴性。说明LAMP技术可应用于弓形虫的快速检测。