牡丹开花调控转录因子基因PsCOL4的克隆、表达与系统进化分析

采用RT-PCR 方法从‘紫罗兰’牡丹（Paeonia suffruticosa‘Ziluolan’）花芽中克隆得到1个重要开花调控转录因子基因CONSTANS-like,其cDNA 全长1 125 bp,编码373 个氨基酸。序列比对和结构域分析表明,此蛋白包含两个B-box 型锌指结构和1 个CCT 结构域,与拟南芥的AtCOL4 最为相似,将其命名为PsCOL4,GenBank 登录号为KF113358。系统进化树分析表明,PsCOL4 与葡萄编码的VvCOL4的亲缘关系最近,属于第1 群组CO 类似基因。实时定量PCR 表明,PsCOL4 在不同组织器官中均有表达,其中茎和叶中的表达量最高,根中最低。在花芽不同发育时期,PsCOL4 的表达呈现递减趋势。不同光周期条件下,PsCOL4 的表达稍有不同,短日照条件下在叶中的表达有所增加,茎中稍有减少。     

牡丹切花ERF转录因子基因的分离与表达分析

利用已获得的‘洛阳红’牡丹花瓣转录组数据库,筛选得到3个与植物乙烯响应因子ERF蛋白同源性较高的Unigene序列,利用RACE及RT-PCR技术,设计特异性引物对3个ERF基因最大阅读框进行扩增并测序。生物信息学分析表明PsERF1、PsERF2和PsERF3分别含有长为1 158、747和609 bp的开放阅读框,编码383、248和202个氨基酸残基,且均含有1个典型的AP2结构域。进化分析表明3个牡丹ERF转录因子分别属于ERF亚家族的B2组、B1组和B3组。利用实时定量PCR分析了3个ERF基因在牡丹乙烯敏感型品种‘洛阳红’和乙烯不敏感型品种‘雪映桃花’不同花器官（花瓣、雄蕊、雌蕊和萼片）以及不同发育级别切花花瓣中的表达情况。结果表明,PsERF1在2个品种花瓣中的表达量显著高于其他花器官,其表达量在‘洛阳红’切花发育过程中逐渐增加,而在‘雪映桃花’切花发育过程中逐渐降低,推测PsERF1可能对牡丹切花的乙烯响应具有重要的调控作用,PsERF2和PsERF3则可能同时参与了多种信号途径。     

GA和ABA信号转导关键基因在不同温度处理‘凤丹’牡丹种子中的表达分析

采用超高效液相色谱—串联质谱(UPLC–MS/MS)的方法测定了25℃和4℃处理下‘凤丹’牡丹(Peaonia ostti‘Fengdan’)种子播种后8个时期的激素含量变化,并利用qRT-PCR分析GA_3和ABA信号转导4个关键基因的表达模式。结果表明:25℃处理下种子可以正常萌发,而4℃处理下种子在播种后100 d内未萌发。两种温度处理下种子中GA_3含量均呈现先升高后降低的趋势,但25℃处理播种后17 d(下胚轴萌发期)显著高于4℃处理;在25℃处理种子中ABA含量逐渐降低,而4℃处理下短时间降低后迅速升高,且在播种后7~17 d显著高于25℃处理。推测25℃处理下较高含量的GA_3可以促进种子萌发;而4℃处理下较高含量的ABA抑制种子萌发。qRT-PCR分析表明,PoGID1a和PoGAI的整体表达模式与GA_3含量变化趋势类似,呈现先升高后降低的趋势,但播种前期25℃处理下PoGID1a表达量一直显著高于4℃处理,而PoGAI却显著低于4℃处理(21 d除外);PoGAMYB4在25℃处理下呈升高趋势,在4℃处理下先升高后降低,但播种3 d后25℃处理显著高于4℃处理;PobZIP表达趋势与ABA含量变化相似,4℃处理显著高于25℃处理。故推测牡丹种子萌发受GA和ABA调控,GA通过调控信号转导关键基因PoGAMYB4、PoGID1a和PoGAI促进种子萌发,其中PoGAMYB4和PoGID1a可能受GA正调控,而PoGAI受GA负调控;ABA可能通过正调控PobZIP抑制种子萌发。     

抗裂与易裂枣内源激素含量和细胞壁代谢相关酶活性比较

 以枣抗裂果品种‘圆铃枣’和易裂果品种‘俊枣’为材料,测定了果实生长发育曲线、果 形指数及种子败育率,并对果皮、果肉、种子中内源激素含量及果皮、果肉中细胞壁代谢相关酶的活性 进行了检测。结果表明,‘俊枣’果形指数和种子败育率均显著高于‘圆铃枣’。果实发育后期‘俊枣’ 果皮中的GA3 含量、果肉中的IAA 含量明显高于‘圆铃枣’,而‘圆铃枣’果肉及种子中的ABA 含量高 于‘俊枣’;‘俊枣’果肉及种子中（GA3 + IAA + ZT）/ABA 的比值在整个果实生长发育期均高于‘圆铃 枣’。果实生长发育后期‘俊枣’果皮中的果胶酶及纤维素酶活性高于‘圆铃枣’,且‘俊枣’果肉中的 POD 及PPO 活性也较高。以上结果显示,枣果实生长发育后期易裂品种‘俊枣’果肉中的IAA 积累较多, 而抗裂品种‘圆铃枣’果肉及种子中ABA 含量显著高于易裂品种;易裂品种‘俊枣’果肉及种子中（GA3 + IAA + ZT）/ABA 的比值较高,果皮中的果胶酶、纤维素酶活性影响裂果的发生,其POD 及PPO 活性相 对较高。     

苹果bZIP转录因子基因MdAREB2功能的初步研究

对‘嘎拉’苹果中的1个bZIP转录因子基因MdAREB2(序列号:MDP0000248567)进行功能初步研究。蛋白进化树分析表明,苹果MdAREB2与拟南芥AtAREB2具有很高的同源性。利用PlantCare数据库进行启动子顺式作用元件的预测分析,MdAREB2启动子序列中存在脱落酸响应元件ABRE。实时定量PCR检测表明,MdAREB2明显受ABA诱导。拟南芥种子萌发阶段经过0.5和2μmol·L~(-1)ABA处理后发现突变体abi5中过量表达MdAREB2能够恢复对ABA的敏感性。拟南芥幼苗生长阶段,经过20μmol·L~(-1) ABA处理后发现,突变体abi5中过量表达MdAREB2能够部分恢复对ABA的敏感性。     

苹果乙烯信号转导相关基因MdEIL1的克隆及功能鉴定

以苹果‘嘎拉’（Malus × domestic‘Royal Gala’）为试材,分离了乙烯信号转导相关的MdEIL1基因（基因序列号：MDP0000423881）。序列分析表明,该基因包含长为1 980 bp完整的开放阅读框,编码658个氨基酸的蛋白。进化树分析表明MdEIL1属于EIN3/EIL转录因子家族蛋白。定量分析显示,MdEIL1基因在苹果的根、茎、叶、花和果实中有不同程度的表达,而且它的表达也受到乙烯、生长素和细胞分裂素的诱导。通过原核表达试验体外诱导MdEIL1蛋白成功,为后续蛋白功能鉴定奠定了基础。MdEIL1基因在拟南芥中异位表达,增强其乙烯响应,在暗处表现为下胚轴变短,并且AtERF1的表达量上升,显示转基因植株对乙烯的敏感性提高。     

‘津田’芜菁光形态建成抑制因子COP1 蛋白cDNA 的克隆及表达分析

 通过RT-PCR和RACE的方法得到了编码‘津田’芜菁（Brassica rapa L. ssp. rapifera‘Tsuda’）BrCOP1的cDNA序列，长2 034 bp，编码677个氨基酸，与拟南芥同源性达94%，命名为BrCOP1，GeneBank收录号为JF738111。Northern杂交分析表明BrCOP1的表达没有组织特异性，而在整株幼苗及成熟植株肉质根表皮中受长波紫外线（UV-A）诱导表达，但成熟植株的直根表皮中表达量不随处理时间延长而增加。这暗示BrCOP1作为光控发育的重要调控因子，可能在UV-A诱导‘津田’芜菁花青素合成及光信号转导中起重要作用。     

牡丹NCED 基因的克隆和表达分析

 通过RT-PCR和RACE技术克隆得到了牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）中编码9–顺式–环氧类胡萝卜素加双氧酶蛋白（NCED）的一条cDNA基因全长（暂命名为Ps-NCED1）。进化树分析显示Ps-NCED1的氨基酸序列与葡萄、马铃薯、胡萝卜等植物中的NCED一致性均达到了70%以上。通过与拟南芥中CCD（类胡萝卜素分解加双氧酶）家族氨基酸序列比对后发现,Ps-NCED1与调控ABA合成的At-NCED3一致性最高。对花朵中内源ABA的研究发现,ABA在花朵蕾期及衰老期含量较高,盛开期时含量较低,表明ABA对于植物的开放衰老具有促进作用。相对荧光定量PCR分析发现：在花朵完全开放的牡丹植株中,Ps-NCED1在根、茎、叶、花托、萼片、花瓣、心皮、雄蕊中的表达量以在根和雄蕊中较高,在叶和萼片中最低。在外源ABA处理的牡丹花瓣中,Ps-NCED1表达量变化与内源ABA含量变化具有相同的趋势,推测该基因是调控内源ABA含量的主要基因。     

葡萄白粉病菌应答基因VpSTART的克隆及表达分析

 在前期获得葡萄白粉病菌应答基因VpSTART的EST基础上,采用RACE和RT-PCR技术克隆该基因cDNA全长序列。VpSTART全长1 321 bp,3′端非编码区114 bp,包含一个1 206 bp开放阅读框,编码401个氨基酸。VpSTART蛋白分子量为45.3 kD,与欧亚种葡萄、玉米、拟南芥、蒺藜状苜蓿和蓖麻的蛋白同源性分别为99%、64%、58%、46%和25%。实时荧光定量PCR表明,VpSTART在‘商–24’葡萄花序、卷须和茎中表达量较高;感白粉病的‘湖南–1’葡萄叶片接种白粉病菌后VpSTART表达量与对照没有显著差异,而抗白粉病的‘商–24’葡萄接种12 h后VpSTART表达量增加,在24 ~ 96 h表现显著性差异;用SA、MeJA和Eth等不同信号分子分别处理‘湖南–1’和‘商–24’葡萄叶片1 ~ 48 h后,VpSTART基因的表达受SA负调控,受MeJA和Eth正调控。     

草莓FaCBF1基因的克隆及表达分析

以‘丰香’草莓为试材,通过SON-PCR结合RT-PCR技术获得了1个冷诱导转录因子CBF/DREB家族基因编码区全长cDNA序列,命名为FaCBF1,GenBank登录号为FJ767754。该基因包含1个长为636 bp的完整开放阅读框,编码211个氨基酸,预测分子量为23.4 kD,等电点为6.53。氨基酸同源性分析表明,FaCBF1与GenBank中登录的蔷薇科植物CBF/DREB具有较高的同源性。进化树分析表明,草莓FaCBF1与近缘属的月季、苹果和沙梨处于同一进化枝上,而与李属植物进化关系较远。半定量RT-PCR分析显示,FaCBF1能被低温、干旱和高盐胁迫诱导,但对ABA诱导不敏感;在同一诱导时期在根中的表达量高于叶和茎中的表达量。     

枸杞Lb_PPR1的克隆及其在不同育性品种中的表达分析

三角状五肽重复（Pentatricopeptide repeats,PPR）蛋白定位于多种细胞器中,参与细胞核和细胞器中特异单链RNA的转录后修饰和编辑,在植物生长发育的多个阶段均发挥着重要的作用。分别从枸杞（Lycium barbarum）雄性可育系‘宁杞1号’和不育系‘宁杞5号’中克隆了Lb_PPR1基因,并对其编码蛋白质进行理化性质、亚细胞定位、保守结构域、蛋白结构以及系统进化等方面进行预测分析。结果显示,‘宁杞1号’和‘宁杞5号’中Lb_PPR1基因的开放阅读框均为1 977 bp,编码658个氨基酸,但其中存在20个碱基和14个氨基酸的差异。Lb_PPR1蛋白包含14个串联重复的PPR保守基序,属于PLS家族,该蛋白定位在细胞膜和细胞质。二级、三级结构预测显示该蛋白以α螺旋为主。同源进化分析得出Lb_PPR1蛋白与同属茄科的辣椒和烟草PPR蛋白亲缘关系最近。利用实时荧光定量PCR检测Lb_PPR1在枸杞不同组织器官及不同发育阶段花药中的表达特性。结果显示,Lb_PPR1在枸杞不同组织中均有表达,但在可育系花蕾中表达量最高,不育系‘宁杞5号’各组织中表达量均显著低于可育系‘宁杞1号’。以上结果表明,Lb_PPR1基因可能与枸杞花药发育有关。     

苹果花芽和种子休眠过程中MdCIbHLH1基因的表达分析

对前期在苹果（Malus × domestica Borkh.）中发现的受低温诱导的bHLH转录因子进行了生物信息学分析,并以层积苹果种子和苹果芽为试材,用半定量和实时定量PCR技术分析其花芽休眠不同阶段的表达变化。蛋白质二级结构预测结果表明,MdCIbHLH1蛋白中以α螺旋和无规则卷曲为主,β折叠和延伸链较少,其中α螺旋145个（27.31%）、β折叠19个（3.58%）、无规则卷曲310个（58.38%）、延伸链57个（10.73%）。半定量和定量结果显示,在层积的苹果种子和休眠的花芽中MdCIbHLH1有相同的表达模式,在休眠解除之前表达较高,随着休眠的解除其表达量下调。因此推测MdCIbHLH1的表达对层积的苹果种子或者花芽休眠及解除具有调控作用。     

茶树CsAIL的克隆及在不同休眠阶段的表达分析

从茶树不同休眠状态腋芽转录组中筛选出一条差异表达基因,经全长克隆和同源性分析证实该基因为与多年生植物休眠的形成和解除密切相关的AINTEGUMEN-LIKE(AIL)的同源基因,命名为CsAIL。生物信息分析表明,该基因包含1个1 872 bp的开放阅读框,编码623个氨基酸。编码的蛋白质分子质量为69.2kD,理论等电点为6.6,是一种非分泌性蛋白;该蛋白有两个保守的AP2结构域,是植物中特有的广泛参与生长发育调节的AP2亚家族成员。亚细胞定位预测CsAIL蛋白不存在于叶绿体或者线粒体中,可能定位于其他细胞器;经同源性分析,在‘云抗十号’和‘舒茶早’全基因水平上分别鉴定了11个和12个AIL同源基因。系统进化树及序列保守性分析显示,Cs AIL与‘云抗十号’CSA001743.1和‘舒茶早’TEA027750.1的进化关系最近,与已知的拟南芥AIL蛋白处于不同分支,但具有典型的保守结构域和已知的重要氨基酸位点。启动子序列分析显示该基因可能受生理节律、光及多种激素等信号共同调控。CsAIL在茶树顶芽、腋芽和茎中的表达量较高,叶片中较低,花中几乎不表达。在茶树冬季类休眠和生理休眠阶段,该基因的表达量在叶和越冬芽中均逐渐下调并维持在较低水平;在生态休眠及萌动阶段显著上调。分析其可能的下游调控基因CsCYCD3.2和CsCYCD6.1的表达,二者与Cs AIL的表达模式高度一致,与越冬芽的休眠状态存在高度关联。本研究表明,CsAIL可能是参与茶树休眠调控的关键基因,与CsCYCDs共同在茶树年休眠—生长循环中发挥作用。     

苹果己糖激酶基因MdHXK1的克隆与表达分析

从‘嘎啦’苹果中克隆了己糖激酶基因MdHXK1(基因序列号:MDP0000309677)全长,测序发现其包含长为1 497 bp完整的开放阅读框,编码499个氨基酸,预测其编码蛋白质分子量为54.05k D,等电点为5.76。系统进化树分析表明,HXK1在不同物种间具有高度的序列保守性;其中,苹果MdHXK1与中国白梨Pb HXK1亲缘关系最近。功能域分析表明,MdHXK1蛋白含有两个保守的激酶域。Southern blotting结果表明,MdHXK1在苹果基因组中有一个拷贝。亚细胞定位预测表明,MdHXK1主要定位于细胞质。分析MdHXK1基因启动子序列发现含有与抗逆、糖信号及激素信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdHXK1在苹果的茎和花中表达量较高;在苹果果实发育期间,MdHXK1基因的表达、MdHXK1葡萄糖磷酸化相对酶活性和葡萄糖积累水平都呈现先升高后降低的趋势,MdHXK1基因的表达明显受盐、低温和ABA的诱导。原核诱导并纯化了MdHXK1蛋白,为后续MdHXK1蛋白的功能鉴定奠定基础。     

苹果U-box型E3泛素连接酶MdPUB24的耐盐性和ABA敏感性鉴定

从‘皇家嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆了一个E3泛素连接酶基因(序列号:MDP0000199588)。基因序列测序发现,该基因包含长为1 212 bp完整的开放阅读框,编码404个氨基酸。系统进化树分析表明,这一E3泛素连接酶与拟南芥At PUB24同源序列相似性最高,因此将其命名为MdPUB24。利用Plant Care数据库进行启动子顺式作用元件预测分析表明,MdPUB24启动子序列中含有与脱落酸、光、茉莉酸及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdPUB24在‘皇家嘎拉’苹果的不同组织中均有表达,且在叶片中最高;外源ABA、NaCl和低温胁迫处理能够抑制‘皇家嘎拉’苹果组培苗中MdPUB24的表达。MdPUB24过量表达的‘王林’苹果愈伤组织和异位表达的拟南芥幼苗在盐胁迫条件下,生长势与野生型相比明显变弱,表明MdPUB24负调控盐胁迫。相反,在外源ABA处理条件下,MdPUB24过量表达苹果愈伤和异位表达拟南芥与对照相比,生长势明显增强,表明MdPUB24对ABA不敏感。     

不完全甜柿‘禅寺丸’花性别分化形态学关键时期的研究

以雌雄同株的‘禅寺丸’柿为材料,利用扫描电镜和石蜡切片法观察雌花和雄花芽发育进程,探究柿花性别分化的形态学关键时期。结果表明,‘禅寺丸’雌、雄花芽发育进程基本同步,均从6月持续到次年5月,可划分为11个阶段;花性别分化有两个形态学关键时期:一是6月中旬(阶段2)萼片原基发生期,此时雌花单生、雄花3朵合生的特点开始显现;二是次年4月中旬(阶段8)大小孢子发生期,此时雌花的雄蕊原基分化出花丝后停止发育,雄花的雌蕊原基在花柱和柱头结构产生后开始败育,从而产生单性花。     

番茄过表达SlMYB102对种子萌发及生长的影响

番茄（Solanum lycopersicum L.）基因组中已鉴定到121个R2R3-MYB转录因子,但其中绝大多数的生物学功能仍然未知。为探究R2R3-MYB转录因子基因SlMYB102的功能,从‘Micro-Tom’番茄中,利用PCR技术克隆了SlMYB102的编码区,全长为1 089 bp。保守结构域和系统进化树分析显示,SlMYB102蛋白包含两个保守的MYB结构域,与马铃薯的StMYB34同源性最高。亚细胞定位结果显示,SlMYB102编码的蛋白定位于细胞核中。SlMYB102在根、茎、叶、花和未绿熟、红熟果实中均有表达,在茎、叶、花中表达量较高。利用农杆菌介导,将35S::SlMYB102转入番茄,获得了两个过表达株系。与野生型相比,过表达株系种子萌发速率明显升高,而植株高度、叶面积、地上部及地下部的鲜质量均显著降低。显微观察结果表明,与野生型相比,过表达株系叶片表皮细胞面积大小并没有变化,推测过表达SlMYB102是通过减少细胞分裂来抑制番茄植株的生长。     

芥蓝八氢番茄红素脱氢酶基因BaPDS1和BaPDS2的克隆与表达分析

以白花芥蓝为材料,采用反转录PCR技术克隆得到2个八氢番茄红素脱氢酶基因BaPDS1和BaPDS2,GenBank登录号为KX426039和KX426040,其开放阅读框分别为1 692和1 698 bp,分别编码563和565个氨基酸。同源性及进化树构建结果表明PDS蛋白在进化过程中比较保守,芥蓝PDS基因与甘蓝、白菜、花椰菜等十字花科蔬菜亲缘关系较近。半定量PCR分析发现,BaPDS1和BaPDS2表达水平在芥蓝不同发育时期和组织器官间均存在显著差异。萌动种子期BaPDSs表达量较低,之后迅速上升;BaPDS1在成熟期器官间呈现组成型表达,BaPDS2在器官间表达差异较大,幼果中未检出;花器官中萼片的BaPDSs表达量显著低于其他组织,在开花过程中,雄蕊和雌蕊的BaPDS1表达水平出现上调。