‘巨峰’葡萄细胞分裂素氧化酶基因CKX3的克隆与表达分析

结合同源克隆和RACE技术在‘巨峰’葡萄（Vitis labruscana Bailey × V. vinifera L.‘Kyoho’）中克隆了细胞分裂素氧化酶基因CKX3,分析了该基因的表达特性及其对细胞分裂素的响应。序列分析表明,该基因cDNA全长为2 049 bp（GenBank登录号：KP689597）,ORF（开放阅读框）为1 569 bp,编码522个氨基酸,具有FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）结合结构域和细胞分裂素结合结构域。该基因定位在葡萄的7号染色体上,具有4个内含子,5个外显子。氨基酸序列多重比对和系统进化树分析显示‘巨峰’葡萄CKX3与荷花NuCKX3亲缘关系最近,与毛果杨同源性较高。基因表达分析结果显示‘巨峰’葡萄CKX3主要在根部和花序中大量表达,其次是在卷须和果实中有较高的表达,在茎和叶中的表达量较低;在花序发育过程中,在盛花期前表达量较低,盛花期以及盛花后表达量增加。在6-BA处理葡萄叶片后,CKX3的表达与细胞分裂素氧化酶的活性都高于对照。     

狗蔷薇生长素输出载体蛋白基因PIN1 和PIN2的分离与表达分析

 植物体内生长素输出载体PIN 蛋白基因的表达变化间接反映了生长素的运输与积累状态。 为分析生长素在狗蔷薇（Rosa canina）类原球茎发生初期的作用，以狗蔷薇叶片愈伤形成的不定根为材 料，分离了生长素输出载体蛋白基因PIN1 和PIN2 的cDNA，分别命名为RcPIN1（GenBank 登录号 KF543362）和RcPIN2（GenBank 登录号KF543363）。RcPIN1 全长2 266 bp，编码621 个氨基酸；RcPIN2 全长2 248 bp，编码643 个氨基酸，两者推导蛋白结构差异微小，在N 端和C 端均有5 个跨膜区域，中 间1 个亲水区。Blast 比对发现两个基因与多种植物PIN 基因具有高度同源性（> 70%）。半定量RT-PCR 分析表明，RcPIN1 在根、茎中表达量高于叶和花，RcPIN2 在根中表达水平高于茎、叶和花；在狗蔷薇类 原球茎发生初期，TDZ 诱导培养下愈伤—不定根RcPIN1 和RcPIN2 表达上调，而TDZ + TIBA 抑制培养 下两基因表达不活跃，且类原球茎形成率降低。试验结果表明生长素的极性运输与积累参与了调控狗蔷 薇类原球茎的初期形态建成。     

茶树NADPH氧化酶基因的克隆、亚细胞定位与表达分析

以茶树(Camellia sinensis)‘迎霜’为试验材料,采用同源克隆的方法,利用RACE和RT-PCR技术获得茶树NADPH氧化酶基因Cs RBOHA的c DNA全长(Gen Bank登录号:KJ782632)。该基因全长3 157 bp,开放阅读框2 769 bp,编码922个氨基酸。生物信息学分析显示,该基因编码的蛋白分子量为103.33 k D,理论等电点为9.28;C端序列较保守,N端序列保守性较低,与烟草和蓖麻的相似性达79%,进化关系最近;蛋白结构具有典型的家族特征。该蛋白分布于细胞质膜上,与预测结果一致。实时荧光定量PCR结果显示,该基因的表达存在组织特异性,并且在低温(4℃)、高盐(200 mmol·L-1 Na Cl)、ABA(200 mg·L-1)和干旱(10%PEG 6000)条件下出现不同程度的上调。     

‘巨峰’葡萄细胞分裂素响应调节因子VlRR5的克隆与表达分析

葡萄在生长发育过程中会出现3次落果高峰,‘巨峰’葡萄的落果现象更为严重。从‘巨峰’葡萄中克隆得到1个细胞分裂素响应调节因子VlRR5,该基因有1个磷酸受体结构域(REC)和1个MYB样DNA结合结构域,cDNA全长2 597 bp,编码693个氨基酸,定位在4号染色体上。亚细胞定位在细胞核中。酵母转化试验中,转入pGBKT7-VlRR5的酵母菌可以在SD/-Trp/-Ade/-His/+X-α-Gal缺陷型培养基上正常生长且显蓝色,证明VlRR5具有转录激活活性。荧光定量PCR分析显示,VlRR5的表达具有组织特异性,在叶和茎中表达量较高;在幼果发育阶段呈现先升高后降低的趋势;并且在外源细胞分裂素CPPU处理后表达量上升,在细胞分裂素合成抑制剂洛伐他汀处理后表达量下降。这些结果表明VlRR5可以响应外源细胞分裂素处理,在细胞分裂素介导葡萄坐果过程中发挥重要作用。     

狗蔷薇类根体和类原球茎发生发育的组织学研究

以狗蔷薇叶片为对象观察其类根体和类原球茎发生发育的过程。发现叶片外植体叶柄维管束的原形成层细胞在2,4-D的诱导下分裂并扩大形成狭长的微管组织细胞,进一步衍生形成根源基细胞,根源基细胞分裂形成根尖分生组织,并最终形成类根体。类根体具有根冠、生长点、伸长区和根毛区,类根体只有初生结构,不具备次生结构。携带有愈伤组织的类根体在含TDZ的1/2MS培养基和光照协调作用下,根尖分生组织消失并分化成成熟的薄壁细胞,中柱鞘上部的细胞形成胚性愈伤组织,其分化为胚性细胞并形成新的分生中心,突破皮层和表皮,进而形成类原球茎。     

葡萄细胞分裂素响应调节因子VlRRA1的克隆、表达及启动子活性分析

在‘巨峰’葡萄中克隆获得细胞分裂素响应调节因子VlRRA1及其启动子,分析了VlRRA1的表达特征,并对其启动子进行活性分析。结果显示,VlRRA1的cDNA全长为666 bp,编码221个氨基酸;保守结构域预测结果显示该基因仅含有1个磷酸接受结构域（REC）,属于A型RR基因;系统进化关系表明VlRRA1与其他物种中的A型RR亲缘关系较近。酵母自激活试验说明VlRRA1不具有转录激活活性,符合A型RR基因的典型特征。qRT-PCR结果表明VlRRA1具有组织表达特异性,主要在茎、叶以及幼果中表达;外源细胞分裂素氯吡苯脲（CPPU）可以促进VlRRA1的表达,而细胞分裂素生物合成抑制剂洛伐他汀（lovastatin,LOV）则抑制VlRRA1的转录。VlRRA1启动子上有多种与非生物胁迫和激素响应相关的元件。GUS组织染色的结果表明,VlRRA1启动子具有活性,可以响应多种激素信号,包括与坐果相关的细胞分裂素、生长素和赤霉素。以上结果表明VlRRA1在细胞分裂素介导的葡萄坐果与幼果发育中具有重要作用。     

鸭梨多酚氧化酶基因CDS区的克隆及表达

以鸭梨(Pyrus bretschneideri Rehd.)果皮基因组DNA为模板,根据已经发表的多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)基因保守序列设计引物,利用PCR技术,克隆得到鸭梨多酚氧化酶编码区序列,将此核酸序列克隆到载体pGEM-T,酶切鉴定后测序,结果表明该段序列含有1782个核苷酸,编码593个氨基酸。对鸭梨多酚氧化酶基因片段的一致性分析和进化树分析表明,该片段与沙梨(Pyrus pyrifolia,AB056680)、苹果(Malus domestica,L29450)、李(Prunuss alicina,AY866432)以及杏(Prunus armeniaca,AF020786)的一致性分别为99%、96.3%、82%和51.4%,绘制的进化树和形态学分类地位相一致。将该片段连接到表达载体pET39b上,获得的重组子命名为pET39b-PPO,热激法转化表达受体大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG进行诱导。SDS-PAGE分析表明,PPO基因在大肠杆菌中被诱导表达蛋白质相对分子质量约66ku,检测表明具有多酚氧化酶的活性。     

黄瓜贝壳杉烯氧化酶基因CKO 的克隆及其表达分析

 以‘戴多星’黄瓜为试材,应用同源克隆和RACE技术从茎尖中得到赤霉素合成的关键酶--贝壳杉烯氧化酶（KO）基因cDNA全长序列,命名为CKO,GenBank登录号为JN792591,其长度为1 895 bp,开放阅读框（ORF）编码519个氨基酸,相对分子量为59.211 kD,等电点（PI）8.45。氨基酸同源性分析发现,CKO与苦瓜的KO同源性最高,达84%;序列结构分析表明,CKO属于细胞色素超家族P450系,具有细胞色素P450的血红素结构域FXXGXRXCXG和跨膜结构域。实时荧光定量分析表明,CKO在遮荫的徒长苗中表达量最高,是正常苗的5.18倍,在遮阴条件下喷施多效唑可降低期表达。     

龙眼亚硫酸盐氧化酶(DlSO)基因的克隆及表达分析

【目的】探讨龙眼果实亚硫酸盐氧化酶基因(DlSO)在硫残留生物降解中的作用。【方法】以龙眼总RNA为模板,采用RT-PCR结合RACE法获得龙眼亚硫酸盐氧化酶基因全长cDNA序列,命名为DlSO;运用荧光定量PCR对其表达量进行分析;使用ClontechIn-Fusion技术构建原核表达载体,使其在Rosetta(DE3)大肠杆菌中表达。【结果】DlSO序列全长1413bp,包含一个1182bp的开放阅读框,一个长37bp的5’非翻译区序列和194bp的3’非翻译区,预测编码393个氨基酸;同源性和系统进化分析结果均表明DlSO与毛果杨SO亲缘关系最近;荧光定量结果表明,在龙眼不同组织中,DlSO基因都有表达,其中在叶片中表达量最高,其次是花、幼果、根和果肉,在茎和果皮组织中DlSO基因的表达量最低;成功构建pET-32a-DlSO原核表达载体,经IPTG诱导后在Rosetta(DE3)大肠杆菌中成功表达。【结论】克隆了龙眼亚硫酸盐氧化酶基因(DlSO),并且成功构建了pET-32a-DlSO原核表达载体,经IPTG诱导在大肠杆菌中成功表达出融合蛋白,为下一步研究龙眼亚硫酸盐氧化酶的作用奠定了基础。     

细胞分裂素对西瓜产量及品质的影响

细胞分裂素是中国农科院植保所微生物室与浙江省嘉善县微生物厂协作制成的粉剂,对水稻、茶叶、蔬菜、果树等多种作物产量的提高有明显的促进作用。为了探讨细胞分裂素对西瓜产量及品质的影     

芹菜甘露醇脱氢酶基因的分离与表达分析

 以芹菜（Apium graveolens L.）本芹品种‘六合黄心芹’和西芹品种‘文图拉’为研究对象, 通过克隆测序,分别获得2 种芹菜的甘露醇脱氢酶基因序列。2 种芹菜来源的该基因全长均为1 098 bp, 编码365 个氨基酸,预测2 种芹菜该酶蛋白质分子量分别为39.66 kD 和39.69 kD,pI 值分别为6.79 和6.78。 2 种芹菜中甘露醇脱氢酶基因之间有17 个核苷酸位点不同,3 个氨基酸位点发生改变。通过与其他植物 甘露醇脱氢酶基因与氨基酸序列比对,表明该基因具有高度的保守性。进化分析显示,与同属于伞形科 的植物香芹进化关系最近。实时定量PCR 表明,芹菜中甘露醇脱氢酶基因在根、茎、叶、花中表达有差 异,其中根中含量最高。对2 种芹菜分别进行4 ℃、38 ℃、0.2 mol · L-1 NaCl 和20% PEG 处理7 个不同 时间段,实时定量表达分析显示,‘六合黄心芹’中甘露醇脱氢酶基因变化大于西芹‘文图拉’,且不同 处理后甘露醇脱氢酶基因表达响应呈现出较大的差异。     

野蔷薇（Rosa multiflora）抗白粉病基因RmMlo的克隆与表达分析

以野蔷薇（Rosa multiflora）为试材,采用RT-PCR和RACE方法从叶片中获得了一个Mlo同源基因的cDNA全长,命名为RmMlo,GenBank登录号为JF310747。序列分析结果表明,RmMlo基因cDNA全长为1993bp,包含49bp的5′非编码区、243bp的3′非编码区和一个长度为1700b...     

刺梨GDP-L–半乳糖磷酸酶基因的表达及其与AsA积累的关系

 采用RT-PCR和RACE技术,从刺梨（Rosa roxburghii Tratt）果实中扩增出GDP-L–半乳糖磷酸酶（GDP-L-galactose pyrophosphatase,GGP）基因的全长cDNA序列,并分析其在不同组织和果实不同发育阶段的表达特点及其与AsA积累的关系。结果表明：刺梨GGP基因cDNA（RrGGP,GenBank 登录号：HM998753）包含1个长度为1 341 bp的开放阅读框（ORF）,编码445个氨基酸;其氨基酸序列与苹果、猕猴桃等的相似性均在80%以上。RT-PCR分析表明,该基因在刺梨不同器官中的表达差异明显：在果实中的表达量最强,叶中次之,而花和茎中只能检测到极微弱的表达。在果实不同发育时期都能检测到RrGGP的表达,在发育初期（花后50 d内）表达较弱,花后60 ~ 100 d呈高水平表达,而后随着果实成熟而下调。刺梨中RrGGP的表达特点与AsA积累高度一致,意味着该基因可能是果实发育过程中AsA合成的关键基因。     

月季bHLH基因的克隆、表达及其与MYB和WD40的互作分析

以月季‘月月红’(Rosa chinensis‘Slater’s Crimson China’)花瓣为材料,利用同源克隆法鉴定到1个Rcb HLH基因的c DNA全长序列,并研究了其生物信息学特征、组织特异性表达及其与MYB和WD40的互作关系。序列分析表明,Rcb HLH的开放阅读框长2 112 bp,编码703个氨基酸,基因登录号为KY783912。结构域序列分析显示,Rcb HLH为一个保守的N端含有碱性氨基酸的DNA结合区、C端含有α螺旋–环–α螺旋的b HLH蛋白。对Rcb HLH进行系统进化分析发现,Rcb HLH与草莓及其他蔷薇科植物的b HLH蛋白具有较高的同源性。组织特异性实时定量RT-PCR分析揭示Rcb HLH基因主要在花瓣中表达。酵母双杂交结果显示,Rcb HLH能与Pav MYB和Pav WD40相互作用形成MYB-b HLH-WD40复合物。以上结果为进一步研究Rcb HLH的功能鉴定奠定了基础。     

苹果细胞质型苹果酸脱氢酶基因克隆、表达及酶活性分析

根据亚细胞定位,苹果酸脱氢酶可分为5种类型,其中依赖于NAD的细胞质型苹果酸脱氢酶(cyMDH)在植物上的研究较少.从苹果果实中分离了cyMDH的全长cDNA序列,命名为Mal-cyMDH (GenBank登录号为DQ221207),该序列含有一个996 bp的开放阅读框(ORF).序列同源性分析表明Mal-cyMDH与其他物种cyMDH有较高的同源性,进化树分析表明几乎所有的cyMDH可以聚类在一个分支上,并且cyMDH可能是MDH的最原始种.原核表达得到一个37 kD左右的融合蛋白,酶活测定表明该酶主要催化合成苹果酸.苹果果实中cyMDH酶活分析表明在高酸和低酸基因型中该酶的还原活性存在明显差异.     

杧果乙烯受体基因MiETR1b的分离与表达分析

以‘紫花杧’杧果（Mangifera indica L.‘Zihua’）子叶切段为材料,采用RT-PCR结合RACE方法得到乙烯受体基因ETR1的cDNA及基因组DNA全长,命名为MiETR1b。该基因cDNA全长2 530 bp,开放读码框为2 220 bp,编码739个氨基酸;其基因组DNA全长4 116 bp,其中从起始密码子到终止密码子为3 305 bp,含有6个外显子和5个内含子。氨基酸序列多重比对及系统发育树结果显示MiETR1b与MiETR1亲缘关系最近,与CsERS1、DlETR1、TcERS1、PtrETR1有较高的同源性,且具有保守的GAF域和组氨酸激酶域。这些结果表明,MiETR1b为ETR1家族同源基因。荧光定量PCR结果表明,MiETR1b在杧果子叶切段不定根形成过程中在远轴端和近轴端都有表达,其中远轴端0.25 ~ 2 d的表达量显著上调;吲哚丁酸（IBA）和2,3,5–三碘苯甲酸（TIBA）预处理后分别在1 d和6 h显著下调。另一方面,在培养的初期,即0.5 ~ 1 d,乙烯释放量相对较高,4 d及其以后的乙烯释放量急剧下降,表明杧果子叶切段不定根形成过程中有较多乙烯生成,提示MiETR1b可能参与了不定根的形成。     

三七RNase-like 基因的克隆及表达分析

 采用同源序列克隆法,结合RACE 技术,从三七[Panax notoginseng（Burk.）F.H]根茎总RNA 中克隆次生代谢相关差异表达RNase-like 贮藏蛋白的编码序列,并进一步以DNA 为模板扩增全长基因, 获得一条开放阅读框为717 bp 的cDNA 序列,命名为PMP（GenBank,KC751542),相应基因全长1 074 bp。序列及其进化分析表明,该基因包含3 个外显子和2 个内含子,编码238 个氨基酸,相应蛋白质的 分子量为27.47 kD,含有核苷酸结合的保守区域,属于RNase-T2 超家族成员。三七PMP 蛋白与人参 RNase-like 贮藏蛋白高度同源,序列相似性达95%。实时荧光定量PCR 研究表明,三七PMP 基因在其根、 茎、叶、花等器官中均有表达,且3 年生根中表达量最高,暗示该基因可能参与三七皂苷次生代谢调控 及其品质形成。