芜菁花青素合成关键酶DFR基因启动子的克隆及功能分析

在已经克隆的‘津田’芜菁和‘赤丸’芜菁二氢黄酮醇4–还原酶（DFR）基因的基础上,通过染色体步移法从两种芜菁基因组中克隆了BrDFR1和BrDFR2基因上游1 296和1 297 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,启动子片段中包含TATA box、CAAT box、光调控元件、ABA应答元件、伤害应答元件、低温应答元件、防御与胁迫应答元件、MeJA应答元件等多个顺式作用元件。启动子BrDFR1P和BrDFR2P仅在15个核苷酸位点存在差异。将BrDFR1P和BrDFR2P分别连接到pCAMBIA1301植物表达载体上,构建Promoter::GUS载体,通过农杆菌介导遗传转化烟草。GUS组织化学染色检测表明,BrDFR1P和BrDFR2P均能驱动GUS基因表达。构建BrDFR1P和BrDFR2P的一系列缺失体,融合GUS基因后遗传转化烟草。染色结果表明,BrDFR1P和BrDFR2P缺失片段均具有相应的起始下游基因转录的活性特征。     

芥蓝二氢黄酮醇4–还原酶基因BoaDFR的克隆与功能鉴定

以白花芥蓝‘四季粗条’为材料克隆了Boa DFR基因,Gen Bank登录号为MT472647,CDS序列长为1158 bp,编码385个氨基酸,与甘蓝型油菜、甘蓝和白菜等具有高度同源性。Boa DFR表达水平在芥蓝不同发育时期、不同器官中存在显著差异,随植株发育总体呈现先下降后上升的趋势,在幼嫩种子中表达量最高。芥蓝原生质体的亚细胞定位结果显示Boa DFR定位在细胞核上。构建了农杆菌介导的芥蓝瞬时过表达体系,将Boa DFR转入白花芥蓝‘四季粗条’和黄花芥蓝‘福州黄花’中,发现Boa DFR在两种芥蓝中均高水平表达,转基因植株叶片颜色明显变紫,花青素苷显著积累,总含量最高达461.43μg·g-1 FW,而野生型和转空载体芥蓝叶片中几乎检测不到花青素苷。通过HPLC在转基因植株叶片中共检测到8种花青素苷,均为矢车菊花青素苷,其中矢车菊–3–阿魏酰–丙二酰–槐糖苷–5–葡萄糖苷占比最高。     

露地菊离体再生体系建立及BrDFR基因遗传转化

 以露地菊（Chrysanthemum morifolium）品种‘神韵’无菌苗叶片为外植体材料,研究植物生长调节剂配比对其愈伤组织诱导再生芽的影响,以建立离体再生体系。研究结果表明,露地菊‘神韵’在含NAA 1.0 mg · L^-1 + BA 1.0 mg · L^-1的MS培养基上获得了最高的再生芽分化率。利用已经克隆的‘津田’芜菁BrDFR基因构建非抗生素筛选的表达载体。以露地菊‘神韵’的无菌苗叶片为受体,通过农杆菌介导进行BrDFR基因的遗传转化。以载体的PMI基因为筛选标记,通过甘露糖筛选获得了‘神韵’的遗传转化再生植株。经过PCR验证和Southern杂交检测证实BrDFR基因已经整合到‘神韵’基因组中。     

露地菊离体再生体系建立及BrDFR基因遗传转化

以露地菊(Chrysanthemum morifolium)品种‘神韵’无菌苗叶片为外植体材料,研究植物生长调节剂配比对其愈伤组织诱导再生芽的影响,以建立离体再生体系.研究结果表明,露地菊‘神韵’在含NAA 1.0 mg·L-1+BA 1.0 mg· L-1的MS培养基上获得了最高的再生芽分化率.利用已经克隆的‘津田’芜菁BrDFR基因构建非抗生素筛选的表达载体.以露地菊‘神韵’的无菌苗叶片为受体,通过农杆菌介导进行BrDFR基因的遗传转化.以载体的PMI基因为筛选标记,通过甘露糖筛选获得了‘神韵’的遗传转化再生植株.经过PCR验证和Southern杂交检测证实BrDFR基因已经整合到‘神韵’基因组中.     

甜瓜α–甘露糖苷酶基因促进果实成熟功能的瞬时表达分析

 为了研究α–甘露糖苷酶（α-Man）基因在甜瓜果实成熟过程中的功能,应用农杆菌介导的瞬时表达技术,分别将含有甜瓜α–甘露糖苷酶基因超表达载体pPZP221-Man、两个RNAi载体pART-Man1和pART-Man2的农杆菌菌液注射至甜瓜绿熟期果实,通过观察果实成熟表型初步鉴定该基因的功能。结果表明,菌液浓度OD₆₀₀ = 1.2时果实表型比率最高,在果实蒂部表型居多。α–甘露糖苷酶活性测定结果显示,与非注射部位相比,注射超表达载体部位的组织α–甘露糖苷酶活性较高,而注射RNAi载体的组织α–甘露糖苷酶活性较低。RT-qPCR结果显示,与非注射部位相比,注射pPZP221-Man的部位α-Man基因表达约是对照的1.2倍,而注射pART-Man1和pART-Man2的部位α-Man基因的表达均有所下降,分别是对照的47%和37%。同时对甜瓜果实成熟相关的6个候选基因在注射部位的表达情况进行了分析,结果显示,这些基因在注射超表达载体的果实部位均上调表达;而在注射两种RNAi载体的果实部位均下调表达。这些结果表明甜瓜α–甘露糖苷酶基因在果实成熟过程中具有促进成熟的作用。     

欧李番茄红素β–环化酶基因ChLCYb的分离与功能鉴定

利用RACE技术和RT-PCR相结合,从欧李[Cerasus humilis(Bge)Sok]果实中克隆获得长度为1798 bp的番茄红素β–环化酶(lycopeneβ-cyclase)基因ChLCYb的cDNA全长序列,开放读码框为1515 bp,编码503个氨基酸。序列分析发现,ChLCYb具有植物LCYb保守区(Plant LCYb conserved region)、FAD/NAD(P)结合区(Dinucleotide-binding signature)、"Cyclase motif 1"、"Cyclase motif 2"和"lycopeneβ-cyclase motif"等典型结构特征,在N–端存在1~84个氨基酸残基组成的转运肽信号序列,在85~106、209~227、373~391和460~480氨基酸区域包含4个跨膜结构域。荧光定量PCR结果表明,ChLCYb在叶中表达量最高,其次是幼果,在根中最低;在欧李果实发育过程中,果皮中ChLCYb表达量高于果肉,果皮中ChLCYb表达量先升高,在花后90 d左右表达量最高,然后呈缓慢下降趋势,而果肉中ChLCYb表达量相对平稳。ChLCYb表达模式与果皮和果肉中β–胡萝卜素含量的积累呈显著正相关(r=0.824和r=0.712,P0.05)。利用大肠杆菌工程菌体系诱导表达了ChLCYb蛋白,并证实其可催化工程菌株中番茄红素向β–胡萝卜素转化,其转化效率达71.22%。在番茄中超量表达ChLCYb促进果实中番茄红素向β–胡萝卜素的转化和积累,转基因株系L-11号果实中的β–胡萝卜素含量高达692.18μg·g~(-1) DW,是非转基因对照的4.42倍。     

苹果MdCBL3基因的克隆与功能鉴定

从‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆MdCBL3(序列号:MDP0000155124),长852 bp。系统进化树分析表明,苹果MdCBL3与白梨亲缘关系最近。利用PlantCare数据库进行启动子顺式作用元件预测分析,MdCBL3启动子序列中存在干旱、低温、光、生长素、防御等响应元件。构建MdCBL3表达载体并利用农杆菌介导法侵染苹果愈伤组织和拟南芥。半定量RT-PCR证明MdCBL3在转基因愈伤组织中过量表达,在拟南芥中得到异源表达。表型分析发现,在盐胁迫中,与野生型相比,转基因愈伤组织和拟南芥成龄苗生长更好,盐胁迫的抗性更强。在拟南芥中异源表达MdCBL3,能提高拟南芥对干旱和低温的抗性。     

芹菜中类胡萝卜素合成相关番茄红素ε–环化酶基因AgLCYE的克隆与表达分析

番茄红素ε–环化酶（lycopene epsilon cyclase,LCYE）是类胡萝卜素合成途径中的关键酶。从‘津南实芹’中克隆获得番茄红素ε–环化酶基因AgLCYE。序列分析结果显示,AgLCYE包含1个1 590 bp的开放阅读框,编码529个氨基酸。氨基酸序列多重比对表明,芹菜和其他物种的LCYE同源性为77.68%,AgLCYE和同属伞形科的胡萝卜LCYE氨基酸序列同源性高达98.07%。AgLCYE蛋白与胡萝卜LCYE蛋白进化关系最近。AgLCYE蛋白属于亲水性蛋白,预测的蛋白质三级结构中有9个α螺旋和18个β折叠。无序化分析结果表明,AgLCYE编码的氨基酸序列有4个无序化区域。用UPLC方法对30、45和60 d龄芹菜叶中叶黄素和α–胡萝卜素的含量进行测定,30 d时叶黄素含量最高,45 d时最低,45和60 d时无显著性差异,叶片中的叶黄素含量均高于叶柄。芹菜叶片和叶柄中均没有检测到α–胡萝卜素的存在。荧光定量表达分析结果显示,随着生长期的增加,叶片中AgLCYE的相对表达量逐渐升高;叶柄中逐渐降低。     

芜菁花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与序列分析

将来自北京地区甘蓝和芥菜上的TuMV外壳蛋白基因片段分别克隆到pMD18-T载体中,测序并进行序列分析。结果表明:两者CP基因序列长度均为867个核苷酸,编码288个氨基酸,它们的核苷酸同源性为97·2%,氨基酸同源性为97.6%;两者与GenBank中的部分CP基因序列的核苷酸同源性在87.8%~97.8%之间,氨基酸同源性在91.7%~99.0%之间;分子进化树分析两者可归属World-B组。     

芜菁花叶病毒CP基因反向重复植物表达载体的构建及遗传转化

 针对芜菁花叶病毒外壳蛋白基因构建反向重复表达载体,利用农杆菌介导法将其导入四九菜心,PCR检测共获得13个阳性转化株,遗传转化效率为2%。     

龙眼ELF4同源基因的克隆与功能研究

以‘红核子’龙眼（Dimocarpus longan）叶芽为材料,克隆了ELF4同源基因DlELF4-1和DlELF4-2的cDNA全长序列,对序列进行了生物信息学分析,并通过转化拟南芥以及实时荧光定量PCR研究基因功能。蛋白序列比对结果表明,DlELF4-2与AtELF4-L1有较高相似度,而DlELF4-1与AtELF4相似度更高;构建两个基因的植物表达载体转化拟南芥,转基因植株都表现出延迟开花以及不定根生长的现象,表明DlELF4-1和DlELF4-2可能有抑制开花和促进生长素合成功能;DlELF4-1和DlELF4-2在龙眼花芽分化过程的表达模式不同,推测其在龙眼花芽分化过程中有不同的功能。     

库尔勒香梨9个新miRNA克隆鉴定

利用在小RNA高通量测序试验中筛选出的脱萼组与宿萼组差异表达新miRNA基因,采用 Stem-loop法对总体表达量居前20位、在脱萼组和宿萼组中具有显著性差异表达、在子房和萼片组织中具有显著性差异表达的新miRNA进行成熟体的克隆鉴定、前体序列二级结构分析、qRT-PCR试验以及靶基因预测。结果显示,在不同的样本中有9个新miRNA（novel_miRNA）的成熟体序列以及4个novel_miRNA的表达量与高通量测序结果完全一致,并且预测得到大量具有生物学功能的靶基因。新发现的miRNA可能与‘库尔勒香梨’萼片脱落和宿存有密切关系。     

‘白核’龙眼种子败育不同时期差异蛋白分析

 以‘白核’龙眼种子为试验材料, 比较两种蛋白质的提取方法, 确定了酚抽法提取龙眼种子蛋白。应用蛋白质组学研究技术, 分析了龙眼种子败育4个不同时期的蛋白质组变化, 共发现21个差异蛋白, 其中9个上调表达, 12个下调表达。通过MALD I/TOF /TOF2MS/MS质谱分析和蛋白质数据库检索, 共鉴定出12个差异蛋白, 分别为胞质苹果酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、磷酸甘油酸变位酶、RuBisCO大亚基结合蛋白α、β亚基、17 kD HSP、抗坏血酸过氧化物酶、胞质抗坏血酸过氧化物酶、半胱氨酸蛋白酶、Desication-related protein以及两个未知蛋白。这些鉴定出的差异蛋白质与能量和物质代谢、分子伴侣功能、自由基清除和抗氧化作用、细胞凋亡等生理过程密切相关, 可能参与了龙眼种子败育过程。     

矮牵牛ECE 支TCP 基因的克隆及表达分析

 ECE 支TCP 基因调控植物的分枝和花的对称性,但其功能在不同物种间存在差异。利用简 并PCR 法结合RACE 技术从矮牵牛（Petunia hybrida Vilm）GL8 自交系中获得了4 个矮牵牛ECE 支TCP 基因家族成员的全长cDNA 序列,分别命名为PhTCP1 ~ 4（登录号：JQ400104 ~ JQ400107）。cDNA 和 基因组序列分析表明,PhTCP1 ~ 4 分别编码406、332、341 和343 个氨基酸,PhTCP1 不含内含子,其 余3 个基因含1 ~ 2 个内含子。进化树分析发现,PhTCP1 ~ 4 分属于CYC1、CYC2 和CYC3 分支。荧光 定量PCR 分析表明,PhTCP1 ~ 4 均在成株期矮牵牛腋芽中优势表达,在不同节位腋芽中表现的表达趋势 各不相同,提示矮牵牛ECE 支TCP 基因可能主要与腋芽的生长发育相关     

苹果MdMYB2基因的克隆及功能鉴定

以‘嘎拉’苹果为材料,采用同源克隆和PCR技术分离了苹果基因MdMYB2(基因序列号:MDP0000823458)。MdMYB2的开放阅读框(ORF)长度为873 bp,编码含有290个氨基酸的蛋白,预测其蛋白质分子量为32.92 kD,等电点为4.91。系统进化树分析显示,苹果MYB2与梨MYBL2亲缘关系最近,同源性最高。组织表达分析表明,MdMYB2在苹果的各个组织均有表达,在茎和果实中表达相对较高。MdMYB2的表达明显受盐胁迫的诱导。构建了MdMYB2的表达载体,并通过农杆菌介导的遗传转化得到了转基因苹果愈伤和转基因拟南芥植株。抗性试验表明,过量表达MdMYB2明显提高了转基因苹果愈伤对盐胁迫的抗性。此外,异位表达MdMYB2也能提高拟南芥对盐胁迫的抗性,以上试验结果表明MdMYB2在植物盐胁迫响应中发挥重要作用。     

桂花C4H基因的克隆与表达特性分析

利用转录组测序获得的表达序列信息,结合RACE技术,从桂花（Osmanthus fragrans）花瓣中克隆到两个参与苯丙烷代谢第2步反应的肉桂酸–4–羟基化酶（C4H）基因。其ORF全长分别为1 518 bp和1 611 bp,各自编码505和536个氨基酸,命名为OfC4H1和OfC4H2（登录号分别为KR861466、KF254842）。系统进化树表明,OfC4H1与矮牵牛中的PhC4H1、PhC4H2等C4H蛋白聚为一类,属于Class Ⅰ类型;OfC4H2与金银花中的LjC4H等属于ClassⅡ类型。进一步的C4H蛋白序列多重比较发现,OfC4H1和OfC4H2蛋白具有该基因家族特有的保守结构域,在这些保守结构域中存在区别两类C4H蛋白的典型特征。利用Real-time PCR比较分析了OfC4H1和OfC4H2基因的时空表达模式,结果显示,OfC4H1在花瓣中的表达量最高;OfC4H2在花瓣中的表达量较低,在花梗、雌蕊和幼叶等组织中表达量较高。构建原核表达载体pET6xHN-C4Hs,转化Transetta（DE3）大肠杆菌并诱导表达的结果表明,目的蛋白能在原核表达系统中顺利表达,而且与预期大小一致,但因溶解度较低无法进行酶活性分析。