基于重组酶聚合酶扩增技术(RPA)的柑橘溃疡病菌检测方法

根据柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri ssp.citri,Xcc)基因组的保守序列设计特异引物,通过对引物浓度、反应温度和反应时间条件优化,建立了柑橘溃疡病菌重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)检测方法.该方法无需PCR仪等复杂设备,在39...     

赣南脐橙成熟采收期果实病害调查

2013—2015年果实成熟采收期,先后从江西赣州18个县(市、区)115个乡镇随机采集883份脐橙果实样品进行病原菌的分离和鉴定。结果表明,发现有柑桔青霉病菌Penicillium italicum、柑桔绿霉病菌P.digitatum、柑桔扩展青霉病菌P.expansum、柑桔炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides、柑桔干腐病菌Fusarium moniliforme、柑桔疫霉病菌Phytophthora citrophthora、柑桔黑腐病菌Alternaria citri、柑桔黑斑病菌Phoma citricarpa等8种病原真菌,以及柑桔溃疡病菌Xanthomonas axonopodis pv.citri、柑桔黄龙病菌亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus等2种病原细菌。其中,柑桔青霉病菌+柑桔绿霉病菌的检出率分别为40.7%,柑桔炭疽病菌的检出率为23.2%,柑桔溃疡病菌的检出率分别为7.0%,其余病原菌的检出率在0.1%~1.6%之间。赣南脐橙贮藏期,柑桔青霉病与绿霉病是重点防治对象,且要加强柑桔炭疽病的防治。     

柑桔溃疡病拮抗芽孢菌株的筛选及其控病作用

从贛州脐橙园脐橙根际土壤中获得192个细菌分离物,通过平板拮抗测试,筛选出对柑桔溃疡病菌Xanthomonas axonopodis pv.citri有较强拮抗作用的6个芽孢菌株,抑菌圈直径达12.0～25.0mm,其中菌株G32对柑桔溃疡病菌抑制效果最好,稳定性高;温室控病试验表明,菌株G32的控病效果最佳,接种溃疡病菌前喷施拮抗菌G32的预防效果达60.7%,接种溃疡病菌后喷施拮抗菌G32的治疗效果为53.2%;根据其形态特征、培养性状、生理生化特性及16SrDNA序列比对分析,将G32鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。     

应用Xanthomonas campestris pv.vesicatoria评价表面消毒剂检疫处理柑桔溃疡病的效果

1984年8月,在佛罗里达中部的苗木场里发现了柑桔溃疡病(Xanthomonas campestris pv.citri),这是该病自1933年被消灭以来在佛州的第一次报道。为防止溃疡病菌在柑桔果实上的扩散,本文评价了二价季铵化合物(n一烷基二甲基(艹卡)苄基氯化铵、n一烷基二甲基苄基乙基氯化铵)、氯、二氧化氯、SOPP(邻苯酚钠)、过醋酸(35％)等几种表面消毒剂对柑桔果实表面溃疡病菌(一个X.c.pv.vesicatoria株系和二个佛州X.c.pv.citri株系)的消毒效果。结果如下。 1.管内试验比较 三个病原菌株系对各种消毒剂反应相似。1微克/毫升氯或二氧化氯及Alcide混合物(1份次氯酸钠∶80     

基于STR位点对广东省柑橘溃疡病菌种群遗传结构的分析

柑橘溃疡病是柑橘生产上最严重的病害之一，由柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种（Xanthomonas citri pv. citri,Xcc）引起。为了全面系统地研究广东省柑橘溃疡病菌的种群遗传结构，通过比对分析已报道的中国8个柑橘溃疡病菌全基因组序列的串联重复位点（ShortTandemRepeat,STR），筛选出6个高度变异位点，对广东省的15个市（县）14个品种共352个柑橘溃疡病菌菌株进行遗传多样性分析。结果表明，基于遗传多样性和遗传距离对广东省不同地区的柑橘溃疡病菌株鉴定出6组类群：潮州和汕尾为Ⅰ组，梅州和河源为Ⅱ组，肇庆、广州、江门、佛山和惠州为Ⅲ组，阳江、茂名和湛江为Ⅳ组，云浮为Ⅴ组，韶关和清远为Ⅵ组。基于遗传多样性和遗传距离对广东省不同品种的柑橘溃疡病菌株鉴定出5组类群：沃柑、贡柑、朱砂橘、砂糖橘、茶枝柑、红江橙、马水橘为Ⅰ组，脐橙和柠檬为Ⅱ组，蕉柑、茂谷柑和春甜橘为Ⅲ组，沙田柚为Ⅳ组。     

柑橘AOS1-2的克隆及其响应溃疡病菌侵染的表达分析

对柑橘中茉莉酸（Jasmonic acid,JA）生物合成途径中的关键限速酶丙二烯氧化物合酶AOS家族基因进行注释,确定其受溃疡病菌Xanthomonas citri subsp. citri(Xcc)诱导的表达模式。从甜橙数据库中共注释出3个AOS家族成员,其中CsAOS1-2对溃疡病菌响应最强烈;CsAOS1-2在‘晚锦橙’（甜橙,易感溃疡病）和‘金弹’（金柑,抗溃疡病）中均受病原菌诱导,但在‘晚锦橙’中表达量上调幅度远高于金弹;CsAOS1-2全长2 656 bp,开放阅读框1 599 bp,编码532个氨基酸,分子量为59 499.81,为非分泌性蛋白,其349～510 aa为典型的P450功能域;Cs AOS1-2的表达无组织特异性;‘晚锦橙’和‘金弹’的AOS1-2启动子均含有参与植物激素和逆境应答的顺式作用元件,但在数量和类型上存在差异;烟草瞬时转化亚细胞定位分析显示CsAOS1-2定位在叶绿体中。CsAOS1-2强烈响应柑橘溃疡病菌的侵染,推测其与柑橘溃疡病敏感性具有密切的关系。     

四川柑桔溃疡病菌菌系研究

对从四川省7个县、市收集的39个柑桔溃疡病标样中分离到的16个菌株,经培养性状、形态特征、生理生化、噬菌体敏感性和致病性比较研究,证实均为野油菜黄单胞杆菌柑桔致病变种(柑桔溃疡病菌)[Xanthomonas campestris pv.citri(Hasse)Dye]。并根据它们对25个柑桔品种的致病力及严重感染葡萄柚,可以利用麦芽糖、乳糖和丙二酸盐,在36℃时都能生长的细菌学鉴别特征及其对柑桔噬菌体CP_1、CP_2敏感而对CP_3不敏感等特性,认为四川的溃疡病菌隶属于亚洲菌系即A菌系。     

柑桔溃疡病的侵染流行、预测和防治

柑桔溃疡病是一种细菌性病害,其病原为黄极毛杆菌,属柑桔溃疡病菌[Xanthomonas citri (Hasse)Dowson]。为了防治本病,日本有关人员做了大量工作,但至今仍无彻底的根治措施。虽曾有过用某种拮抗菌(Pseudomonas sp.)控制柑桔溃疡病的报道,但目前生产上仍以农业防治和药剂防治为主。现将日本关于该病的侵染流行规律、预测     

脐橙品种溃疡病抗性与叶片生理结构的相关性

以晚脐橙(Navelate navel orange)等11个脐橙品种的枳砧嫁接幼树为对象,在夏梢期人工接种从田间病叶上分离的柑桔溃疡病菌Xanthomonas axonopodis pv.citri后观察抗性,观测叶片生理结构,分析抗性与叶片生理结构参数的关系。结果表明,不同脐橙品种对溃疡病的抗性差异大,抗性与叶片气孔密度和海绵组织厚度关系密切。     

几种杀菌剂对伦晚脐橙柑橘黑点病的药效试验

正柑橘黑点病又称柑橘砂皮病或柑橘树脂病,由子囊菌门柑橘间座壳菌Dlaporthe citri(Fawcett)Wolf(无性态为柑橘拟茎点霉菌Phomopsis citri Fawcett)感染所引起。该病菌侵入到柑橘叶片、枝条后,会造成柑橘叶片枝条上布满黄褐色或黑色凸起斑点,在贮藏期会引起柑橘褐色蒂腐病。病菌以菌丝体在病组织和枯梢上终年     

柑橘CsNCED3-2的克隆及其响应溃疡病菌侵染的表达分析

柑橘溃疡病是世界柑橘的一种重要病害，对柑橘产业造成严重的经济损失。对柑橘中9–顺式–环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）基因家族进行注释，并克隆出受柑橘溃疡病菌诱导表达的CsNCED3-2，确定了其表达模式。从柑橘全基因组公共数据库共注释出14个NCED基因家族成员，根据系统发育树和功能结构域将其分为4个亚类；CsNCED3-2其序列全长2 377 bp，开放阅读框1 830 bp，编码609个氨基酸，属于RPE65超家族成员和类胡萝卜素双加氧酶家族成员，是非分泌性蛋白；在‘晚锦橙’和‘金弹’叶片注射溃疡病菌后的各个时间点，‘晚锦橙’叶片中CsNCED3-2的相对表达量总体高于‘金弹’，并且两品种的相对表达变化呈相反趋势；与茎、叶和种子相比，CsNCED3-2在两品种果皮中表达量较高；两品种的CsNCED3-2上游启动子均含有参与植物激素和逆境应答相关的顺式作用元件ABRE（脱落酸响应）、TCA-element（水杨酸响应）、MYC/MYB（干旱响应）等，但数量和类型存在差异。     

柑橘MAPK基因的生物信息及其响应溃疡病菌侵染的表达分析

为挖掘柑橘溃疡病抗性关键基因，对柑橘促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）基因家族进行注释和功能域分析，明确了CsMPK1、CsMPK3、CsMPK4、CsMPK6和CsMPK19的组织表达特异性和在抗病品种‘金弹’（Fortunella japonica Swingle）和感病品种‘晚锦橙’（Citrus sinensis Osbeck）中受病原菌（Xanthomonas citri subsp. citri，Xcc）诱导的表达情况；并对CsMPK19进行了生物信息分析。共注释出12个柑橘MAPK基因家族成员，根据系统发育树将其分为3个亚类，均含有促分裂原活化蛋白激酶（Pkinase）功能结构域。其中CsMPK1、CsMPK3、CsMPK4-1和CsMPK6在果实中表达水平较高，CsMPK19在叶片中表达量相对较高。CsMPK1的表达在溃疡病抗（感）品种中均受病原菌强烈诱导，且在感病品种中上调的幅度高于抗病品种；CsMPK3 和CsMPK6仅在感病品种中病原菌处理早期有较强烈的响应；CsMPK4-1和CsMPK4-2的表达在感病品种中受病原菌诱导上调，而在抗病品种中病原菌处理后低于水处理对照；CsMPK19的表达在抗（感）品种中均受病原菌强烈诱导，且在抗病品种中上调幅度更大。克隆了CsMPK19，其序列全长为1 824 bp，编码607个氨基酸，分子量为69 174.36 D，为非分泌性蛋白，其25 ~ 316 aa为典型的Pkinase功能域。晚锦橙和金弹MPK19启动子的顺式作用元件存在较大差异。结果表明柑橘MAPK基因强烈响应溃疡病菌侵染，推测CsMPK19在溃疡病抗性调节中有潜在应用价值。     

溃疡病菌侵染早期柑橘细胞程序性死亡的响应特征及机制

为进一步研究柑橘溃疡病抗性与细胞程序性死亡的关系， 以高感品种晚锦橙（甜橙类，Citrus sinensis Osbeck）和高抗品种金弹（金柑类，Fortunella crassifolia Swingle）为试材，从抗性特征、发病早期的相关信号变化、抗氧化酶活性和基因表达变化等方面探讨柑橘细胞程序性死亡响应溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri）侵染的特征及机制。接种溃疡病菌后，晚锦橙叶片出现明显的海绵状凸起，为典型的溃疡病症状；而金弹则出现超敏化反应细胞坏死症状。接种前，过氧化氢（H2O2）在金弹中的基础水平较晚锦橙高；接种后，两品种的H2O2含量均上升，但金弹上升幅度高于晚锦橙。随着H2O2水平升高，代表膜脂过氧化程度的丙二醛（MDA）含量在两个品种中均增加，但金弹中增加幅度更大。抗氧化酶系统中的超氧化物歧化酶（SOD）活性在晚锦橙和金弹叶片中均呈下降趋势；过氧化氢酶（CAT）活性在两个品种中均提高且差异不大；过氧化物酶（POD）活性在两个品种中均提高，但晚锦橙的上升更快，且提高程度低于对照。参与细胞程序性死亡正调控的基因CsCEP1-1、CsCEP1-2和CsMCA1在两个品种中均受溃疡病菌诱导上调表达，但金弹中的表达水平显著高于晚锦橙；参与细胞程序性死亡负调控的CsDAD1-1、CsDAD1-2、CsMLO2和CsMLO3的转录水平在晚锦橙中变化不大，而金弹中随着接种时间的延长逐渐降低。结果表明，溃疡病菌胁迫下晚锦橙和金弹在发病早期均启动了超敏化反应，但在金弹中更为强烈，有助于诱导发生细胞程序性死亡，而限制病原菌的生长，这可能是金弹抗病性强的内在原因之一。     

枸橼种质对柑橘溃疡病的抗性鉴定

柑橘溃疡病(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)是严重阻碍柑橘产业发展的世界性检疫病害,防控困难,选育抗病品种为防治溃疡病的唯一有效办法。枸橼C-05是柑橘属独特的抗溃疡病种质,为抗性机理和抗病育种提供了种质基础。为了进一步评价枸橼C-05的抗性,另外收集了13份枸橼种质,对其进行溃疡病的离体和活体抗性评价。叶片形态学观察表明,14份枸橼种质存在较大的形态学差异。采用离体与活体注射接种不同浓度的柑橘溃疡病菌,根据叶片的感病症状、病斑周围黄色晕圈大小等典型溃疡病症状,综合评价枸橼类种质的抗病性。结果表明:枸橼种质之间对溃疡病的抗性存在极大差异,溃疡病的抗性评价综合病情指数显示枸橼C-05、园香橼、矮果香橼、美国枸橼、普通枸橼和印度大果综合病情指数较小,表现为极抗病或抗病,其他枸橼种质表现不同程度的感病性;枸橼种质的抗病或感病性与其叶片形态特征无关。枸橼C-05和5个抗病枸橼种质对柑橘溃疡病具有针对性的抗性,这对进一步研究抗病机理和抗病育种具有重要意义。     

柑橘超量表达CsNBS-LRR通过SA信号途径增强对溃疡病抗性

克隆了柑橘CsNBS-LRR基因,分析该基因在柑橘溃疡病菌（Xcc）、水杨酸、茉莉酸甲酯诱导下的表达特征,通过在晚锦橙中超量表达验证其功能。结果表明,CsNBS-LRR的开放阅读框为3 633 bp,编码1 210个氨基酸。其在感病品种晚锦橙中受Xcc诱导下调表达,而在低感品种四季橘中上调表达;在四季橘中受水杨酸诱导明显上调表达,而晚锦橙中上调幅度较小;两品种CsNBS-LRR受茉莉酸甲酯诱导均不明显;超量表达载体转化晚锦橙获得4个阳性植株;抗性评价表明超量表达CsNBS-LRR明显提升了转基因植株对柑橘溃疡病的相对抗性（病情指数为野生型的75% ~ 88%）;转基因植株中水杨酸含量和水杨酸合成途径中关键基因转录水平明显提高;水杨酸信号途径中的PR基因转录水平也升高。综上所述,CsNBS-LRR是柑橘抗溃疡病的1个抗病基因,它可能通过对水杨酸途径的调控一定程度上增强柑橘对溃疡病抗性。     

柑橘种质抗柑橘蒂腐病菌扩展能力的评价

采用柑橘离体叶片和果实室内人工接种柑橘蒂腐病菌的方法建立柑橘种质抗柑橘蒂腐病菌扩展能力的评价方法,对不同柑橘种质进行抗扩展能力评价,并采用病情指数法、病斑平均直径法和聚类分析方法对柑橘种质进行抗性分级。3种分析方法均将73个柑橘种质划分为5类：高抗、抗病、中抗、感病和高感,未发现免疫种质。柠檬和柚子类种质大多数为高抗品种,甜橙类和宽皮橘类易感病。     

柑橘溃疡病抗性相关的SSR标记筛选

以抗柑橘溃疡病的‘宜昌橙2586’与易感病的‘岭南沙田柚’进行杂交,随机选取F₁ 代材料80 株,开展溃疡病抗性田间接种鉴定。鉴定结果表明,溃疡病抗性在F1 代分离明显,若将免疫和高抗类型均视为抗病,中抗、中感和感病类型均视为感病,则抗感的分离比例接近1︰1。采用集合分离分析法BSA (Bulked Segregant Analysis),结合SSR 分子标记技术,筛选到1 个与柑橘溃疡病抗性相关的分子标记CCR-110。利用F₁ 代分离个体和公认的抗感材料对标记进行验证分析,发现该标记表现较好的抗性相关性。F₁ 群体相关分析表明,该标记与柑橘溃疡病抗性的相关系数为0.79;采用最大似然法计算重组率为9.38%±3.5%,通过 Kosambi 函数将其转换成图距单位（cM）,遗传距离为9.11 cM;感病的甜橙类、柚类、枳类没有此标记,抗病的金柑类、宜昌橙类、香橙类、宽皮柑橘类的多数材料出现此标记。     

分泌型Cecropin B 抗菌肽基因转化血橙提高其抗溃疡病水平

 为了利用Cecropin B（CB）抗菌肽基因提高柑橘对溃疡病的抗性,人工合成了两个含有信 号肽的Cecropin B 抗菌肽基因PR1aCB 和AATCB。洋葱表皮瞬时表达分析表明,与非分泌型CB 抗菌肽 相比,PR1aCB 和AATCB 抗菌肽在细胞间隙中优势积累。进一步构建了CaMV 35S 调控 PR1aCB 和AATCB 基因的植物表达载体,转化塔罗科血橙（Citrus sinensis Osbeck）上胚轴,获得转基因植株。GUS 组织化 学染色、PCR 和Southern blot 分析表明外源基因已成功整合入柑橘基因组。Real-time PCR 定量分析表明, 抗菌肽基因在转基因植株中成功表达。柑橘叶片离体抗性分析表明,转PR1aCB 和AATCB 基因植株的抗 性显著强于非转基因植株,其抗性水平与高抗品种‘南丰蜜橘’（C. succosa Hort. Ex Tan）和‘四季橘’ （C. madurensis）相当。