月季RhNAC31互作蛋白的筛选及分析

为了进一步研究RhNAC31在胁迫响应中的作用机制,以RhNAC31蛋白为诱饵,利用酵母双杂交系统在切花月季‘萨曼莎’失水胁迫cDNA文库中进行了互作蛋白的筛选和分析。根据RhNAC31的转录激活区域(C端,157～286 aa)的序列特征,将其划分为C1(157～250 aa,RhNAC31-C1)和C2(251～286 aa,RhNAC31-C2)两段,分别构建到pGBKT7上检测其自激活活性及对酵母Y2H Gold细胞的毒性。结果显示,pGBKT7-RhNAC31-C1和pGBKT7-RhNAC31-C2对酵母Y2H Gold细胞均没有毒性,能激发金担子素A(Aureobasidin A,AbA)报告基因的表达,具有自激活活性,在含有400 ng·mL-1 Ab A的SD缺陷型培养基上其活性受到抑制,以含该浓度AbA的培养基作为筛选文库培养基。在此筛选条件下,在酵母双杂交文库中筛选到21个阳性克隆,对其测序并用Blast比对获得了16个与RhNAC31互作的候选蛋白。利用Uniprot网站对互作蛋白进行基因本体学分析,结果显示RhNAC31能够与RZFP34、MIEL1、RUB泛...     

纳米银对瓶插月季切花乙烯作用的拮抗效应

 以月季‘影星’（Rosa hybrida‘Movie Star’）切花为试材,用5、10和30 mg · L^-1纳米银（nano-silver,NS）溶液,0.5 mmol · L^-1硫代硫酸银（silver thiosulfate,STS）溶液和去离子水（对照）分别预处理花枝（长为25 cm）基端2 h后再移至去离子水中瓶插,之后用10 μL · L^-1外源乙烯处理24 h,观测切花瓶插期间的观赏品质,瓶插寿命,花径和花枝鲜样质量等指标的变化。结果表明：乙烯处理可加快切花失水凋萎及叶片脱落,并抑制花朵开放,而NS处理可显著减轻乙烯处理的不利影响,其中以30 mg · L^-1 NS处理效果最佳,该处理月季切花的瓶插寿命比乙烯处理延长7 d。另外,取月季切花的花朵（带5 cm花茎,无叶）进行上述试验,进一步证实乙烯处理可抑制花朵开放,而NS处理可显著减轻乙烯对花朵开放的抑制作用。     

月季RhRTE1 的克隆及其对乙烯响应特性分析

 利用数据库中已发表的拟南芥AtRTE1基因序列,从构建的月季花朵乙烯响应EST数据库中筛选得到一个RTE1同源片段,结合RACE技术,从月季切花品种‘Samantha’花瓣中克隆得到全长为1 233 bp的RTE1同源基因。该基因包含一个732 bp的开放阅读框、339 bp的5′非翻译区和162 bp的3′非翻译区,编码一个243 aa的肽链,其理论分子量为27.6 kD,等电点为6.87。该基因推定的氨基酸序列与拟南芥AtRTE1同源性较高,属于RTE家族中的第1组别基因,命名为RhRTE1。该基因在月季花朵自然开放中表达逐步增强,并能够被外源乙烯和切伤处理所显著诱导。将35S::GFP-RhRTE1融合蛋白转入拟南芥,发现RhRTE1蛋白主要定位于细胞膜上,并且转化植株降低了对乙烯的敏感性。以上结果说明RhRTE1可能参与了乙烯介导的月季花朵开放过程,并可能参与了花朵响应伤害的修复过程。     

节瓜CqWRKY31的互作蛋白筛选与鉴定

枯萎病是节瓜生产中的主要病害,节瓜抗性材料中CqWRKY31受致萎毒素镰刀菌酸(FA)胁迫诱导表达,为节瓜响应FA胁迫的正调控因子.为深入挖掘CqWRKY31的功能,本试验利用酵母双杂交技术筛选CqWRKY31的互作蛋白.试验结果显示,共得到45个与节瓜CqWRKY31有潜在互作关系的蛋白.通过进一步回转验证,发现42...     

月季切花乙烯受体ETR1 cDNA克隆及其序列分析*

 根据乙烯受体基因ETR1 保守区设计引物, 分别以瓶插寿命差异显著的月季切花品种‘德克萨斯’和‘维亚蒂’为材料, 通过RT-PCR 从花瓣中扩增出了797 bp 的cDNA 片段, 它编码265 个氨基酸。测序和序列分析表明,‘德克萨斯’重组质粒中插入片段的核苷酸序列之间完全相同, 命名为pRT-ETR1。而‘维亚蒂’所获得的重组质粒中插入片段的核苷酸和氨基酸序列之间存在差异, 同源性分别为85. 2 %和92. 1 % , 分别命名为pRV-ETR1-V4 和pRV-ETR1-V5。pRV2 ETR12V5 的核苷酸和氨基酸序列与‘德克萨斯’pRT2 ETR1 的同源性均达99 %以上; pRV-ETR1-V4 中的核苷酸和氨基酸序列与‘德克萨斯’pRT-ETR1 的同源性分别为85. 0 %和92. 5 %。上述插入片段与桃、苹果、天竺葵、拟南芥等植物的ETR1相应区域高度同源, 其氨基酸同源性均大于90 %。     

月季乙烯受体基因的全长克隆及原核表达分析

 利用已构建的月季花朵转录组数据库,筛选得到了22个与乙烯受体同源性较高的UniGene片段,并利用这些片段从月季花瓣中克隆得到了3个乙烯受体基因全长,分别为RhETR1、RhETR3和RhETR5。其中,RhETR1全长为2 814 bp,编码一个595 aa的肽链;RhETR3全长为2 468 bp,编码一个765 aa的肽链;RhETR5全长2740 bp,编码一个742 aa的肽链。这3个基因推定的编码蛋白分别与枣（Ziziphus jujuba）中的ZjETR1、杨树（Populus trichocarpa）中的PtETR2和砂梨（Pyrus pyrifolia）中的PpERS2同源性最高,依次为85.2%、75.8%和80.3%。蛋白同源性及结构分析表明,RhETR1和RhETR5分别与拟南芥中的ERS1和ETR1结构相似,属于第1亚家族成员,RhETR3与ERS2结构相似,属于第2亚家族成员。在花朵自然瓶插过程中,这3个基因分别表现为下调、上调和组成型表达。利用原核表达载体,选择和月季花朵开放最为相关的RhETR3,获得了和理论分子量一致的重组蛋白,表明克隆得到的RhETR3具有完整的读码框。     

乙烯对不同切花月季品种开花和衰老的影响

 以研究乙烯在月季切花开花和衰老进程中的作用为目的, 以14 个切花月季品种为试材, 首先探讨了乙烯和乙烯抑制剂处理对切花开花和衰老进程的影响。结果表明: 乙烯和乙烯抑制剂处理对不同乙烯变化类型切花月季品种的开花和衰老进程有不同的影响效果, 类似非跃变型切花‘唐娜小姐’表现出典型的非跃变型切花的特征, 但是类似跃变型品种和类似末期上升型品种却有复杂的表现, 分别表现为促进、抑制和不敏感。在此基础上, 探讨了乙烯和乙烯抑制剂处理对类似跃变型品种‘萨蔓莎’和‘红衣主教’、类似非跃变型品种‘唐娜小姐’以及类似末期上升型品种‘黄金时代’乙烯生成量的影响。结果表明: ‘萨蔓莎’和‘红衣主教’分别表现为乙烯的自我催化和自我抑制。乙烯和乙烯抑制剂处理对类似非跃变型品种‘唐娜小姐’的乙烯生成量无影响。类似末期上升型品种‘黄金时代’, 表现为典型的负反馈调节。这些结果说明月季切花对乙烯的反应非常复杂, 在开花衰老进程中呈现不同乙烯变化类型的品种对乙烯的反应差别很大, 不能简单地根据内源乙烯生成量的变化动态对不同的切花月季品种进行类型划分。     

月季切花开花和衰老进程中乙烯变化类型初探

以１４个生产用月季切花品种为试材，测定了开花和衰老过程中花朵的乙烯生成量和呼吸强度变化动态。结果表明：（１）乙烯生成量在萨蔓莎、天使、默西德斯、加布里拉和雅典娜５个品种表现为蕾期较低，随外层花瓣展开逐渐增大，在盛开期达到高峰，然后降低，变化动态类似于跃变型切花和跃变型果实；唐娜小姐品种在整个开花和衰老进程中一直保持在较低水平，类似于非跃变型切花和果实的变化动态；坦尼克、黄金时代、金徽章、金牌、红衣主教、红成功、玛丽娜等品种在蕾期较低，随着开花进程逐渐增大，至盛花后期花朵露心时仍在增加，类似于末期上升型果实的变化特点。（２）上述３个类型月季品种的呼吸强度在瓶插期间的变化趋势一致，即花蕾期相对较低，花朵充分展开前迅速升高并出现高峰，然后降低，呈现典型的呼吸跃变类型，同时，萨蔓莎和天使呼吸跃变高峰的出现都比类似乙烯跃变高峰的出现提前１～２天。说明月季切花乙烯生成量与呼吸强度的变化动态有很大不同     

切花月季Rh-DREB1基因的克隆及其在乙烯和失水胁迫下的表达

以切花月季Rosa hybrida 'Samantha'为试材,通过简并引物和RACE方法从花瓣中获得了两个逆境诱导转录因子DREB家族基因全长.推定的氨基酸序列分析表明,这两个基因都具有DREB1转录因子的典型特征,因而分别命名为Rh-DREB1A和Rh-DREBIB,GenBank登录号分别为EU784069和EU784070.Rh-DREB1A和Rh-DREB1B分别包含一个编码222和231个氨基酸序列的开放阅读框.半定量RT-PCR分析结果表明,Rh-DREB1A和Rh-DREB1B在月季花瓣中能够被失水胁迫强烈诱导,但是不受乙烯诱导.由所得结果推测,这两个转录因子参与了失水胁迫诱导的信号转导途径.     

利用酵母双杂交系统筛选金针菇DASH型隐花色素互作蛋白

提取金针菇（Flammulina filiformis）单核体菌株Dan 3菌丝的总RNA,分离纯化mRNA,合成双链cDNA,依次构建酵母双杂交初级和次级cDNA文库。通过酶切连接法构建诱饵载体pGBKT 7-CRY,其无自激活活性和毒性,与构建的次级cDNA文库共转化酵母感受态细胞,筛选与金针菇DASH型隐花色素（FfCRY-DASH）互作的蛋白,对筛选到的6个蛋白进行回补验证,最终发现一个与金针菇DASH型隐花色素互作的蛋白。     

欧洲葡萄VvJAZ9基因互作蛋白的筛选与验证

【目的】探究葡萄JAZ家族基因特点及在低温胁迫下的表达情况,以期筛选出与低温胁迫相关的家族成员,并进一步筛选其互作蛋白,为后续葡萄抗寒机制研究提供理论依据。【方法】以拟南芥和葡萄基因组数据为基础,获得葡萄JAZ家族成员基因并进行同源克隆、染色体定位、理化性质以及蛋白家族聚类等分析,利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术分析VvJAZ家族成员基因在低温胁迫下的表达情况,应用酵母双杂交技术进行互作蛋白筛选和验证,并通过双分子荧光互补试验验证候选互作蛋白与VvJAZ9蛋白的互作关系。【结果】葡萄中有11个JAZ家族基因,随机分布于7条染色体上,都具有JAZ家族蛋白中特有且高度保守的TIFY和Jas结构域,均属于碱性不稳定亲水蛋白;聚类分析表明,葡萄JAZ家族蛋白可分为3个亚族,其中VvJAZ9与拟南芥AtJAZ1和AtJAZ2的亲缘关系最近,VvJAZ1与VvJAZ11、VvJAZ5与VvJAZ6同源关系最近。qRT-PCR结果表明,VvJAZ9是葡萄JAZ家族成员基因中受低温诱导表达最为明显的1个基因。通过酵母双杂交试验筛选获得2...     

利用Y2H筛选西方烟中与苹果茎痘病毒CP互作的蛋白

苹果茎痘病毒（apple stem pitting virus,ASPV）是苹果和梨树上普遍发生的潜隐病毒之一,西方烟（Nicotianaoccidentalis）是其重要的草本寄主之一。在本研究中,构建了酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CP(CP-BD),并从西方烟cDNA文库中筛选与ASPV CP互作的蛋白。经通过酵母双杂交回转验证和NCBI BLAST比对,获得30种可能与ASPV CP互作的西方烟蛋白质,为研究ASPV侵染致病的分子机制及CP在侵染过程中的功能打下基础。     

山葡萄转录因子VaMYB4a互作蛋白的筛选与鉴定

以抗寒种质山葡萄(Vitis amurensis Rupr.)‘左山–1’叶片组织为试材,通过Gateway技术构建酵母均一化cDNA文库,库容量为1.36×10⁷ cfu·mL^-1,外源基因插入片段均大于1 kb,重组率为100%,符合后续试验要求。以VaMYB4a^113-252C端调控区段为诱饵,经酵母双杂交筛选获得17个候选互作蛋白,选取2个与非生物胁迫应答密切相关的候选互作蛋白分别在酵母、拟南芥原生质体中进行互作验证,发现锌指类转录因子VaCOL4、VaCOL5均与VaMYB4a全长及VaMYB4a^113-252存在互作关系。经系统进化与蛋白保守结构域分析,推测葡萄COL基因家族中VaCOL2与VaMYB4a具有潜在互作关系,进而通过BiFC验证表明,VaCOL2与VaMYB4发生蛋白互作;顺式作用元件预测表明VvCOL2、VvCOL4与VvCOL5启动子区包含多个激素及逆境应答相关元件,其中VvCOL2包括多个低温响应元件(LTRE);低温胁迫下,VaMYB4a、VaCOL4与VaCOL5...     

PPOH延缓月季切花开花和衰老的研究

ＰＰＯＨ（顺式丙烯基膦酸）处理切花月季萨蔓莎品种,降低了乙烯生成量和盛开前的花茎增大率,增大了花朵开放直径;增加了盛开前花枝的鲜重,盛开期间保持了较高的吸水量与失水量比值;瓶插至盛开期和盛开持续期均显著延长。乙烯生物合成抑制剂ＡＯＡ（氨氧基醋酸）处理效果与ＰＰＯＨ相近,但因花朵“蓝变”使盛开持续期有所缩短。乙烯作用抑制剂ＳＴＳ（硫代硫酸银）处理增大了花径,显著延长了盛开持续期和瓶插寿命。ＰＰＯＨ和ＡＯＡ处理红衣主教品种,降低了乙烯生成量,ＳＴＳ处理则使之增加,但是都没有延缓开花和衰老的效果。推测ＰＰＯＨ延缓萨蔓莎开花和衰老是通过降低乙烯生成而起作用的。     

7个苹果KNOX转录因子基因克隆、表达和蛋白互作分析

【目的】KNOTTED1 like homeobox(KNOX)蛋白在植物生长发育等多个生物学过程中发挥着重要作用。以紫弘富士为材料,分离了多个苹果（Malus domestica）KONX基因,研究其结构域、进化分析、组织表达、非生物胁迫响应及其与MdOFP相互作用情况。【方法】使用RT-PCR技术克隆获得7个MdKNOX基因并进行生物信息学分析。利用Array技术检测MdKNOX基因在苹果不同组织中的表达模式。使用RT-qPCR技术检测MdKNOX基因在盐胁迫和渗透胁迫下的表达模式。通过Y2H实验检测了MdKNOX蛋白与MdOFP蛋白的互作情况。【结果】测序结果表明,获得了7个KNOX转录因子cDNA:MdKNOX1、MdKNOX2、MdKNOX5、MdKNOX10、MdKNOX13、MdKNOX16和MdKNOX22(GenBank登录号：MG021644～MG021650)。结构域分析表明,获得的7个MdKNOX蛋白序列均含有MEINOX、HD和ELK结构域。进化分析表明,MdKNOX1、MdKNOX2和MdKNOX5属于KNOXⅡ亚组;MdKNOX10、MdKNOX13、Md...     

甘蓝MLPK的原核表达及其互作蛋白分离体系的建立

M–位点受体激酶（MLPK）是甘蓝自交不亲和反应的正向调控关键元件,其参与自交不亲和反应的分子机制尚不明确。为了分离与MLPK相互作用的蛋白,在分析了MLPK功能域的基础上采用PCR技术扩增了MLPK激酶结构域编码序列（记为MLPKK）,通过体外定点突变技术构建了两种MLPK失活突变体（记为mlpk1和mlpk2）,然后以pET43.1a为载体构建了原核表达质粒pET43.1a-MLPKK、pET43.1a-mlpk1和pET43.1a-mlpk2,并进行了原核表达和纯化。纯化的融合蛋白pET43.1a-MLPKK、pET43.1a-mlpk1和pET43.1a-mlpk2分别与高度自交不亲和甘蓝‘A4’柱头总蛋白提取液进行孵育,孵育后利用融合蛋白序列中的6× His标签与Ni+结合的特性,钓取MLPK的互作蛋白,建立了分离MLPK互作蛋白的新方法。孵育产物经SDS-PAGE电泳显示,与两个突变体蛋白泳道对比,在pET43.1a-MLPKK与柱头总蛋白提取液孵育产物的泳道中成功获得了候选的与MLPK互作的蛋白条带,这为后续互作蛋白质谱鉴定以及功能解析提供了技术支持。     

柑橘抗溃疡病转录因子CsAP2-09互作蛋白筛选与分析

以前期获得的柑橘抗溃疡病的正调控转录因子基因CsAP2-09超表达植株为材料,利用GST融合蛋白沉降技术(GST pull-down)联合液相色谱串联质谱(LC–MS/MS)方法筛选并鉴定CsAP2-09的互作蛋白。首先原核表达并纯化GST-CsAP2-09作为诱饵蛋白,然后与CsAP2-09超表达植株叶片总蛋白孵育、洗脱后进行SDS-PAGE验证,最后进行LC–MS/MS鉴定。得到17个互作蛋白,将蛋白进行注释、GO分析、KEGG分析,发现其中5个可能与植物抗病相关(如过氧化氢酶Cs3g27280)。构建这17个蛋白的互作网络,其中14个蛋白的互作关系得到已有数据的支持。对CsAP2-09与互作蛋白的共表达分析发现CsAP2-09超表达引起了16个蛋白表达上调和1个蛋白表达下调。     

温度、丙烯和1-MCP对西洋梨果实乙烯合成和乙烯受体ETR1同源基因表达的影响

研究了贮藏温度、丙烯和 1 MCP (1-甲基环丙烯 )处理对帕斯—卡桑 (Passe -Crassane)西洋梨果实成熟的影响。结果表明 :低温可促进果实的乙烯合成 ,未经低温处理的果实 ,用丙烯处理 ,不能正常合成乙烯。丙烯促进乙烯合成的效应随冷藏时间延长而增强。1 MCP处理可抑制冷藏果实的乙烯合成。定量PCR分析结果表明 ,果实中乙烯受体ETR1同源基因的表达不受低温的调节 ;但冷藏后升温或升温后用丙烯处理时 ,mRNA含量降低     

月季抗黑斑病品种的鉴定与筛选

对15个月季引进品种进行黑斑病发病情况的观测,分析不同月季品种抗黑斑病的差异,筛选出抗黑斑病强的品种。结果表明:6月份为月季黑斑病发病初期,10月份达到高峰;通过月季抗黑斑病的鉴定,15个品种中1个为高抗品种(HR),1个为中抗品种(MR),2个为低抗品种(LR),6个为感病品种(CS),5个为严重感病品种(SS)。     

山葡萄低温诱导酵母双杂三框cDNA文库构建和VaCIPK18互作蛋白筛选鉴定

类钙调磷酸酶B亚基蛋白CBL(calcineurinB-likeprotein)与其互作蛋白激酶CIPK(CBL-interacting protein kinase)组成的CBL-CIPK系统,在真核生物钙信号转导及各种胁迫应答途径中发挥重要作用。采用SMART与LD-PCR技术构建了山葡萄‘双丰’(Vitis amurensis Rupr.‘Shuangfeng’)叶片组织低温胁迫下的均一化酵母双杂交三框cDNA文库,库容量分别为1.7×106、1.3×10⁶与1.9×10⁶cfu·mL(-1),外源基因插入片段长度约为500～2 000 bp,重组率为100%,符合后续双杂交筛选要求。以本课题组前期鉴定受低温诱导表达、具有核质亚细胞定位的山葡萄VaCIPK18全长(VaCIPK18)、激酶结构域缺失(VaCIPK18^△S_TKc)以及NAF结构域缺失(VaCIPK18^△NAF)为诱饵,进行酵母双杂交筛选,获得了17个候选互作靶蛋白;从中选取并克隆了7个参与非生物胁迫的候选互...