月季RhRTE1 的克隆及其对乙烯响应特性分析

 利用数据库中已发表的拟南芥AtRTE1基因序列,从构建的月季花朵乙烯响应EST数据库中筛选得到一个RTE1同源片段,结合RACE技术,从月季切花品种‘Samantha’花瓣中克隆得到全长为1 233 bp的RTE1同源基因。该基因包含一个732 bp的开放阅读框、339 bp的5′非翻译区和162 bp的3′非翻译区,编码一个243 aa的肽链,其理论分子量为27.6 kD,等电点为6.87。该基因推定的氨基酸序列与拟南芥AtRTE1同源性较高,属于RTE家族中的第1组别基因,命名为RhRTE1。该基因在月季花朵自然开放中表达逐步增强,并能够被外源乙烯和切伤处理所显著诱导。将35S::GFP-RhRTE1融合蛋白转入拟南芥,发现RhRTE1蛋白主要定位于细胞膜上,并且转化植株降低了对乙烯的敏感性。以上结果说明RhRTE1可能参与了乙烯介导的月季花朵开放过程,并可能参与了花朵响应伤害的修复过程。     

月季切花乙烯受体RhETR3互作蛋白RhTSPO1的筛选和鉴定

利用已构建的月季分裂泛素酵母双杂文库,以月季乙烯受体蛋白RhETR3为诱饵,筛选能够与RhETR3结合的互作蛋白。经酵母回转验证共得到26个阳性克隆。在候选蛋白中发现一个TspO/MBR蛋白家族的成员,命名为RhTSPO1。通过RACE分离了RhTSPO1基因全长,共777 bp,开放阅读框（ORF）为579 bp,编码192个氨基酸。在酵母中,利用酵母生长和β–半乳糖苷酶活性（β-gal）验证了RhETR3和RhTSPO1之间确实存在互作。将RhETR3-GFP和RhTSPO1-mCherry融合蛋白共转入烟草,激光共聚焦显微镜观察发现RhTSPO1和RhETR3蛋白共同定位于内质网上。月季花朵自然开放过程中,RhTSPO1在花瓣中的表达呈现先增强后减弱的趋势,与开放和衰老过程紧密联系,表明RhTSPO1可能参与了花朵开放过程。本试验结果表明乙烯受体蛋白水平的互作调节可能也参与月季花朵开放和衰老的调节。     

枇杷7个脱水素基因表达差异分析

为进一步明确枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）中不同脱水素基因家族成员（EjDHN）的功能和响应机制,以白沙枇杷品种‘宁海白’为试材,分析了7个EjDHN基因在不同器官、果实发育期及ABA和干旱胁迫条件下的表达模式。结果表明,EjDHN5在各器官中表达量都比较高,EjDHN4主要在花中表达,EjDHN2、EjDHN3、EjDHN6和EjDHN7主要在茎中表达。在果实发育过程中,除EjDHN3外,其他家族成员均与种子发育有关;而EjDHN2和EjDHN5在果肉中表达量较高且与果肉发育有关。7个EjDHN基因在枇杷叶片中的季节性表达变化趋势基本一致,均在冬季表达量最高,而EjDHN1、EjDHN2、EjDHN4和EjDHN5在初夏也有较高的表达量。在干旱胁迫后,叶片中7个EjDHN基因的表达均出现显著增强趋势,其中EjDHN6增幅最大。各基因对ABA处理也有不同响应,以EjDHN6最为敏感。     

月季Rh-ADF1基因在花瓣扩展中响应乙烯的表达特性分析

 为探讨肌动蛋白解聚因子（actin depolymerizing factor,ADF）是否参与乙烯对月季花瓣细胞扩展的调节,以切花月季‘Samantha’为试材,从花瓣中分离到响应乙烯的ADF基因,并将其命名为Rh-ADF1,在GenBank中的登录号为JN048105。推定的氨基酸序列分析表明,Rh-ADF1的开放阅读框长度为423 bp,编码140个氨基酸。半定量RT-PCR分析结果表明,Rh-ADF1在花朵的各个器官中均有表达,在花瓣中略高于其他器官;该基因表达能够被乙烯处理强烈诱导升高,被乙烯作用抑制剂1-MCP（1-Methylcyclopropene）处理明显降低。在洋葱表皮细胞中进行的瞬时表达分析表明,Rh-ADF1蛋白分布在整个细胞中,主要与actin组成的微丝网络结合。据此推测,Rh-ADF1基因在转录水平上参与乙烯对花瓣扩展的调节,乙烯可能通过Rh-ADF1基因调控了花瓣细胞骨架的动态变化,进而影响花瓣细胞扩展和形态变化。     

小苍兰ACC合成酶基因FhACS1在花中的时空表达特征

 研究了小苍兰‘上农金皇后’ACC合成酶基因FhACS1在花中的时空表达特征。结果表明,FhACS1基因在花朵不同器官、花朵的不同发育阶段以及瓶插期间在花朵不同器官中的表达量均存在明显的差异。FhACS1基因在花朵不同器官的表达量由高到低为：雄蕊 > 花瓣 > 雌蕊。不同发育阶段中FhACS1基因的表达特征表现为：花朵完全开放（0级）时表达量最高,大部分开放（1级）时次之,完全衰老花朵（–2级）中的表达量最低。将小苍兰鲜切花用蒸馏水瓶插,取花序上自基部起第3朵和第6朵小花为材料,研究了FhACS1基因随瓶插时间的表达谱,结果表明FhACS1基因在第6朵小花中的整体表达量显著高于第3朵。第3朵小花中FhACS1基因在花瓣、雄蕊、雌蕊中的表达均表现为先上升后下降,但最大表达量的出现时间存在差异;FhACS1基因在整朵花中的表达量变化与在花瓣中一致。第6朵小花花瓣中FhACS1基因的表达量持续上升,在雄蕊、雌蕊中的表达量则先上升后下降,达到最大表达量的时间分别为第3天和第6天;在整朵花中的表达变化也与在花瓣中的变化趋势一致。     

葡萄VvACO1的表达及在拟南芥和番茄中的遗传转化

采用RT-PCR方法从葡萄（Vitis vinifera）叶片中克隆到1个ACC氧化酶（ACC Oxidase,ACO）基因,命名为VvACO1。序列分析表明,VvACO1的开放阅读框长度为957 bp,编码318个氨基酸,具有亮氨酸拉链、Fe²⁺结合基序和抗坏血酸结合位点等ACO蛋白的典型结构域;与烟草和番茄的ACO蛋白的相似度分别为87%和84%。组织特异性及乙烯诱导表达结果表明,VvACO1在葡萄叶片、卷须、幼茎、果实、花序、须根以及腋芽等组织中差异表达,并受到乙烯利的诱导上调表达。过表达VvACO1的番茄开花期及果实成熟期提前,过表达VvACO1的拟南芥叶片光合效率和叶绿素a的荧光强度明显下降。     

月季乙烯受体基因的全长克隆及原核表达分析

 利用已构建的月季花朵转录组数据库,筛选得到了22个与乙烯受体同源性较高的UniGene片段,并利用这些片段从月季花瓣中克隆得到了3个乙烯受体基因全长,分别为RhETR1、RhETR3和RhETR5。其中,RhETR1全长为2 814 bp,编码一个595 aa的肽链;RhETR3全长为2 468 bp,编码一个765 aa的肽链;RhETR5全长2740 bp,编码一个742 aa的肽链。这3个基因推定的编码蛋白分别与枣（Ziziphus jujuba）中的ZjETR1、杨树（Populus trichocarpa）中的PtETR2和砂梨（Pyrus pyrifolia）中的PpERS2同源性最高,依次为85.2%、75.8%和80.3%。蛋白同源性及结构分析表明,RhETR1和RhETR5分别与拟南芥中的ERS1和ETR1结构相似,属于第1亚家族成员,RhETR3与ERS2结构相似,属于第2亚家族成员。在花朵自然瓶插过程中,这3个基因分别表现为下调、上调和组成型表达。利用原核表达载体,选择和月季花朵开放最为相关的RhETR3,获得了和理论分子量一致的重组蛋白,表明克隆得到的RhETR3具有完整的读码框。     

抗坏血酸提高月季切花失水胁迫耐性与增加APX活性的关系

 以‘Samantha’品种为试材, 确定了适宜的抗坏血酸(AsA) 预处理浓度, 探讨了AsA和抗坏血酸过氧化物酶(APX) 抑制剂(对氨基酚, β-aminophenol) 预处理对花瓣中相对电导率、AsA含量以及APX活性的影响。与未经失水胁迫的切花月季相比较, 失水胁迫处理抑制切花的开放进程, 缩短了瓶插寿命。AsA 1 000 mg·L ^{- 1}预处理可有效地改善花朵的开放状况, 显著降低花瓣中相对电导率的增加, 明显提高花瓣中AsA的含量和APX活性。500 mg·L ^{- 1} β-aminophenol预处理则起到相反的效应。结果说明,AsA对‘Samantha’月季切花失水胁迫耐性的改善与花瓣中APX活性的提高相联系。     

核桃Y2SK2型脱水素基因JrDHN的克隆、表达和单核苷酸多态性分析

采用RT-PCR和RACE技术从‘香玲’核桃（Juglans regia L.‘Xiangling’）叶片中克隆了1个脱水素基因JrDHN（GenBank 登录号KC503061.1）,其全长1 056 bp,具有528 bp的开放阅读框,编码175个氨基酸组成的多肽,具有LEA家族成员的特征多肽序列,属于典型的Y₂SK₂型脱水素。以核桃18S基因为内参,对‘香玲’核桃JrDHN在4 ℃胁迫下的表达模式进行了初步的研究,结果表明低温诱导下叶片中JrDHN的表达增加,4 ℃处理4 h后达到最大值;自然越冬条件下,花芽中JrDHN表达量呈先上升后下降的趋势,在12月份表达量最高,推测JrDHN在核桃对低温胁迫响应中发挥重要功能。‘香玲’JrDHN在雌花中表达量高,其次是叶片和树皮,在花芽中最低。单核苷酸多态性分析JrDHN序列中有30个SNPs位点和11个Indels;单倍型分析显示12份核桃材料可分为10个单倍型,单倍型多样性为0.9697。     

低夜温下番茄ABA缺失突变体和野生型叶片中miRNA差异表达分析

为揭示番茄叶片中miRNA对非生物胁迫的响应机制,以番茄ABA缺失突变体sit和野生型番茄RR为试验材料。采用实时荧光定量（qRT-PCR）技术检测叶片中6个miRNA（miR160、miR162、miR166、miR1919、miR397和miR6026）及其预测的靶基因在夜间低温和喷施外源ABA逆境胁迫下的表达情况。结果表明,在15 ℃夜温（对照）下,sit的ABA含量是60 ng · g^-1,RR是120 ng · g^-1,sit叶片的保卫细胞和气孔的开度都明显大于野生型RR,ABA缺失突变体sit中miRNA的表达量与野生型RR相比都显著下调,其靶基因除miR1919外,表达量都上调;夜间低温（6 ℃）处理12 h后,所有miRNA在sit中比RR中的表达量都显著增加;喷施80 mg · L^-1的ABA后,sit中miR162、miR166、miR1919及miR397比0 mg · L^-1 ABA处理的表达量显著上调。推测miR160、miR162和miR6026通过依赖ABA信号途径参与夜间低温胁迫。     

异源表达拟南芥赤霉素2–氧化酶基因对矮牵牛形态发育的影响

拟南芥赤霉素2–氧化酶基因AtGA2ox1在矮牵牛（Petunia hybrida）中过量表达导致转基因植株开花延迟,株形明显矮化,花冠变小,花冠表皮细胞变小,但花色变化不明显。施用多效唑对矮牵牛花冠的影响与过量表达AtGA2ox1一致。用拟南芥茎特异性表达基因At3g56700的启动子驱动AtGA2ox1在矮牵牛中表达时,转基因植株的表型变化在株系间存在明显的差异,但外源基因在茎中的表达量都明显高于叶和花中的,果实和种子的发育未受影响,通过对转基因后代的筛选可以获得株形矮化,其它性状的发育受影响较小的转基因株系。     

苹果SUPERMAN家族基因的组织特异表达及MdSUP3的功能分析

通过半定量RT-PCR分析SUPERMAN家族基因在‘富士’苹果（Malus × domestica Borkh.‘Fuji’）叶芽、幼叶、花芽、花蕾、花、皮部组织和幼果中的表达模式,通过MdSUP3自主启动子驱动的GUS基因表达和MdSUP3异位表达分析其功能。结果表明,MdSUP3、MdSUP11和MdSUP9a在所检测的组织器官中均有表达,MdSUP9b主要在营养器官中表达,MdSUP5a、MdSUP1b主要在生殖器官中表达。MdSUP3启动子驱动GUS基因在植株根尖、幼叶、幼茎和花等器官中表达。超表达MdSUP3的转基因烟草植株矮化、节间缩短、叶片卷缩、花器官颜色改变和部分花器官形态异常;与对照相比,转基因烟草中ABA合成酶基因NtNCED3-2,花青素合成途径的NtDFR2和NtANS1基因表达显著上升,细胞分裂素氧化酶基因NtCKX和赤霉素氧化酶基因NtGA2ox4表达显著下降。异位过量表达删除C端DLELRL基序的MdSUP3基因不影响转基因烟草的生长发育,证明DLELRL是基因必不可少的功能域。     

乙烯和葡萄糖处理对‘洛阳红’牡丹切花花色和花青素苷合成的影响

以‘洛阳红’牡丹（Paeonia suffruticosa‘Luoyanghong’）切花为试材,研究10 μL ? L-1乙烯处理、1 μL ? L-1乙烯抑制剂1-MCP处理、90 g ? L-1葡萄糖处理、90 g ? L-1葡萄糖 + 10 μL ? L-1乙烯复合处理对切花花色和花青素苷含量的影响,以蒸馏水处理为对照。研究结果表明：乙烯处理的切花花色明度增加,红度和彩度下降,花瓣花青素苷含量下降;1-MCP处理与对照无显著差异;葡萄糖处理花色明度下降,红度和彩度增加,花瓣花青素苷含量增加;葡萄糖乙烯复合处理对切花花色及花青素苷积累也有明显改善与促进作用。对花青素苷合成相关基因表达量分析的结果表明,乙烯处理对基因表达有抑制作用,而葡萄糖处理有显著的正调控作用,葡萄糖乙烯复合处理则显著缓解了单独乙烯处理对基因表达的负调控作用。葡萄糖信号和乙烯信号之间一定程度上存在互作,葡萄糖缓解了乙烯对牡丹切花花青素苷合成的抑制作用。     

石榴花发育相关基因PgAGL11的克隆及功能验证

以‘突尼斯软籽’石榴为试材,对雌蕊败育的原因及关键时期、PgAGL11序列特征及功能进行研究。石蜡切片观察结果表明,雌蕊败育的原因为胚珠内珠被原基形成后停止发育,胚珠败育的关键时期为花蕾纵径8.1~15.0 mm时;采用TA克隆得到PgAGL11全长CDS序列696 bp,系统进化分析发现其与拟南芥的AGL11序列相似性最高;实时荧光定量PCR结果显示,PgAGL11在雌蕊中表达量显著高于其他花器官,且在胚珠败育关键时期(花蕾纵径8.1~15.0 mm),可育花雌蕊中表达量极显著高于败育花雌蕊;构建PgAGL11过量表达载体,利用农杆菌介导法侵染野生型拟南芥,转基因拟南芥花表现为雄蕊变短,花瓣变小,花柱变长,柱头表面乳突状物质变长。本研究确定了石榴雌蕊败育的关键原因及时期,并初步证明了PgAGL11可能在石榴雌蕊败育过程中发挥重要作用。     

K+/H+逆向转运体基因PpeKEA在桃开花期的表达及对钾肥施用的响应

从‘霞晖8号’桃花中克隆并鉴定了6个K+/H+逆向转运体基因PpeKEA,在转录水平分析其在桃花发育不同时期的表达模式及对钾肥施用的响应,明确关键基因并验证其功能。结果表明,钾肥施用显著增强盛花期桃花的鲜样质量,提高花朵钾素富集水平。PpeKEA1 ~ PpeKEA6在桃花开放不同时期的表达水平存在差异,均在盛花期达到最高,其转录水平对施用钾肥的响应不同;PpeKEA1在整个桃花开放不同时期的表达量较高,钾肥处理显著增强其在花蕾膨胀期和初开期的表达并抑制其在败落期的表达量;表达载体pDR196-shortKEA1能赋予酵母菌感受态细胞AXT3突变体适应高钾环境而正常生长,说明PpeKEA1的C端区域具有调节桃花组织内K+转运和平衡的功能。本研究表明PpeKEA1是一个桃花开放过程中调节K+平衡的K+/H+逆向转运体,并可能在桃树钾素营养的动态平衡中起着重要作用。     

乙烯对‘班克海尔’和‘杨妃出浴’芍药切花开放和衰老的影响

以‘班克海尔’和‘杨妃出浴’芍药切花为试材,研究了乙烯利处理对切花开放和衰老的影响;同时从中克隆得到乙烯生物合成和信号转导的9个关键基因PlACS、PlACO、PlACO5、PlETR1、PlERS1、PlETR2、PlEIN4、PlCTR1和PlEIN3,利用qRT-PCR分析这些基因的表达模式。结果表明：‘班克海尔’正常瓶插寿命长于‘杨妃出浴’,两品种均对乙烯敏感;乙烯利明显促进‘班克海尔’花朵开放和衰老进程,抑制‘杨妃出浴’花朵开放进程,并且出现僵花、衰老萎蔫。基因序列分析表明,乙烯合成和信号转导基因在两种切花品种中高度保守,保守性在98%以上。qRT-PCR分析表明,瓶插12 ~ 36 h,乙烯诱导两品种中除PlEIN3外的所有基因上调。瓶插0 ~ 12 h,‘杨妃出浴’中9个基因表达量均较高,内源乙烯合成和乙烯信号转导较为活跃,而在24 ~ 36 h,外源乙烯使‘班克海尔’乙烯生物合成基因表达量升高,乙烯信号转导基因表达量普遍高于‘杨妃出浴’。推测‘杨妃出浴’自身合成乙烯的时间较早,对乙烯的反应比‘班克海尔’更为敏感,‘班克海尔’乙烯反应类型可能为末期上升型,而‘杨妃出浴’为乙烯跃变型;两种芍药切花对乙烯的敏感程度以及花朵开放和衰老进程不同,可能与其乙烯生物合成和信号转导相关基因表达模式不同有关。     

乙烯和1-MCP的竞争性作用对月季花器官乙烯生成量及相关基因表达的影响

 以探讨月季切花不同花器官的乙烯生物合成和对乙烯的感受为目的,以切花月季‘Samantha’为试材,进行了乙烯和1-MCP交叉处理,测定花朵各器官乙烯生成量,Rh-ACS3、Rh-ACO1和Rh-ETR3基因的表达。结果表明,1-MCP前处理或后处理均能有效抑制花瓣、雌蕊和花托中由于外源乙烯造成的内源乙烯生成量增加。在基因表达方面,Rh-ACS3、Rh-ACO1和Rh-ETR3在花瓣和雌蕊中对乙烯处理的诱导表达均可被1-MCP前处理或后处理有效抑制,而在花托中,这种抑制主要针对Rh-ETR3。这些结果说明,1-MCP对乙烯的竞争性抑制作用主要发生在花瓣、雌蕊和花托上,其竞争效果在乙烯处理前或乙烯处理后均有效。     

Malformation of roses due to drought stress

Rose plants were subjected to the same degree of drought stress but at different stages of development. Irrigation was suspended for a certain period according to the soil moisture deficit and the leaf stomatal resistance.Rose flower development was most sensitive to drought stress prior to petal and stamen initiation. At those stages, drought stress affected the quality of the flowers (reduction in the number of well-formed petals and in length of the flower bud). Application of drought stress during stamen initiation (or during petal initiation in winter) caused abortions and malformations of the flower bud once the stem had elongated to approximately 15 cm. Such malformed buds had no carpels, and stamens were tightly packed on the center of the receptacle.     

牡丹花枝不同发育时期各器官乙烯释放和ACC含量的变化

以牡丹( Paeonia suffruticosa) 品种‘胡红’为试材, 测定了不同发育时期花枝以及不同器(花瓣、雌蕊、雄蕊、花托、花萼、茎、叶柄、叶) 的乙烯释放量和ACC含量的变化。花的乙烯释放量变化类型主要取决于花瓣, 花朵衰老时花托和雄蕊是乙烯释放的主要部位。雄蕊在初开期有一明显的乙烯释放高峰。花朵开放过程中花瓣的ACC含量缓慢减少, 进入衰老期ACC含量又有快速上升的趋势; 而茎的ACC含量一直处于下降趋势。叶柄和叶片的ACC含量在花朵的整个开放过程中变化不大。结果提示器官之间乙烯和ACC梯度在花朵开放和衰老前后起着重要的调节作用, 而乙烯和ACC在花器不同部位间的运输及分配上有差异。