芜菁二氢黄酮醇4–还原酶基因的克隆与功能鉴定

二氢黄酮醇4–还原酶（dihydroflavonol 4-reductase,DFR）是花青素生物合成晚期阶段的关键酶,属于NAD/NADP依赖型还原酶家族,催化从二氢黄酮醇转变成无色花色素苷的反应。利用UV-A处理‘津田’芜菁（‘Tsuda’turnip）和‘赤丸’芜菁（‘Yurugi Akamaru’turnip）块根24 h后提取总RNA,通过RT-PCR方法分别克隆了‘津田’芜菁BrDFR1和‘赤丸’芜菁BrDFR2基因。BrDFR1和BrDFR2的开放读码框分别为1 158 bp和999 bp,分别编码385和332个氨基酸。氨基酸序列分析显示,BrDFR1和BrDFR2与大白菜DFR具有高度同源性,从第8到第302位氨基酸的肽段具有FR_SDR_e结构域。BrDFR1和BrDFR2基因组全长序列均含有5个位置与序列完全相同的内含子。Southern杂交结果显示,‘津田’芜菁BrDFR1和‘赤丸’芜菁BrDFR2基因均为单一拷贝。UV-A可以诱导BrDFR1基因表达,对BrDFR2基因表达的诱导效果不明显。BrDFR1和BrDFR2基因在大肠杆菌细胞中可以表达并纯化出分子量约为42.8 kD的BrDFR1蛋白和37.5 kD的BrDFR2蛋白。过量表达BrDFR1和BrDFR2基因的烟草花色加深。芜菁DFR基因的RNAi载体遗传转化烟草后,转基因植株的花色变浅。这些工作将为阐明依光型和非依光型花青素生物合成机理奠定研究基础。     

苹果PGIP基因部分家族成员启动子的克隆与功能分析

根据已发表的苹果基因组序列设计特异引物,克隆了苹果（Malus × domestica Borkh.）品种‘秦冠’和‘太平洋玫瑰’中PGIP家族基因PGIP1和PGIP2的启动子片段,序列分析结果表明PGIP1与PGIP2启动子序列相似度为71%,‘秦冠’和‘太平洋玫瑰’的PGIP1、PGIP2启动子相似度都达到了99%。两个品种PGIP1启动子中TATA-box和CAAT-box的数量明显多于PGIP2,PGIP1和PGIP2启动子分别存在茉莉酸甲酯和水杨酸响应元件,暗示PGIP1和PGIP2存在不同的抗病响应途径。构建了启动子︰︰GUS融合表达载体,通过对农杆菌介导法转化烟草叶片中的GUS活性分析,比较了不同启动子的活性。结果表明：PGIP1启动子活性在品种间差异不显著;PGIP2启动子活性在品种间差异显著,‘秦冠’是‘太平洋玫瑰’的2.37倍,可能与品种抗病性差异有关;同一品种中PGIP1启动子活性显著高于PGIP2。     

露地菊离体再生体系建立及BrDFR基因遗传转化

 以露地菊（Chrysanthemum morifolium）品种‘神韵’无菌苗叶片为外植体材料,研究植物生长调节剂配比对其愈伤组织诱导再生芽的影响,以建立离体再生体系。研究结果表明,露地菊‘神韵’在含NAA 1.0 mg · L^-1 + BA 1.0 mg · L^-1的MS培养基上获得了最高的再生芽分化率。利用已经克隆的‘津田’芜菁BrDFR基因构建非抗生素筛选的表达载体。以露地菊‘神韵’的无菌苗叶片为受体,通过农杆菌介导进行BrDFR基因的遗传转化。以载体的PMI基因为筛选标记,通过甘露糖筛选获得了‘神韵’的遗传转化再生植株。经过PCR验证和Southern杂交检测证实BrDFR基因已经整合到‘神韵’基因组中。     

葡萄活性赤霉素合成关键基因VvGA3ox家族的克隆和表达分析

在植物赤霉素合成代谢中,GA3ox可将几种非活性赤霉素转化为具生理活性的赤霉素。以葡萄有核品种‘黑比诺’和无核品种‘无核白’为材料,克隆葡萄的VvGA3ox基因家族成员,分析基因结构、进行染色体定位和系统发育树构建,检测其组织器官表达特性和在胚珠（幼种子）发育过程的表达变化。结果表明,葡萄基因组VvGA3ox家族有3个成员,cDNA长度分别为1 313、1 225和1 480 bp,都包含2个外显子和1个内含子结构。组织器官特异性表达分析表明,VvGA3ox1在胚珠中的表达很低,在根中高表达;VvGA3ox2和VvGA3ox3在花和胚珠中的表达较高。在受精后胚珠（幼种子）发育过程中,VvGA3ox家族基因的表达趋势存在差异,其中VvGA3ox1在‘黑比诺’与‘无核白’中均是在盛花后30 d时上调之后下降;VvGA3ox2在‘黑比诺’中20 ~ 30 d极速上调之后下降,相应地‘无核白’中是先缓慢下降之后上升;VvGA3ox3在‘黑比诺’中逐渐下降,对应地‘无核白’中是在10 ~ 15 d先上升后在20 ~ 45 d呈下降趋势并逐渐与‘黑比诺’中的表达持平。VvGA3ox在有核和无核葡萄品种中表现较大差异表达,与葡萄无核性状有一定关系。     

梨自交不亲和基因cDNA芯片制备及对部分砂梨品种S基因型的鉴定

利用东方梨中已鉴定的52个S等位基因HV区cDNA序列作为靶基因序列设计探针,制备梨S基因cDNA检测芯片,每张芯片上含有240个位点55个cDNA探针,包含所有序列完善的S基因HV区特异的cDNA序列。以被检测品种雌蕊cDNA为模板,采用Cy3荧光修饰引物经S基因特异PCR扩增标记被检测品种的cDNA序列,并与芯片杂交以检测不同品种的S基因型。结果表明：利用cDNA检测芯片与‘丽江黄酸梨’、‘秀玉’、‘弥渡玉梨’、‘白面梨’和‘德胜香’等已知S基因型品种杂交,杂交结果显示与S基因寡核苷酸芯片检测信号一致,与各品种已知S基因型相符合。利用cDNA芯片和进一步完善的S基因寡核苷酸芯片并行检测鉴定了‘文山红梨’等24个未知S基因型的砂梨品种,获得各品种的S基因型。梨S基因cDNA芯片的构建进一步完善了梨S基因检测平台。     

矮牵牛CHS基因启动子克隆、序列分析及植物表达载体构建

应用PrimerPremier5.0软件,根据GenBank数据库报道的查尔酮合成酶基因启动子序列(EF199747)设计1对特异性PCR扩增引物,以矮牵牛品种‘午夜蓝色’叶片总DNA为模板,用TaqDNA聚合酶成功扩增出1条约0.5kb的DNA片段,回收该片段并连接到pMD18-T载体上。结果表明:经测序该启动子片段长550bp;bl2seq分析结果表明该启动子与目标序列相似性高达100%;PLACE在线分析显示在克隆片段中含有TATAbox、CAATbox、capsite、antherbox、box1、box2、Gbox及TACPyAT-box等顺式元件;并构建了矮牵牛CHS基因启动子融合标记基因GUS的植物表达载体pPhCHS::GUS。     

菊花叶绿素a/b结合蛋白基因CmLhcb1及其启动子的克隆和表达分析

 以切花菊品种‘公子’cDNA为模板克隆出叶绿素a/b结合蛋白同源基因cab,其开放阅读框为798 bp,编码266个氨基酸。经多物种间比对分析,确认其属于cab基因家族的Lhcb1类,命名为CmLhcb1。同源克隆菊花品种‘清露’Lhcb1基因,氨基酸序列与‘公子’完全相同。CmLhcb1在叶片中的表达量比在茎、花和根中高,弱光和GA₃处理使CmLhcb1表达上调,多效唑处理后CmLhcb1表达量受到抑制。CmLhcb1的表达受昼夜节律调节,白天表达量显著高于夜间。通过high-efficiency TAIL-PCR（hiTAIL-PCR）方法克隆到‘公子’切花菊CmLhcb1起始密码子上游序列715 bp和‘清露’起始密码子上游序列716 bp,序列经PLACE数据库的比对分析,发现有很多与非生物和生物胁迫相关的元件,主要与光照、GA、ABA、水分、水杨酸和病毒相关,CmLhcb1启动子是光诱导型启动子,具有GT1-box和Z-box。     

调控黄瓜苦味基因Bi的AP2/ERF家族转录因子

从华北型黄瓜‘9930’中克隆了黄瓜苦味形成的关键基因Bi的启动子序列,通过酵母单杂交技术对黄瓜叶片cDNA文库进行筛选,寻找可以调控Bi表达的转录因子。通过对筛选结果的测序及比对,发现有7种转录因子重复出现,包括2个AP2/ERF家族、3个bZIP家族、1个WRKY家族转录因子和1个E3泛素类COP1蛋白。其中AP2/ERF家族转录因子CsERF（登录号：Csa7M448110）重复出现6次,出现概率高于其他转录因子。利用烟草瞬时表达系统,CsERF对Bi启动子的结合及激活作用得到了进一步验证。初步证明CsERF可以结合到Bi的启动子并激活其转录,推测其很可能就是黄瓜叶片中调控苦味形成的关键转录因子。     

激素和非生物胁迫对月季RhPIP1;1 启动子活性的调节作用

 通过反向PCR 方法克隆得到月季（Rosa hybrida L.）‘萨蔓莎’质膜型水孔蛋白基因RhPIP1;1 上游2 126 bp 的启动子序列。PLACE 分析发现，RhPIP1;1 启动子序列中含有GA、ABA 和乙烯等激素诱 导相关顺式作用元件及干旱、低温和盐胁迫等非生物胁迫相关顺式作用元件。在RhPIP1;1promoter：：GUS 转基因拟南芥中发现，RhPIP1;1 启动子活性与植株发育进程相关；几乎所有器官均可检测到GUS 表达， 而且在迅速扩展的器官以及叶片和花的维管组织中尤为强烈。同时在6 d 和9 d 苗龄的转基因植株中，GA 处理上调了莲座叶中RhPIP1;1 启动子的活性，而ABA、甘露醇、NaCl 和冷处理分别下调了莲座叶和根 中RhPIP1;1 启动子的活性。将RhPIP1;1 启动子不同长度的5′端缺失片段融合GUS 基因，并在烟草叶片 中瞬时表达，缺失–580 ~–256 之间的324 bp 片段后，启动子活性显著降低。研究结果表明RhPIP1;1 启 动子对多种激素和非生物胁迫存在响应，并且这种响应具有发育和器官特异性；RhPIP1;1 启动子中–580 ~ –256 区段对于启动子活性具有重要的作用。     

核桃Y2SK2型脱水素基因JrDHN的克隆、表达和单核苷酸多态性分析

采用RT-PCR和RACE技术从‘香玲’核桃（Juglans regia L.‘Xiangling’）叶片中克隆了1个脱水素基因JrDHN（GenBank 登录号KC503061.1）,其全长1 056 bp,具有528 bp的开放阅读框,编码175个氨基酸组成的多肽,具有LEA家族成员的特征多肽序列,属于典型的Y₂SK₂型脱水素。以核桃18S基因为内参,对‘香玲’核桃JrDHN在4 ℃胁迫下的表达模式进行了初步的研究,结果表明低温诱导下叶片中JrDHN的表达增加,4 ℃处理4 h后达到最大值;自然越冬条件下,花芽中JrDHN表达量呈先上升后下降的趋势,在12月份表达量最高,推测JrDHN在核桃对低温胁迫响应中发挥重要功能。‘香玲’JrDHN在雌花中表达量高,其次是叶片和树皮,在花芽中最低。单核苷酸多态性分析JrDHN序列中有30个SNPs位点和11个Indels;单倍型分析显示12份核桃材料可分为10个单倍型,单倍型多样性为0.9697。     

杏CCD1和CCD4启动子克隆及顺式作用元件分析

以‘轮台小白杏’杏果实为材料，根据转录组数据库中的CCD1和CCD4基因片段，通过基因组步移法克隆了两个启动子pPaCCD1和pPaCCD4，获得了长度分别为2 233和1 838 bp的启动子序列。利用PlantCare数据库对启动子序列的顺式作用元件进行预测分析，结果表明两个启动子均含有多个光响应、脱落酸和茉莉酸甲酯等共有顺式作用元件，此外，PaCCD1启动子中含有刺激诱导和种子特异性调控等响应元件，PaCCD4启动子中含有赤霉素、低温和增强转录水平等响应元件，这暗示PaCCD1和PaCCD4的表达可能受光信号、激素和胁迫等多种信号的共同调节。为进一步确定其启动子核心区，基于基因结构特征与顺式作用元件的分布情况，分别构建两个不同长度缺失启动子与GUS基因融合的表达载体并瞬时转化烟草叶片。GUS活性检测发现，在PaCCD1的启动子上游–2 174 ~–1 700 bp、–1 700 ~–1 200 bp、–1 200 ~–600 bp区间内均包含影响启动子活性的顺式作用元件；PaCCD4启动子在上游–1 740 ~–1 200 bp和–1 200 ~–600 bp这两个区间内含有顺式作用元件，随着启动子片段的缺失，PaCCD1和PaCCD4的GUS活性逐渐减弱。PaCCD1的启动子核心区域在–1 200 ~ 2 174 bp区段内，PaCCD4的启动子核心区域在–1 200 ~ 1 740 bp区段内。     

香菇ras和gpd启动子的克隆与功能鉴定

以香菇基因组DNA为模板,利用PCR技术克隆了香菇1个ras启动子Lras,2个gpd启动子Lgpd1和Lgpd2.这3个启动子的大小分别为715bp、1056bp和611bp,与已报道的ras和gpd启动子的同源性很强.对这3个启动子的分析结果表明,它们都含有丰富的启动子顺式作用元件.将这些启动子片段分别与GUS基因连接构建了表达载体,并将这些表达载体导入草菇菌丝体中,检测其活性,最终显示3个片段都有启动GUS基因表达的能力,其中Lgpd1启动子活性最强,Lras启动子次之,Lgpd2最弱.     

苹果和梨AFS基因启动子的克隆、序列比对及功能分析

苹果（Malus × domestica L.）和梨（Pyrus communis L.）果实在低温储存过程中虎皮病的发生与果皮中受乙烯诱导的α–法尼烯合酶基因（AFS）的表达及α–法尼烯的积累密切相关。采用TAIL-PCR技术分别从‘富士’苹果和‘丰产’梨中克隆到了约2 kb的α–法尼烯合酶基因（AFS）启动子序列,并提交至GenBank中（登录号分别为KM676083和KM676082）。序列比对发现两启动子同源性仅为48.31%,远低于其下游编码区97%的相似度。顺式作用元件在线预测分析发现二者同时存在乙烯、脱落酸、茉莉酸、水杨酸等激素响应元件,低温、厌氧、病原菌等胁迫响应元件,以及3个节律性表达元件和2个诱导子响应元件。对‘丰产’梨中AFS基因表达模式的分析也证实了部分预测的诱导因素对其表达有调控作用。将‘丰产’梨AFS基因启动子序列进行系列删除,与GUS报告基因构建融合表达载体转化烟草,利用GUS染色方法分析了不同长度启动子的转录活性差异,发现缩短至153 bp的启动子片段仍具有较强的转录活性,且长度在276 bp至573 bp的启动子片段其驱动下游基因转录的活性较其他片段更强。通过后续对各作用元件尤其是乙烯响应元件的研究将有助于进一步从分子水平认识虎皮病的发生机制。     

甘蓝Ogura 细胞质雄性不育相关基因BoMF1启动子的克隆及功能分析

 通过TAIL-PCR 染色体步移技术,从甘蓝（Brassica oleracea L. var. capitata L.）基因组中克 隆到胞质雄性不育（OguCMS）相关基因BoMF1 翻译起始位点上游521 bp 的启动子序列。软件分析预测 表明,该启动子序列中存在多个顺式作用元件,包括TATA-box、CAAT-box、MYB 结合位点、植物激 素响应单元等。为了研究该启动子的表达特性,亚克隆了BoMF1 转录起始位点上游521 bp 序列,将其置 换pBI121 中的CaMV35S 启动子,驱动其下游的GUS 基因,构建植物表达载体pBI121-BoMF1P,以pBI121 空载体作为阳性对照,通过农杆菌（LBA4404）介导法转入拟南芥。结果表明,甘蓝BoMF1 启动子序列 能驱动GUS 基因在拟南芥花药发育晚期的花药和花粉中特异表达,表达具有组织特异性。     

异源韧皮部特异启动子在转基因枳中的表达

为了筛选在柑橘韧皮部中特异表达的启动子,构建GRP、Rolc、RSSl异源韧皮部特异启动子控制GUS报告基因的植物表达载体,转化枳[Poncirus trifoliata(L.)Raf.]上胚轴。GUS组织化学染色分析表明,3个启动子均显示了维管束组织特异性。其中,GRP启动子活性强,且具有严格的韧皮部组织特异性;Rolc启动子活性最强,在根和茎中呈组成型表达;RSSl启动子活性最弱。Real-time RT-PCR和GUS酶活性分析进一步证明了GRP启动子具有较强的韧皮部组织特异性,该启动子有望应用于柑橘抗黄龙病基因工程育种。     

柑橘CsHB1启动子的克隆及功能分析

以‘伏令夏橙’叶片基因组DNA为模板,克隆了CsHB1启动子5′端转录起始位点上游分别为1 741 bp和1 613 bp的区域序列。序列分析表明这两个启动子区序列相似度为90.7%,存在141 bp的差异片段,该差异片段中含有2个Box4元件。通过PlantCare数据库对启动子序列的顺式作用元件进行预测,结果表明CsHB1的不同启动子序列含有多种响应元件,如胚乳特异性元件、分生组织表达元件、光反应元件、热应激反应元件、MYB结合位点等。为进一步分析CsHB1启动子的功能,构建该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体prCsHB1::GUS,并用农杆菌介导法转化拟南芥,获得prCs HB1-1::GUS拟南芥纯合材料13株和prCs HB1-2::GUS拟南芥纯合材料10株。对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色鉴定,结果表明两类启动子表达载体已成功转入拟南芥中并进行了表达,其表达部位主要集中于愈伤组织和花药中,而在种荚、叶片及幼苗中未检测到GUS蛋白的表达。     

蜡梅CpAGL6基因启动子的克隆及功能初步分析

利用hiTAIL-PCR法,从蜡梅（Chimonanthus praecox）基因组中克隆到花发育相关基因CpAGL6翻译起始位点上游1 266 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,该启动子序列中存在启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box及多个与植物非生物胁迫相关的响应元件。为进一步分析CpAGL6启动子的功能,构建该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体,并用农杆菌介导法转化烟草。对转基因烟草进行GUS组织化学染色及GUS酶活性定量检测,结果显示,CpAGL6基因启动子能够驱动GUS基因在转基因烟草的叶、茎、花中表达,并且在不同花期表达强度存在差异,在根中几乎不表达。转基因植株经黑暗、赤霉素和4 ℃低温处理后,GUS酶活性均有所增加。结果表明,CpAGL6启动子主要驱动GUS报告基因在花器官和绿色器官组织中表达,推测其在抵抗非生物胁迫中具有重要作用。