香蕉茉莉酸合成关键酶基因MaOPR 的克隆和表达分析

 从‘巴西’香蕉（Musa acuminata L. AAA group‘Brazilian’）根的cDNA 文库中获得了一段 12–氧–植物二烯酸还原酶OPR（12-oxo-phytodienoic acid reductase）基因的片段,RACE 扩增获得全长, 命名为MaOPR。该基因全长1 512 bp,存在一个完整的开放阅读框1 287 bp,编码429 个氨基酸。生物 信息学分析表明,该蛋白属稳定蛋白,等电点为8.11,具有一个活性位点,一个基质结合位点,一个黄素 单核苷酸结合位点。序列预测分析该蛋白亚细胞定位为细胞质,其不属于跨膜蛋白且不存在信号肽。通 过和已知植物的12–氧–植物二烯酸还原酶基因相比,同源性达到66%以上。其中与苜蓿、谷子、粳稻、 紫云英的OPR 编码的氨基酸序列的同源性均为71%。器官特异性分析表明,MaOPR 在香蕉的根、茎、 叶片、花和果实中均有所表达,其中在茎和果实中表达量较高。通过对其在ABA 抑制剂、乙烯、枯萎病 胁迫下的表达结果分析显示,该基因响应以上3 种胁迫。     

唐菖蒲茉莉素受体基因GhCOI1的克隆与表达分析

通过RACE技术在唐菖蒲(Gladiolus hybridus)品种‘Rose Supreme’的籽球苗叶片中克隆得到茉莉素受体COI1基因的c DNA序列,命名为Gh COI1。该基因全长为2 603 bp,包含一个编码613个氨基酸的开放阅读框,5′utr和3′utr分别为484 bp和277 bp,预测的蛋白质分子量为69.46 k D;其氨基酸序列具有典型的F-box基序和LRRs结构域。同源比对和系统进化树的分析结果表明,Gh COI1与番茄Le COI1氨基酸序列的相似性最高,达到64.3%;与水稻Os COI1的亲缘关系最近。利用实时荧光定量PCR分析基因表达的结果表明,Gh COI1在唐菖蒲叶片中的相对表达量最高,根中其次,匍匐茎、新球、籽球、花瓣、雄蕊、雌蕊里中的相对表达量较低,推测在唐菖蒲中存在器官专一性表达的COI1同源基因。采用0.05、0.1和0.5 mmol·L-1 Me JA喷施处理唐菖蒲叶片,检测到施用0.1 mmol·L-1 Me JA可显著上调Gh COI1的表达。同时伴随此浓度Me JA处理时间的增加,12 h内Gh COI1的表达量呈现先上升再下降后上升的趋势。洋葱表皮细胞瞬时表达结果表明Gh COI1蛋白定位于细胞质和质体中。本研究中初步验证了Gh COI1在茉莉素信号途径中的作用。     

唐菖蒲脂氧合酶基因GhLOX1 对球茎膨大的影响

 以唐菖蒲（Gladiolus hybridus）品种‘Rose Supreme’的球茎为试材,应用Real time RT-PCR技术,分析唐菖蒲球茎在不同浓度的茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MJ）0.1、0.2、0.5 mmol · L^-1和水杨酸异羟肟酸（salicylhydroxamic acid,SHAM）0.5、0.75、1.0 mmol · L^-1处理后脂氧合酶（LOX）基因的的表达水平,并且对LOX活性、内源MJ含量以及球茎鲜样质量与体积进行测定。分析结果表明,GhLOX1表达水平、脂氧合酶活性、内源MJ含量以及球茎的鲜样质量与体积均随着MJ浓度的增加而逐渐提高。与此相反,经过不同浓度的LOX抑制剂SHAM处理后,以上各项指标随着SHAM浓度的增加而逐渐降低。同时,构建35S-GhLOX1过表达载体,利用根癌农杆菌介导法将GhLOX1导入马铃薯栽培品种‘中薯3号’的试管薯薄片中,转基因马铃薯植株块茎的数量、体积和鲜样质量分别得到了不同程度的提高。     

唐菖蒲茉莉酸生物合成关键酶基因LOX1的克隆及表达分析

 以唐菖蒲（Gladiolus hybridus）品种‘Rose Supreme’的球茎为试材,通过RT-PCR和RACE技术克隆到了一个全长为2 797 bp的茉莉酸（Jasmonic acid,JA）生物合成关键酶LOX基因的cDNA序列,命名为GhLOX1,属于9-LOX。该序列含有一个2 541 bp的开放阅读框（ORF）,编码846个氨基酸,推导的蛋白质分子量为94.90 kD。RT-PCR表达分析表明,该基因在唐菖蒲叶、花、根、匍匐茎、新球茎和籽球上都表达,而在叶和匍匐茎中表达量最高,在花和籽球中表达量较低;离体条件下,经过0、0.1、0.5、1.0、2.0 mmol · L^-1的不同浓度梯度的水杨酸（SA）处理后,其表达水平随着浓度的升高而降低,当SA浓度达到2.0 mmol · L-1时没有表达。     

水杨苷异羟肟酸和茉莉酸甲酯对唐菖蒲试管结球的影响

为探讨水杨苷异羟肟酸(SHAM)和茉莉酸甲酯(MJ)对唐菖蒲试管结球的影响,以'Rose Supreme'的籽球为外植体,研究了不同处理球茎内可溶性蛋白、内源MJ、碳水化合物(蔗糖、淀粉和纤维素)含量、脂氧合酶(LOX-1)、抗氧化酶(SOD、CAT、POD和APX)活性和LOX同工酶变化与试管结球之间的关系。结果表明：与对照相比,SHAM处理使结球时间明显推迟,结球率、球茎鲜样质量和直径降低;可溶性蛋白含量、LOX-1活性和MJ含量显著降低,LOX同工酶谱带变弱,并有2条同工酶带逐渐消失;抗氧化酶活性和碳水化合物含量降低。而MJ处理后上述指标均不同程度上调,0.5mmol·L^-1为测试浓度范围内促进唐菖蒲试管结球的最佳浓度。以上试验结果说明SHAM对唐菖蒲试管结球起抑制作用,而MJ有明显的促进作用,可能通过外施MJ提高了LOX活性及内源MJ含量,调动碳水化合物的积累,增加抗氧化酶的活性,从而对球茎的发生和生长进行调控。     

异源表达拟南芥赤霉素2–氧化酶基因对矮牵牛形态发育的影响

拟南芥赤霉素2–氧化酶基因AtGA2ox1在矮牵牛（Petunia hybrida）中过量表达导致转基因植株开花延迟,株形明显矮化,花冠变小,花冠表皮细胞变小,但花色变化不明显。施用多效唑对矮牵牛花冠的影响与过量表达AtGA2ox1一致。用拟南芥茎特异性表达基因At3g56700的启动子驱动AtGA2ox1在矮牵牛中表达时,转基因植株的表型变化在株系间存在明显的差异,但外源基因在茎中的表达量都明显高于叶和花中的,果实和种子的发育未受影响,通过对转基因后代的筛选可以获得株形矮化,其它性状的发育受影响较小的转基因株系。     

拟南芥中异源过表达黄瓜CsTRY基因对表皮毛的抑制作用

 将拟南芥表皮毛调控基因TRIPTYCHON（TRY）、CAPRICE（CPC）以及ENHANCER OF TRY AND CPC1（ETC1）的序列信息,在黄瓜基因组数据库中进行BLAST比对后发现,它们都对应于黄瓜中的同一个基因CsTRY。异源过量表达黄瓜CsTRY导致拟南芥叶片表皮毛大量减少,且使拟南芥中表皮毛起始基因GLABRA2（GL2）的表达量显著下降,表明黄瓜CsTRY基因与拟南芥TRY基因可能具有功能上的保守性,通过阻碍GL1-GL3/EGL3-TTG1三聚体复合物的形成来降低GL2的表达,从而抑制表皮毛的形成。     

蕙兰CfAOC基因的克隆及表达分析

以野生蕙兰为试材,利用分子手段解析CfAOC(allene oxide cyclase,丙二烯氧化物环化酶)在蕙兰花香合成途径中的作用,同时为揭示蕙兰花香合成的分子机制提供理论依据。结果表明:分别以蕙兰基因组DNA和cDNA为模板PCR扩增出CfAOC基因的全长序列和CDS序列,比较发现CfAOC基因由3个外显子和2个内含子构成,亚细胞定位预测该蛋白位于叶绿体中,氨基酸序列分析显示该基因编码的蛋白含有保守的丙二烯氧化物环化酶结构域,进化树结果也表明CfAOC与其它植物的AOC同源性较高,都参与茉莉酸及其衍生物的合成代谢。CfAOC基因的时空特异性表达分析发现该基因在蕙兰盛花期时的花中表达量最高,暗示该基因可能与蕙兰花香合成有关。     

石蒜黄烷酮3–羟化酶基因LrF3H 的克隆及表达分析

 采用RT-PCR 和RACE 技术相结合的方法,从石蒜花瓣中克隆到1 个黄烷酮3–羟化酶（F3H） 基因的cDNA 全长序列,全长1 293 bp,包含1 098 bp 的完整开放阅读框,编码365 个氨基酸;氨基酸序 列比对显示该序列编码的氨基酸与水仙的F3H 具有高达91%的同源性,将其命名为LrF3H。二级结构预 测表明,随机卷曲是LrF3H 蛋白最大量的结构元件,而α–螺旋和延伸链散布于整个蛋白中。保守结构 域预测表明该基因编码的蛋白具有典型的F3H 蛋白功能结构域,其保守结构域中含有铁离子及2–O–酮 戊二酸结合位点,属于2OG-FeⅡ_Oxy 双加氧酶超家族。实时荧光定量PCR 分析表明,LrF3H 在整个花 发育过程中均表达,而且从初蕾期到盛开期随着花瓣着色加深表达量逐渐增加,盛开期表达量最高,之 后随着花朵萎蔫表达量下降;在不同器官中,LrF3H 的表达量在花瓣和花葶中最高,而在根、鳞茎和叶 片中都很低,推测该基因在石蒜花色形成过程中起着关键作用。     

柑橘AOS1-2的克隆及其响应溃疡病菌侵染的表达分析

对柑橘中茉莉酸（Jasmonic acid,JA）生物合成途径中的关键限速酶丙二烯氧化物合酶AOS家族基因进行注释,确定其受溃疡病菌Xanthomonas citri subsp. citri(Xcc)诱导的表达模式。从甜橙数据库中共注释出3个AOS家族成员,其中CsAOS1-2对溃疡病菌响应最强烈;CsAOS1-2在‘晚锦橙’（甜橙,易感溃疡病）和‘金弹’（金柑,抗溃疡病）中均受病原菌诱导,但在‘晚锦橙’中表达量上调幅度远高于金弹;CsAOS1-2全长2 656 bp,开放阅读框1 599 bp,编码532个氨基酸,分子量为59 499.81,为非分泌性蛋白,其349～510 aa为典型的P450功能域;Cs AOS1-2的表达无组织特异性;‘晚锦橙’和‘金弹’的AOS1-2启动子均含有参与植物激素和逆境应答的顺式作用元件,但在数量和类型上存在差异;烟草瞬时转化亚细胞定位分析显示CsAOS1-2定位在叶绿体中。CsAOS1-2强烈响应柑橘溃疡病菌的侵染,推测其与柑橘溃疡病敏感性具有密切的关系。     

唐菖蒲质膜水孔蛋白基因GhPIP1;1 的克隆及表达分析

 采用RT-PCR和RACE技术从唐菖蒲（Gladiolus hybridus‘Eerde’）花瓣中克隆得到1个质膜内在蛋白（plasma membrane intrinsic proteins,PIPs）类的水孔蛋白基因,命名为GhPIP1;1。该基因cDNA 全长1 130 bp,包含867 bp完整开放阅读框（ORF）,编码288个氨基酸。克隆和分析相应的gDNA序列（2 098 bp）表明,其包含由4个外显子和3个内含子组成的编码区序列。氨基酸序列分析表明GhPIP1;1具有水孔蛋白家族高度保守的2个NPA（Asn-Pro-Ala）基序。同源性分析显示GhPIP1;1氨基酸序列与同科的荷兰鸢尾（Iris hollandica）PIP1氨基酸序列的同源性达94%。半定量RT-PCR分析表明,GhPIP1;1在唐菖蒲花瓣、雄蕊、雌蕊、茎、苞片和叶片等均有表达,但表达量以花瓣中最高,叶片中最低;GhPIP1;1在花蕾至花朵盛开期间的表达水平较高且变化不明显,但在花朵盛开后的萎蔫过程中表达水平明显降低。     

脂氧合酶对唐菖蒲籽球形成和膨大的影响

为探讨脂氧合酶(LOX-1)对唐菖蒲籽球形成和膨大的影响,以'Rose Supreme'和'Advanced Red'两个品种为试材,研究了籽球的生长发育与LOX-1活性,内源茉梨酸甲酯(MJ)、蔗糖、淀粉和纤维素含量变化之间的关系。结果表明,唐菖蒲叶片中测不到LOX-1活性,匍匐茎中LOX-1活性和内源MJ含量最高,籽球数量较多的品种'Rose Supreme'LOX-1活性和MJ含量显著高于'Advanced Red',说明LOX-1在唐菖蒲籽球形成和膨大过程中起着重要作用,其作用途径可能是通过影响茉莉酸类化合物(JAs)的生物合成对籽球的发生和生长进行调控。在唐菖蒲籽球生长发育过程中,新球和籽球中蔗糖、淀粉和纤维素含量都不同程度升高,并且与LOX-1活性呈正相关,说明蔗糖、淀粉和纤维素对唐菖蒲新球和籽球的形成和膨大起着重要作用。     

茶树DHAR酶基因的克隆与非生物胁迫响应分析

利用RT-PCR技术从茶树‘龙井43’cDNA中克隆得到1个编码茶树脱氢抗坏血酸还原酶基因CsDHAR,该基因全长639 bp,编码212个氨基酸,属于谷胱甘肽转移酶（GST）超级家族成员,具较高保守性。系统进化分析结果表明CsDHAR蛋白与拟南芥DHAR1、DHAR2进化关系近,在不同物种间,与毛果杨、胡杨等植物亲缘关系较近;理化性质分析表明CsDHAR属于亲水性蛋白;结构分析表明CsDHAR蛋白具典型功能结构域,三级结构主要由α–螺旋和不规则卷曲构成。荧光定量PCR分析显示,CsDHAR在茶树叶片不同发育阶段表达量差异不显著;对‘龙井43’与‘安吉白茶’中CsDHAR进行荧光定量PCR分析,‘龙井43’在低温、高温处理4 h表达量最高、干旱和高盐处理24 h表达量最高;‘安吉白茶’在高温、高盐处理4 h表达量最高,干旱处理2 h表达量最高。不同逆境胁迫下CsDHAR均被诱导表达,表明该基因参与茶树响应逆境胁迫调节过程。     

芜菁Br14-3-3的克隆及其在非生物胁迫下的表达分析

克隆了‘津田芜菁’(Brassica rapa subsp. rapifera‘Tsuda’)通用调节因子14-3-3基因cDNA序列,命名为Br14-3-3(GenBank登录号为MK896872)。该基因全长1 113 bp,开放阅读框全长774 bp,编码含有257个氨基酸的多肽。荧光定量PCR分析Br14-3-3在‘津田芜菁’不同组织中及其在温度、脱水、渗透、ABA和无机盐等非生物胁迫下幼苗中的表达,结果表明该基因在‘津田芜菁’的花中表达量最高,幼苗中次之;低温抑制了Br14-3-3的表达,其他非生物胁迫可诱导该基因表达,暗示Br14-3-3在非生物胁迫应答中发挥功能。     

茶树CsMAPK3的全长克隆及其逆境表达分析

以‘福鼎大白’茶树为材料,克隆了CsMAPK3的全长cDNA序列(GenBank登录号:MF034662)、基因组序列及其启动子序列。CsMAPK3的cDNA序列全长1700 bp,含有1119 bp的ORF序列,编码373个氨基酸;CsMAPK3蛋白预测为亲水性蛋白,含有多个磷酸化位点;多序列比对和进化树分析表明CsMAPK3 C–末端含有保守的CD结构域,属于TEY类型的A亚家族MAPK;亚细胞定位预测CsMAPK3主要定位于细胞质和细胞核中。CsMAPK3基因组全长4930 bp,包含5个内含子和6个外显子,第1个内含子和第2个内含子较大,分别为1608和1318 bp,外显子长度在130~350 bp之间。克隆获得起始密码子上游1125 bp的启动子区序列,该启动子上含有干旱、低温、高温以及ABA等相关的顺式作用元件。荧光定量表达分析显示,ABA、低温和盐胁迫均能显著上调茶树叶片中CsMAPK3的表达。蛋白互作预测表明CsMAPK3可能与MYBR1互作来响应ABA依赖途径的非生物胁迫过程。综上表明,CsMAPK3可能与茶树抗逆响应密切相关。     

津田芜菁BrPIP1的克隆及其在非生物胁迫下的表达分析

克隆得到津田芜菁(Brassica rapa ssp.rapifera‘Tsuda’)质膜内在蛋白(plasma membrane intrinsic proteins,PIPs)基因全长cDNA序列,命名为BrPIP1(GenBank登录号为KJ173685),全长为1 056 bp,开放阅读框为861 bp,编码286个氨基酸。荧光定量PCR分析BrPIP1在不同组织以及其在温度、脱水、渗透、ABA和盐等非生物胁迫条件下幼苗中的表达表明,该基因表达具有组织特异性,在花瓣中表达量最高,花蕾中次之;在上述非生物胁迫下表达量都有不同程度增加,暗示BrPIP1在非生物胁迫应答中发挥作用。     

月季RcHSP17.8 基因表达提高大肠杆菌对非生物胁迫的耐性

 月季RcHSP1718为编码小分子热激蛋白基因, Southern检测其在月季基因组中为多拷贝存在。38 ℃/3 h热激处理后, 该基因在耐热月季品种‘曼海姆宫殿’ ( Schloss Mannieim) 、‘彩虹’ (Radio) 、‘赌城’ (Las Vegas) 、‘梅郎随想曲’ (Caprice de Meiland) 、‘小女孩’ ( Girl) 中强表达, 而在不耐热品种‘新十全’ (Kordes’Perfecta) 、‘绯扇’ (Hiogi) 、‘莱茵黄金’ ( Pfalzer Gold) 中弱表达或不表达, 表明该基因与月季耐热性关系密切。为确定月季RcHSP1718基因功能, 将其转化E.coli BL21, 结果表明重组菌株能正常诱导表达包含RcHSP17.8的融合蛋白, 并因此提高了重组菌株对高温、低温、高盐、高pH、重金属、氧化等非生物胁迫的耐性, 表明RcHSP17.8参与了上述非生物胁迫的响应。