结球甘蓝叶片卷曲过程中6个生长素相关基因的克隆与表达分析

生长素在结球甘蓝球叶向上、向内自然卷曲的过程中发挥着重要的调控作用。为挖掘重要的影响结球甘蓝叶片卷曲的生长素相关基因,通过对结球甘蓝莲座期叶片与结球期叶片的转录组进行对比分析,筛选出6个显著差异表达的生长素相关基因,分别为调控生长素动态平衡的Bo ILL6、Bo ASA1基因,控制极性运输的Bo SF21、Bo PIN4基因,参与信号转导的Bo ARF8、Bo GH3.5基因。对上述6个基因进行同源克隆,分别获得全长c DNA序列,序列分析发现6个基因均含有生长素相关的结构域。分子进化树分析发现各基因与芜菁的对应基因遗传关系最近,拟南芥次之。荧光定量PCR检测结果显示,Bo ILL6、Bo ASA1与Bo SF21的表达量变化最为显著,结球期叶片相对莲座期叶片的表达量差异均高达12倍以上,变化趋势与转录组数据分析结果基本一致,说明这3个基因可能与结球甘蓝叶片的卷曲发育密切相关。     

苹果K~+转运蛋白基因家族鉴定及表达分析

利用苹果基因组筛选K~+转运蛋白基因,分析其系统发育关系,通过q RT-PCR检测它们在平邑甜茶各器官组织和不同发育阶段果实的表达特征。结果表明,在苹果中存在65个K~+转运蛋白基因,包括CHX家族(33个)、HAK家族(24个)、HKT家族(1个)和KEA家族(7个),它们与拟南芥K~+转运蛋白基因高度同源,其基因结构相对保守,并且不均匀地分布在13条染色体上。定量表达分析发现,K~+转运蛋白基因具有不同的表达模式,其中在根中高度表达的32个,在叶片中高度表达的12个,在茎尖中高度表达的11个,在果实中高度表达的19个。研究结果为揭示苹果K~+转运蛋白基因的功能提供了基础资料。     

结球甘蓝春化相关基因BoVIN3 的克隆及其表达分析

 根据已报道的拟南芥春化相关基因VIN3设计引物,通过RT-PCR方法首次从结球甘蓝中克隆得到两条春化相关基因BoVIN3的cDNA ORF编码区序列,各1 680 bp,GenBank登录号分别为JQ394927和JQ394928,可编码由560个氨基酸组成的蛋白质;与拟南芥VIN3基因在核酸水平上同源性分别达到85.55%和79.95%;与拟南芥氨基酸序列同源性分别为80.72%和72.96%。半定量RT-PCR表达分析表明BoVIN3受春化作用的诱导,只在感应低温的茎尖生长点表达,在其它部位不表达,并且其转录产物随春化时间延长逐渐积累,在春化42 d时达到峰值;而在不同浓度GA₃和KT诱导下不表达;FLC受春化作用的抑制,并且BoVIN3受诱导表达后才能使FLC的表达受到抑制,暗示在结球甘蓝中BoVIN3可能参与春化调控开花的生物学过程,属于春化特异基因,只响应低温诱导而转录。     

菊花花发育基因CmCO和CmFT的克隆与表达分析

 　利用同源序列法结合RACE技术从菊花‘神马’品种[Chrysanthemum morflorium（Ramat.）Kitam.‘Jinba’]中分离了开花时间相关的CO（CONSTANS）和FT（FLOWERING LOCUS T）同源基因,并命名为CmCO（基因登录号JF488070）和CmFT（基因登录号JF488071）。CmCO和CmFT分别编码382和174个氨基酸。蛋白比对发现,CmCO蛋白包含具有典型的CO同源蛋白结构,包含B-box1,B-box2,CCT结构域及COOH区域。CmFT所推测的氨基酸序列包含FT类蛋白保守基序和两个关键性氨基酸残基。同源性分析表明,CmCO与草莓（Fragaria × ananassa）FaCO同源性最高,为65.8%,与豌豆（Pisum sativum）PsCOL、拟南芥（Arabidopsis thaliana）AtCO同源性分别为62.0%和55.6%。CmFT与向日葵（Helianthus annuus）HaFT2基因同源性最高,为93.7%,与葡萄（Vitis vinifera）VvFT和拟南芥AtFT的同源性分别为85.1%和74.0%。进化树聚类分析表明,CmCO和CmFT蛋白分别与向日葵HaCO和HaFT2遗传距离最近。RT-PCR表明,长日照下的菊花叶片中几乎检测不到CmCO和CmFT,而在短日照下,CmCO在花芽分化启动期（Ⅰ）表达,总苞鳞片分化前期（Ⅱ）有所下降随后又迅速升高;CmFT在CmCO之后表达,之后持续高表达。选择小花原基分化前期（Ⅳ）对菊花叶片、花芽和茎等不同组织器官CmCO和CmFT表达进行分析,结果表明,CmCO在叶片中表达量最高,花芽次之,茎最低;CmFT在花芽中表达量最高,叶片次之,茎最低。由此推测CmCO和CmFT的表达与光周期诱导菊花成花密切相关。     

金线莲ArLBD1基因克隆、亚细胞定位及表达分析

以金线莲(Anoectochilus roxburghii)叶片的转录组数据为基础,采用RT-PCR技术克隆到了金线莲ArLBD1转录因子基因,采用生物信息学、原核表达、Western blot、亚细胞定位及qPCR等方法对该基因功能进行初步分析,以期为进一步研究其功能提供参考依据。结果表明：ArLBD1基因CDS长度864 bp,编码287个氨基酸。ArLBD1蛋白分子量为30.62 kD,理论等电点为6.25,不稳定系数55.55,属于不稳定蛋白。ArLBD1蛋白含有LOB superfamily保守结构域,第7～28氨基酸为C基序,第36～84氨基酸为GAS基序,第89～107氨基酸为类亮氨酸拉链基序,具有完整的类亮氨酸拉链基序,属于ClassⅠ。系统进化分析表明ArLBD1与拟南芥AtLBD36的亲缘关系最近,其次是AtLBD6。SDS-PAGE电泳及Western blot结果显示,ArLBD1基因在大肠杆菌中成功诱导表达。亚细胞定位分析发现ArLBD1蛋白定位在细胞核。qPCR分析结果表明,ArLBD1基因在金线莲叶、茎和根中都能检测到表达,在叶片表达量最高,其次是根,茎的...     

板栗CmFT基因的克隆及功能分析

【目的】FT(FLOWERING LOCUS T)是成花素基因,探究板栗(Castanea mollissima)CmFT的生物学功能。【方法】在板栗基因组数据库中,检索并克隆板栗FT同源基因,对其基因结构、编码蛋白进行分析。利用荧光定量PCR测定CmFT的时空表达情况。通过亚细胞定位分析CmFT在细胞中的表达位置。通过对CmFT过量表达拟南芥(Arabidopsis thaliana)的开花性状分析,验证CmFT的生物学功能。【结果】CmFT开放阅读框长度为525 bp,编码174个氨基酸,具有保守的PEBP结构域,定位于细胞核。CmFT在叶片和茎尖均有较高表达,并且于7月在叶片中的表达水平达到峰值。在拟南芥中过表达CmFT可提高开花促进基因AtFT、LEAFY(AtLFY)、SUPPRESSOR OF CONSTANS OVEREXPRESSION 1AtSOC1)及开花抑制基因TERMINAL FLOWER1(AtTFL1)和FLOWERING LOCUS C(AtFLC)的表达水平,并导致植株提前开花。【结论】CmFT为板栗开花素基因,可促进成花。     

柑橘CsHB1启动子的克隆及功能分析

以‘伏令夏橙’叶片基因组DNA为模板,克隆了CsHB1启动子5′端转录起始位点上游分别为1 741 bp和1 613 bp的区域序列。序列分析表明这两个启动子区序列相似度为90.7%,存在141 bp的差异片段,该差异片段中含有2个Box4元件。通过PlantCare数据库对启动子序列的顺式作用元件进行预测,结果表明CsHB1的不同启动子序列含有多种响应元件,如胚乳特异性元件、分生组织表达元件、光反应元件、热应激反应元件、MYB结合位点等。为进一步分析CsHB1启动子的功能,构建该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体prCsHB1::GUS,并用农杆菌介导法转化拟南芥,获得prCs HB1-1::GUS拟南芥纯合材料13株和prCs HB1-2::GUS拟南芥纯合材料10株。对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色鉴定,结果表明两类启动子表达载体已成功转入拟南芥中并进行了表达,其表达部位主要集中于愈伤组织和花药中,而在种荚、叶片及幼苗中未检测到GUS蛋白的表达。     

葡萄赤霉素受体基因VvGID1A 的分离、亚细胞定位及表达分析

 以‘藤稔’葡萄（Vitis vinifera × V. labrusca‘Fujiminori’）的花序、茎尖、叶片以及果实为 试材,应用RT-PCR 结合RACE 技术克隆得到GID1A 同源基因全长cDNA 序列,命名为VvGID1A（基因 登录号：JQ669511）,全长1 681 bp,含有1 个1 035 bp 的开放阅读框,编码344 个氨基酸,该氨基酸序 列还包含两个激素敏感酯酶家族保守的结构域HGG 和GXSXG。系统进化分析表明,VvGID1A 与蒺藜苜 蓿、棉花和拟南芥之间的一致性分别为70.25%、70.08%和68.21%。荧光定量RT-PCR 结果表明,VvGID1A 在葡萄花序、老叶和卷须中表达水平高于茎尖和幼叶,而在GA 处理果实中的表达水平低于未处理的对照 样品。瞬时表达载体的构建及洋葱表皮细胞转化后,洋葱表皮细胞的瞬时表达结果显示,该基因的表达 产物定位在细胞核上。     

结球甘蓝雌蕊调控转录因子SPT 基因的克隆 与序列分析

以结球甘蓝E1 为材料,提取花蕾总RNA,反转录cDNA。根据拟南芥SPT 基因设计引物,
采用同源克隆的方法从中克隆SPT 基因序列1 085 bp,开放阅读框1 062 bp。通过cDNA 推导得到的氨
基酸序列分析表明,BoSPT 编码353 个氨基酸残基,预测分子量为37.67 kD,pI 为6.83。经过EcoRⅠ和
KpnⅠ限制酶双酶切后,构建原核表达质粒pET43.1a-BoSPT 转化表达菌株E. coli Rosetta（ DE3）,通过
SDS-PAGE 检测该蛋白的表达。经Smart-embl 预测其具有bHLH 家族结构域,位于序列第173～221 位氨
基酸残基处。进化树表明结球甘蓝BoSPT 与拟南芥AtSPT 和筷子芥AlSPT 的亲缘关系较近。BoSPT 基因
的原核表达得到纯化的融合蛋白。     

本期导读

<正>《中国蔬菜》网络实时互动视频直播节目"种业会客厅"于2015年10月12日晚7:30首播,这是在李克强总理"互联网+"号召下的大胆创新。黄瓜虽然不是重庆、上海地区的主栽蔬菜作物,但一直居于重要地位,且品种特点突出。生长素在结球甘蓝球叶向上、向内卷曲过程中发挥着重要的调控作用,蒲全明等筛选出6个生长素相关基因,其中3个基因可能与结球甘蓝叶片的卷曲发育密切相关。     

菜薹BrWRKY57的特性及其对BrPPH1和BrNCED3的调控

从菜薹叶片中分离获得1个WRKY转录因子,命名为BrWRKY57。氨基酸序列比对及进化树分析发现BrWRKY57与拟南芥AtWRKY57同源性较高,含有1个WRKY保守结构域,且同属于WRKY转录因子家族Ⅱc亚族。实时荧光定量PCR分析表明,BrWRKY57随着菜薹叶片衰老表达水平升高,外源脱落酸(abscisic acid,ABA)处理显著诱导其表达。亚细胞定位和转录活性分析表明,BrWRKY57定位于细胞核,且在酵母和烟草体内都具有转录激活活性。双荧光素酶瞬时表达试验显示,BrWRKY57可以激活叶绿素降解相关基因BrPPH1和ABA合成相关基因BrNCED3的启动子活性。以上研究结果表明,BrWRKY57参与菜薹叶片衰老过程可能与影响叶绿素降解和ABA合成相关基因的表达有关。     

大白菜杂交种和亲本之间基因表达差异分析

利用cDNA-AFLP技术研究大白菜白引2号杂交种及其亲本在幼苗期、莲座期、结球期的基因差异表达。结果表明：在3个发育期,发现有29条差异片段,其中5个差异片段出现在幼苗期,14个差异片段出现在莲座期,10个差异片段出现在结球期|19个差异片段在杂种中表达,3个差异片段在双亲中同时表达,2个差异片段仅在母本中表达,5个差异片段仅在父本中表达。将29个差异片段的序列在白菜基因组序列数据库网站（http://brassicadb.org/brad/）进行BLAST分析,均找到了对应的染色体位置。其中17个差异片段分别有明确的基因及编码蛋白与其相对应。其中有两个基因片段分别含有AP2/EREBP结构域和PPR结构域,这两个结构域在控制植物生长发育方面具有重要作用。     

西洋梨PcHB12基因抑制果实花青苷的合成

为了解HD-ZipⅠ转录因子调控梨花青苷合成的机制,以西洋梨品种‘红茄梨’为试材,克隆了1个HD-ZipⅠ家族基因PcHB12(GenBank序列号XM₀09363028)。通过系统进化树分析、qRT-PCR、酵母单杂交、电泳迁移率变动分析(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)和荧光素酶报告试验,探究PcHB12调控梨花青苷合成的作用。结果表明,PcHB12的开放阅读框为696 bp,编码231个氨基酸,预测的蛋白质分子量是26.77 kD。系统进化树分析表明,PcHB12与拟南芥AtHB12蛋白序列相似度最高。‘茄梨’中PcHB12的表达量明显高于其红色芽变品种‘红茄梨’,而花青苷含量和花青苷相关基因PcMYB10.1、PcUFGT的表达量明显低于‘红茄梨’。酵母单杂交和EMSA试验发现,PcHB12结合在PcMYB10.1启动子的MBS序列。荧光素酶试验表明PcHB12负调控PcMYB10.1启动子的转录活性。因此,PcHB12可能通过负调控PcMYB10.1的表达从而抑制梨花青苷的合成。     

大白菜突变体库的构建及M2叶片表型变异的研究

 利用不同浓度甲基磺酸乙酯（EMS）诱变大白菜自交系‘A03’种子,根据M₁代植株发芽率、成活率、育性及M₂代成活率,筛选出适宜的EMS诱变浓度为0.4%。采取EMS种子诱变1次、EMS种子诱变2次及EMS花蕾诱变结合小孢子培养的方法构建了含有4 253个家系及相应自交M₂代种子的大白菜突变体库。在该突变体库M₂群体中分别对苗期6 404株幼苗及莲座期7 756个单株的叶片性状进行了形态学调查,总的表型变异频率高达37.62%和26.33%。     

复绿铃微肥在大白菜上的肥效试验

为验证复绿铃微肥在大白菜上的增产效果并其确定最佳施用方法,在大白菜上进行了复绿铃不同施用方法的随机区组肥效试验,通过分析对照和复绿铃不同处理的大白菜小区产量、外叶和叶球质量,发现施用复绿铃后大白菜产量有显著提高,对其外叶和叶球生长都有一定的促进作用。通过综合分析发现,大白菜莲座期喷施复绿铃增产效果最好,比对照增产27.3%,结球期喷施复绿铃效果次之。     

菜薹叶片衰老相关转录因子BrWRKY75的特性分析

以菜薹[Brassica rapa L. ssp. chinensis（L.）Mokino var. utilis Tsen et Lee]为材料,克隆得到1个WRKY转录因子,命名为BrWRKY75。氨基酸序列比对及进化树分析发现BrWRKY75与拟南芥的WRKY75同源性较高,且同属于第Ⅱ类c亚族。实时荧光定量PCR表明BrWRKY75在菜薹叶片衰老过程中表达明显增强。亚细胞定位和转录活性分析显示BrWRKY75定位于细胞核,是一种核蛋白,并且具有转录抑制活性。体外凝胶阻滞试验（EMSA）证实BrWRKY75能与W-box（TTGAC）元件特异结合。上述结果为进一步研究菜薹叶片衰老的转录调控机制奠定了基础。     

结球甘蓝花粉蛋白延伸因子基因的克隆及其序列分析

 以结球甘蓝（Brassica oleracea L. var. capitata L.）E1花粉为试材,对萌发前后的花粉总蛋白进行双向电泳及差异蛋白质谱分析,发现延伸因子BoEF-Tu蛋白在花粉萌发后较萌发前表达上调。利用同源克隆得到甘蓝BoEF-Tu基因的全长cDNA序列,其长度为1 728 bp,具有一个完整开放阅读框（ORF）,位于112 ~ 1 473 bp处,编码453个氨基酸残基,预测分子量为49.17 kD,等电点为6.52。生物信息学分析表明：BoEF-Tu蛋白含有9个α–螺旋结构,18个β–折叠结构,不含信号肽和跨膜区,在106 ~ 121位氨基酸残基处有1个GTP结合区域（DKAPEEKKRGITIATA）。氨基酸同源性分析表明,BoEF-Tu与拟南芥EF-TuM同源性较高,达到93%;系统进化分析表明,BoEF-Tu与拟南芥EF-Tu的亲缘关系最近。     

施肥对新中78大白菜病害、产量及硝酸盐含量的影响

为了进一步制定出新中78大白菜配套的高产、高效、优质、安全的种植技术规程,实现良种良法配套推广,在2012年肥料试验的基础上,又开展了一次肥料试验,同时测定了硝酸盐含量。研究结果表明,以莲座末期追施尿素20 kg/667 m2,结球初期追施尿素20 kg/667 m2较好,硝酸盐含量略高,但与对照习惯施肥(结球初期一次性追施尿素40 kg/667 m2)相比较低,且产量较高。     

苹果MdAFS叶绿体定位表达对拟南芥萜类挥发物的影响

以‘青香蕉’苹果(Malus×domestica‘White Winter Pearmain’)α–法尼烯合酶基因(MdAFS)为目标基因,构建叶绿体定位的植物过表达载体,并通过农杆菌介导遗传转化拟南芥,获得使MdAFS在叶绿体中过表达的拟南芥转基因株系。将pBI122-rbcS1-pla-MdAFS-GFP表达载体瞬时表达本氏烟,分析表明叶绿体定位肽能成功将MdAFS蛋白定位到叶绿体中。定量测定莲座期和盛花期拟南芥光合色素,结果显示,转基因拟南芥叶绿素和类胡萝卜素含量较野生型显著增加。qRT-PCR分析萜类代谢相关基因转录表达水平表明,尤其在盛花期,过表达MdAFS能显著影响萜类代谢基因表达上调。应用静态顶空固相微萃取法收集拟南芥挥发物并结合GC–MS分析鉴定萜类挥发物成分,转基因拟南芥中萜类挥发物含量和种类明显增加。这些结果表明,过表达MdAFS能显著影响萜类代谢流的重新定向,增加萜类代谢挥发物。叶绿体是萜类代谢工程一个理想的亚细胞空间。