草莓FaABI5基因的克隆与表达分析

以‘红颜’草莓为试材,采用同源克隆方法得到FaABI5基因,利用荧光定量PCR法获取该基因的表达模式,通过转录活性验证和亚细胞定位分析其蛋白的特性,利用大肠杆菌诱导表达该蛋白,以期为进一步解析FaABI5的基因功能提供参考依据。结果表明:草莓FaABI5基因的开放阅读框为1329bp,共编码442个氨基酸,预测分子量约为47.1kDa,理论等电点为9.70,属于不稳定亲水蛋白。氨基酸序列比对显示该基因与其它物种的ABI5蛋白具有较高一致性,系统发育树表明草莓FaABI5与森林草莓、月季中的同源蛋白聚为一支,亲缘关系较近。获得该基因起始密码子上游1500bp长的启动子序列,分析显示除了有大量ABA响应元件ABRE外,还存在许多光、植物激素及非生物胁迫响应元件。qRT-PCR结果表明,FaABI5在草莓的根和茎中表达量最高,在果实中表达量较低。在酵母中,FaABI5不具有转录激活能力。亚细胞定位试验证明FaABI5为核定位蛋白。在大肠杆菌Rosetta(DE3)中,28℃自诱导24h可以获得具有生物活性的FaABI5重组蛋白。     

茶树DHAR酶基因的克隆与非生物胁迫响应分析

利用RT-PCR技术从茶树‘龙井43’cDNA中克隆得到1个编码茶树脱氢抗坏血酸还原酶基因CsDHAR,该基因全长639 bp,编码212个氨基酸,属于谷胱甘肽转移酶（GST）超级家族成员,具较高保守性。系统进化分析结果表明CsDHAR蛋白与拟南芥DHAR1、DHAR2进化关系近,在不同物种间,与毛果杨、胡杨等植物亲缘关系较近;理化性质分析表明CsDHAR属于亲水性蛋白;结构分析表明CsDHAR蛋白具典型功能结构域,三级结构主要由α–螺旋和不规则卷曲构成。荧光定量PCR分析显示,CsDHAR在茶树叶片不同发育阶段表达量差异不显著;对‘龙井43’与‘安吉白茶’中CsDHAR进行荧光定量PCR分析,‘龙井43’在低温、高温处理4 h表达量最高、干旱和高盐处理24 h表达量最高;‘安吉白茶’在高温、高盐处理4 h表达量最高,干旱处理2 h表达量最高。不同逆境胁迫下CsDHAR均被诱导表达,表明该基因参与茶树响应逆境胁迫调节过程。     

草莓FaCBF1基因的克隆及表达分析

据《园艺学报》2014年第2期《草莓FaCBF1基因的克隆及表达分析》（作者张勇等）报道，以“丰香”草莓为试材进行基因克隆，并通过SON—PCR结合RT—PCR技术检测了该基因在低温胁迫和其他环境胁迫下的诱导表达特性。     

草莓LFY 同源基因的克隆及其表达分析

 以草莓（Fragaria × ananassa）品种‘花姬’为试材,通过PCR和RACE的方法克隆出LFY同源基因的cDNA全长序列,命名为FaLFY（GenBank收录号JN788260）,通过定量PCR的方法检测了该基因在草莓植株各组织和花器官中的表达。结果表明FaLFY编码区长度为1 236 bp,编码412个氨基酸,与其他物种的氨基酸序列都有一定的同源性,其中与蔷薇科玫瑰的LEAFY-1同源性最高,达到88%。实时定量RT-PCR结果表明,在不同的组织、不同的花器官中FaLFY的表达量存在差异,其中在花芽中的表达量最高,在营养生长的组织中基本不表达,在成熟花器官中同样不表达,说明该基因在草莓的成花进程中发挥重要作用。     

草莓FaCOP1的克隆及其表达特异性分析

为探索草莓光形态建成抑制子FaCOP1的功能及其表达特异性,采用同源克隆法获得‘丰香’草莓FaCOP1的完整开放阅读框序列,对该序列及其编码的氨基酸序列进行相关生物信息学分析,同时采用qRT-PCR分析该基因的时空表达以及在不同光质处理下的表达模式。结果表明,FaCOP1开放阅读框全长1 989 bp,Gen Bank登录号为KX583676,编码662个氨基酸,蛋白质分子量为74.7187 kD,理论等电点为6.54,具有环形锌指域,卷曲螺旋域和WD40重复序列等3个保守结构域。序列比对以及系统进化树分析发现,COP1进化过程中具有高度保守性以及物种间的差异性。qRT-PCR结果表明,FaCOP1在草莓的根、茎、叶、花及成熟果实中均有表达,花中的表达量最高,其次是叶和根,而茎和成熟果实中最少。随着草莓果实的发育(从小绿期到全红期)FaCOP1的转录水平总体呈现递减的规律,与果实花青素积累模式相反。草莓叶片和果实的FaCOP1表达均能够被白、红、蓝及红蓝光(1︰1)诱导。FaCOP1在转录水平上没有阻遏FaHY5的表达,其关系需在蛋白质水平上进一步验证。     

苹果NAD–苹果酸酶基因的克隆及在不同组织和果实发育阶段的表达分析

 NAD-malic enzyme（NAD-ME）是植物调控苹果酸代谢中的关键酶。以富士苹果（Malus × domestica Borkh.）叶片为试材,通过同源比对和RT-PCR 技术,克隆获得2 个NAD–苹果酸酶基因 （MdNAD-ME1 和MdNAD-ME2）。其ORF 分别为1 785 bp 和1 818 bp,推测其分别编码595 和605 个氨 基酸的多肽。氨基酸序列和结构分析显示,含有5 个保守的氨基酸区域（Ⅰ~Ⅴ）,包含2 个功能结构域： malic 和NAD_bind_1_malic_enz。进化树分析结果显示,MdNAD-ME1 属于α 组双子叶亚组,MdNAD-ME2 属于β 组双子叶亚组。荧光实时定量结果显示,MdNAD-ME 在被检测的组织中呈组成型表达,且在多种 组织中MdNAD-ME1 表达量高于MdNAD-ME2。在富士苹果果实不同发育阶段,MdNAD-ME1 与MdNAD-ME2 具有不同的表达模式。以上结果表明,克隆得到的MdNAD-ME1 和MdNAD-ME2 属于植物NAD-ME,在 苹果的生长和发育过程中MdNAD-ME1 和MdNAD-ME2 可能起到不同作用。     

黑莓RuMYB10基因的克隆和表达

【目的】从黑莓中克隆RuMYB10的编码区全长序列,并分析其在黑莓果实发育过程中的表达情况与果实花青素苷积累的关系。【方法】以黑莓基因组DNA为模板,通过同源克隆和SON-PCR技术获得了RuMYB10基因全长编码序列(Accession No.:JQ359611);并以黑莓果实mRNA为模板进行验证。采用实时定量PCR技术检测该基因在果实不同发育阶段的表达水平。【结果】结果表明,该基因编码区全长共1 837 bp,编码216个氨基酸,推导蛋白分子质量为24 863 Da。具有MYB转录因子家族特有的R2R3保守序列。含有两个内含子,第2个内含子长度为750 bp,占全长40.8%;在R3重复单元中存在与bHLH因子互作的‘[DE]Lx2[RK]x3Lx6Lx3R’序列;而促进花青素苷合成的MYB转录因子3个特征氨基酸残基中的丙氨酸(A)被丝氨酸(S)取代。RuMYB10基因在黑莓果实发育后期,即果实变红到最后变黑的过程中大量表达,与花青素苷的积累相一致。【结论】从黑莓中克隆到包含完整ORF的转录因子基因RuMYB10,具有MYB因子家族结构特征和bHLH因子结合域,且在果实花青素苷积累高峰期表达量最高。     

黄瓜液泡膜H+-PPass基因CuPPase的cDNA克隆、序列分析与表达

 利用GenBank 登录的植物液泡膜焦磷酸酶氨基酸保守区序列设计简并引物,利用RT-PCR 和RACE-PCR 技术从黄瓜叶片中获得了一个液泡膜H⁺-PPase 基因,命名为CuPPase,GenBank 注册号为GQ223786。CuPPase 蛋白与南瓜、绿豆同源性最高,分别为94%,92%。生物信息学分析表明,该基因全长2 650 bp,开放阅读框（ORF）2 307 bp,编码768 个氨基酸;CuPPase 蛋白大小约80 kD,理论pI值为5.32。该基因有14 个强的跨膜螺旋结构,PlantCare 分析结果显示该基因序列具有脱落酸诱导、生长素诱导、赤霉素诱导、水杨酸诱导、低温诱导、干旱诱导的顺式作用元件。RT-PCR 表明,CuPPase 在叶和根中表达较高,茎中表达较低。CuPPase表达受盐胁迫以及高温、低温胁迫诱导,但与处理时间有密切关系,其表达均表现先升高后降低的趋势。     

水杨酸对草莓炭疽病响应基因FaNBS20 表达的影响

 以栽培草莓（Fragaria × ananassa Duch.）‘久香’叶片为试材,采用同源克隆和RT-PCR 方 法,克隆FaNBS20 全长cDNA 序列,并利用实时荧光定量PCR 技术检测外源SA 处理协同草莓炭疽病病 原菌侵染对FaNBS20 表达的影响。结果表明,FaNBS20 的开放阅读框为3 573 bp,编码1 190 个氨基酸, 预测的蛋白质分子量为134.5861 kD,含有1 个TIR 结构域、1 个NB-ARC 结构域和1 个亮氨酸的富集区, 与森林草莓（Fragaria vesca subsp. vesca）抗烟草花叶病毒蛋白（XP_004292718）同源性高达99%。接种 草莓炭疽病菌对草莓抗炭疽病品种‘甜查理’FaNBS20 的表达影响显著,易感病品种‘久香’FaNBS20 的表达则一直处于较低水平,表明该基因可能与对炭疽病的抗性相关。两个草莓品种在SA 处理后对草莓 炭疽病的抗性均明显增强,且持续期可以达到10 d 以上。在SA 和草莓炭疽菌协同诱导下,FaNBS20 基 因的表达量在抗性品种‘甜查理’和易感品种‘久香’中分别达到接种前的38 倍和7.2 倍。以上结果表 明,水杨酸能提高草莓对炭疽菌浸染的抗性,表达水平和炭疽病抗性水平相关的FaNBS20 基因可能是水 杨酸参与的对炭疽病抗性响应途径中一个重要的成员。     

低温胁迫对草莓叶片SOD和AsA-GSH循环酶系统的影响

以草莓试管苗为试材,研究低温胁迫对草莓离体叶片抗坏血酸、脱氢抗坏血酸含量和SOD以及抗坏血酸 -谷胱甘肽（AsA-GSH）循环中4种酶活性的影响。结果表明,低温胁迫导致超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶和单脱氢抗坏血酸还原酶活性上升,脱氢抗坏血酸还原酶和谷胱甘肽还原酶活性下降;同时使还原态抗坏血酸含量下降而脱氢抗坏血酸含量上升。随着低温处理时间延长,过多活性氧不能被防御体系有效清除,植物受到伤害。试验结果还表明,抗坏血酸过氧化物酶具有较强的氧化还原抗坏血酸的能力,单脱氢抗坏血酸还原酶是AsA-GSH循环再生抗坏血酸的主要酶。     

草莓9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶基因FaNCED的克隆及表达分析

采用RT-PCR和RACE技术从草莓果实中克隆ABA合成途径中关键基因FaNCED,该cDNA全长2228bp,具有完整的开放阅读框（ORF）,共1827个碱基,编码609个氨基酸。序列分析表明,FaNCED编码的氨基酸序列与其他植物的NCED蛋白有很高的同源性。系统进化树分析显示,草莓NCED与同为蔷薇科的湖北海棠聚为一类,与橙、柠檬、温州蜜柚、葡萄等非跃变型果实NCED蛋白亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析发现,FaNCED基因在草莓根、茎、叶、花萼和果实中都有表达;在果实成熟过程中FaNCED的表达出现两次高峰,分别在大白果期和红果期,且在红果期表达量最高,并与ABA积累相吻合;FaNCED在果实采后1d表达略有下降,之后急剧上升,ABA含量变化与FaNCED基因的表达基本一致。FaNCED可能参与调控ABA的合成并在草莓成熟中起一定作用。     

草莓9–顺式–环氧类胡萝卜素双加氧酶基因FaNCED的克隆及表达分析

 采用RT-PCR和RACE技术从草莓果实中克隆ABA合成途径中关键基因FaNCED,该cDNA全长2 228 bp,具有完整的开放阅读框（ORF）,共1 827个碱基,编码609个氨基酸。序列分析表明,FaNCED编码的氨基酸序列与其他植物的NCED蛋白有很高的同源性。系统进化树分析显示,草莓NCED与同为蔷薇科的湖北海棠聚为一类,与橙、柠檬、温州蜜柚、葡萄等非跃变型果实NCED蛋白亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析发现,FaNCED基因在草莓根、茎、叶、花萼和果实中都有表达;在果实成熟过程中FaNCED的表达出现两次高峰,分别在大白果期和红果期,且在红果期表达量最高,并与ABA积累相吻合;FaNCED在果实采后1 d表达略有下降,之后急剧上升,ABA含量变化与FaNCED基因的表达基本一致。FaNCED可能参与调控ABA的合成并在草莓成熟中起一定作用。     

膜荚黄芪查尔酮还原酶基因的克隆与表达分析

从膜荚黄芪中克隆了CHR基因,GenBank登陆号为KY086286(AmCHR),AmCHR全长cDNA为1 173 bp,开放阅读框为957 bp,编码318个氨基酸,其分子量为35.58 kDa,等电点为6.26。生物信息学分析表明AmCHR蛋白与豆科植物CHR同源,无信号肽,定位于细胞质。实时荧光定量PCR和高效液相色谱分析结果显示AmCHR在根、茎、叶中的表达水平与毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量变化一致。该研究从膜荚黄芪中克隆了1个新的AmCHR基因,推测AmCHR的表达与膜荚黄芪毛蕊异黄酮葡萄糖苷的积累密切相关。     

茶树亚硝酸还原酶基因CsNiR的克隆及表达分析

以‘龙井43’茶树叶片的cDNA为模板,利用RT?PCR技术克隆了茶树亚硝酸还原酶基因（CsNiR）,得到完整的ORF全长为1 764 bp,编码587个氨基酸;所推导的氨基酸序列与垂枝桦（Betula pendula）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、菠菜（Spinacia oleracea）和水稻（Oryza sativa）的同源性均大于76%。生物信息学分析表明,CsNiR分子量为68.648 kD,等电点为6.12,为亲水性的非分泌蛋白;二级结构的预测显示,CsNiR具有完整的NiR 蛋白结构,含血红素蛋白β–化合物区域和4Fe-4S区域。实时荧光定量结果表明,该基因在成熟叶片中表达量高于一芽二叶和根。采用营养液水培3个茶树品种,在氮饥饿两周后分别供应正常氮素和低氮素（1和0.1 mmol · L^-1 NH₄NO₃）,qRT-PCR测定发现,正常氮素处理的2 h和6 h,诱导根CsNiR表达量显著增加,叶片中的表达量变化延迟到24 h之后,且变化幅度存在基因型之间的差异;低氮处理对CsNiR表达量的影响相对较小。因此,研究CsNiR基因的表达特性及其在茶树氮素利用中所发挥的作用,需结合茶树基因型、组织部位、供氮水平等进行综合评价。     

换锦花LsMYB4基因的克隆与表达分析

以换锦花（Lycoris sprengeri）为材料,采用RT-PCR方法和RACE技术相结合的方法,从花瓣中克隆了MYB基因的cDNA全长序列,命名为LsMYB4。该序列全长793 bp,包含606 bp完整开放阅读框,编码201个氨基酸,具有明显的R2R3-MYB结构域,与中国水仙NtMYB相似性达96%。实时荧光定量PCR分析结果表明,LsMYB4在换锦花不同组织和不同花期均有表达,其中在花瓣中的相对表达量比叶中多9 ~ 10倍,在盛花期的相对表达量比花苞期多20倍。不同花色无性系花瓣中表达量存在差异,花色较浅的无性系高于其它无性系,推测LsMYB4在调控换锦花花色形成的过程中起着负调控作用。     

矮牵牛CHS基因启动子克隆、序列分析及植物表达载体构建

应用PrimerPremier5.0软件,根据GenBank数据库报道的查尔酮合成酶基因启动子序列(EF199747)设计1对特异性PCR扩增引物,以矮牵牛品种‘午夜蓝色’叶片总DNA为模板,用TaqDNA聚合酶成功扩增出1条约0.5kb的DNA片段,回收该片段并连接到pMD18-T载体上。结果表明:经测序该启动子片段长550bp;bl2seq分析结果表明该启动子与目标序列相似性高达100%;PLACE在线分析显示在克隆片段中含有TATAbox、CAATbox、capsite、antherbox、box1、box2、Gbox及TACPyAT-box等顺式元件;并构建了矮牵牛CHS基因启动子融合标记基因GUS的植物表达载体pPhCHS::GUS。     

香蕉茉莉酸合成关键酶基因MaOPR 的克隆和表达分析

 从‘巴西’香蕉（Musa acuminata L. AAA group‘Brazilian’）根的cDNA 文库中获得了一段 12–氧–植物二烯酸还原酶OPR（12-oxo-phytodienoic acid reductase）基因的片段,RACE 扩增获得全长, 命名为MaOPR。该基因全长1 512 bp,存在一个完整的开放阅读框1 287 bp,编码429 个氨基酸。生物 信息学分析表明,该蛋白属稳定蛋白,等电点为8.11,具有一个活性位点,一个基质结合位点,一个黄素 单核苷酸结合位点。序列预测分析该蛋白亚细胞定位为细胞质,其不属于跨膜蛋白且不存在信号肽。通 过和已知植物的12–氧–植物二烯酸还原酶基因相比,同源性达到66%以上。其中与苜蓿、谷子、粳稻、 紫云英的OPR 编码的氨基酸序列的同源性均为71%。器官特异性分析表明,MaOPR 在香蕉的根、茎、 叶片、花和果实中均有所表达,其中在茎和果实中表达量较高。通过对其在ABA 抑制剂、乙烯、枯萎病 胁迫下的表达结果分析显示,该基因响应以上3 种胁迫。