网箱养殖大黄鱼内脏白点病病原菌分离鉴定及致病性研究

为探究宁德市网箱养殖大黄鱼内脏白点病及其病原菌的致病性,通过宏基因组分析及对比,初步判定内脏白点病病原菌为假单胞菌属细菌.将分离纯化后的菌株ND2018对健康大黄鱼进行腹腔注射回归感染试验,证实菌株ND2018为大黄鱼内脏白点病病原菌.结合菌株ND2018的全基因测序结果,最终确定菌株ND2018为变形假单胞菌.试验结...     

大黄鱼内脏白点病的病原分析与鉴定

为实现大黄鱼 (Larimichthys crocea) 内脏白点病的生物防控,推进水产养殖用药减量,从健康大黄鱼肠道中筛选出对其内脏白点病病原菌——杀香鱼假单胞菌 (Pseudomonas plecoglossicid) 有拮抗作用的益生菌。采用琼脂扩散法筛选菌株,通过生理生化特征以及分子生物学分析,对菌株进行鉴定,并评价其溶血性、药敏性、安全性、产酶能力及抗菌广谱性。从健康大黄鱼肠道中初步分离出37株潜在益生菌,通过拮抗试验筛选出3株具有拮抗效果的菌株,分别命名为P1-17、P2-33和P3-11。通过生理生化特性及16S rRNA 测序分析,菌株P1-17和P2-33鉴定为贝莱斯芽孢杆菌 (Bacillus velezensis),菌株P3-11鉴定为粪肠球菌 (Enterococcus faecalis);溶血性试验和药敏试验结果表明3株菌均无显著溶血圈,且所含耐药因子较少,不具备潜在致病性;人工回感试验证实,3株拮抗菌对健康大黄鱼无致病性;抗菌谱测定结果表明,2株芽孢杆菌对溶藻弧菌 (Vibrio alginolyticus)、哈维氏弧菌 (V. harveyi)、美人鱼发光杆菌 (Photobacterium damselae) 等多种水产病原菌具有拮抗效果,同时2株芽孢杆菌具有产淀粉酶和蛋白酶的能力;而该株粪肠球菌只对杀香鱼假单胞菌有拮抗作用。研究结果可为后续大黄鱼肠道益生菌的筛选和应用提供科学依据。     

网箱养殖大黄鱼假单胞菌病病原的分离与鉴定

浙江宁波、台州等地相继发生网箱养殖大黄鱼的大量死亡,主要症状为脾脏、肾脏有许多白色结节,大小为0.1～1mm。从病鱼体内分离出致病力极强的菌株GYCWS,人工感染试验证实为大黄鱼的病原菌,其半数致死量(LD50)为8.5×104CFU/ml。对该细菌进行了形态、生理生化特性的测定,并进行了全自动微生物分析系统(ID32GN)及16S rRNA分子鉴定。经PCR扩增获得了大小约1.5Kb的16S rRNA部分基因片段,产物经回收纯化,克隆到pMD18-T载体,转化大肠杆菌TG1,对阳性克隆子进行酶切及PCR鉴定确认阳性重组质粒,将测定的序列递交NCBI进行BLAST同源序列比对,与恶臭假单胞菌的16S rRNA基因(DQ201403、AY785244)具有较高的同源性(99%),该序列在Genbank上的登录号为DQ648602。结合细菌的生理生化特性,GYCWS菌株属于恶臭假单胞菌(Pseudo monas putida)。药敏试验结果表明,病原菌GYCWS对卡那霉素、庆大霉素、丁胺卡那、氟派酸、四环素、链霉素药物敏感。     

福州地区大黄鱼变形假单胞菌的分离与鉴定

为研究2013年春夏之际罗源湾海区网箱养殖大黄鱼(Pseudosciaena crocea)内脏出现白点症状的病原,从具有临床症状的大黄鱼内脏中分离到优势菌,经回接感染试验证实该菌为病原菌;分析该病原菌的形态特征、理化特性、分类地位及药物敏感性等特性,结合16S r DNA序列构建的进化树与假单胞菌属恶臭群中的变形假单胞菌同源性最高,在99%以上,并通过看家基因gyr B序列分析进一步验证该菌为变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida);该菌对强力霉素、诺氟沙星、恩诺沙星3种抗生素敏感,对奥氟沙星、左氟沙星、四环素3种抗生素中度敏感。     

东海养殖大黄鱼细菌多样性分析

对2004年9月在闽东三都湾4个养殖场取样的大黄鱼进行了细菌多样性定性和定量分析。新捕获大黄鱼细菌总数为1.8×103~6.0×106cfu/g。从养殖密集海区的鱼体分离出135株细菌,对它们形态、生理生化、营养特征等进行系统鉴定,结果显示革兰氏阴性菌占优势。优势菌群为气单胞菌属(Aeromonasspp.)和嗜麦芽寡养单胞菌(Steotromonasmaltophilia),比例为34.1%和21.0%,摩氏杆菌属(Moraxellaspp.)、不动细菌属(Acinetobacterspp.)出现比例较少,均为2.2%,出现了较多数量的弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)(5.2%)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)(9.6%)。     

鳗鱼养殖安全危害分析与关键控制点

本文分析鳗鱼养殖生产过程产生药残、农残的主要危害有环境因子、鳗池土壤、水源、水质、苗种、饲料（包括生物饵料）、水产药物等投入品,以及鳗鱼包装运输受污染,提出了避免鳗鱼药残的关键控制点有鳗鱼苗种、生物饵料、水源、水质、土壤、配合饲料、药物使用、成鳗等,必须采取相对应措施加以控制。     

抗杀香鱼假单胞菌溶血素共调节蛋白单链抗体的制备及特性分析

杀香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)是大黄鱼(Larimichthys crocea)内脏白点病的主要致病菌,为制备能识别杀香鱼假单胞菌的特异性抗体,采用固相化抗原筛选方法,以杀香鱼假单胞菌重组溶血素共调节蛋白为抗原,从兔天然噬菌体scFv文库中筛选出特异性的单链抗体(scFv);通过构建含有针对杀香鱼假单胞菌单链抗体(scFv)的重组质粒,对筛选出的scFv进行原核诱导表达。通过4轮淘选,共获得16株针对杀香鱼假单胞菌溶血素共调节蛋白的单链抗体(scFv),通过亲和力分析,最终筛选出7株特异性较高的单链抗体(scFv)进行原核表达;成功构建了含有抗杀香鱼假单胞菌溶血素共调节单链抗体(scFv)的重组质粒pET-30a-Hcp-scFv,转化到大肠杆菌表达菌株中,其中6个重组质粒可稳定表达,经过蛋白质可溶性分析和Western Blot鉴定,目的蛋白主要以包涵体的形式存在。研究结果为快速制备大量抗杀香鱼假单胞菌抗体提供了一种简便的方法,为今后大黄鱼内脏白点病的临床快速诊断奠定了基础。     

腹腔注射葡萄糖对大黄鱼血液生化指标及糖代谢关键酶表达量的影响

为研究大黄鱼对葡萄糖的耐受能力和相关糖代谢关键酶的表达量,选取体质量约为100 g的大黄鱼禁食24 h,随机分为3个实验组,分别为对照组(0.9%的无菌生理盐水,CG组),低剂量葡萄糖组(300 mg/kg体质量,LG组)和高剂量葡萄糖组(1500 mg/kg体质量,HG组)。结果显示,大黄鱼在注射高剂量和低剂量葡萄糖后,血糖均在3 h达到最高水平,且HG组的峰值显著高于LG组,LG组在24 h恢复至正常水平,HG组在24 h仍然高于正常水平。HG组、LG组注射葡萄糖后,HK、GK基因相对表达量均显著上升,其峰值出现在注射后9 h。HG组PFK基因相对表达量在注射后6 h达到峰值。HG组PEPCK基因相对表达量在注射葡萄糖后显著下降,其中最低时间点为2 h。HG组G6PD基因相对表达量在注射后6 h显著高于其他各个时间点。研究表明,注射高、低浓度葡萄糖后,均会提高大黄鱼血糖水平,且能维持较长时间。注射葡萄糖后糖酵解途径关键酶如HK、GK、PFK及糖异生途径关键酶PEPCK基因相对表达量受血糖调节,但G6Pase、FBPase表达量并不因血糖升高而下降。导致注射葡萄糖后,大黄鱼不断产生内源性葡萄糖,这是大黄鱼表现为对高血糖不耐受的原因之一。     

杀香鱼假单胞菌Ⅲ型分泌系统转录调控蛋白ExsA突变株的构建及其对大黄鱼的毒力特征分析

杀香鱼假单胞菌是大黄鱼内脏白点病的致病菌,感染该菌常会导致养殖大黄鱼很高的死亡率和严重的经济损失。病原株NB2011编码典型的Ⅲ型分泌系统,可能是该菌重要的毒力因子,ExsA是控制此分泌系统表达的重要调控蛋白。为确认ExsA在NB2011致病过程中的作用,开发有效疫苗,实验采用双交换同源重组法构建了ExsA内部序列被卡那霉素基因替换的突变株,检测突变株与野生株对鼠巨噬细胞J774的黏附、内化和胞内增殖特性,并比较对大黄鱼的毒力变化,同时,通过透射电子显微镜观察人工感染后大黄鱼内脏组织的病理变化。研究表明,巨噬细胞对突变株的内化率降低,内化的细菌在12 h内被清除,野生株在内化后虽然一段时间内数量稍有下降,12~24 h期间数量急剧上升;突变株对大黄鱼的96 h LD_(50)为2.59×10~7/mL,比野生株高数百倍;电镜切片中未观察到组织内有菌体的存在,表明突变株的毒力明显减弱,可以作为弱毒疫苗的开发对象。     

池塘养殖水质的关键控制点及调节技术

随着水产养殖业快速发展,养殖方式由粗养转为集约化养殖,在提高产量、增加效益的同时,高密度集约化养殖也给水质带来严重污染：水体中悬浮物增多,BOD、COD、N、P含量增加,溶氧量下降,蓝绿藻大量发生,水环境恶化,导致鱼类病害频繁发生。据对我国30个省（市、区）74个养殖品种全年病害测报显示,2004年我国监测到的水产养殖病害有126种,病害造成的损失151亿元。。因此,创造一个良好的养殖水环境,不但是健康养殖的需要,也是保护生态环境的需要,更是保证水产品质量安全的需要。水环境污染已成为水产养殖行业普遍关注的问题。养鱼先养水,好水养好鱼,只有控制好水质,才能提高养殖鱼类的生长速度,减少疾病,实现高产、优质、高效的目的。本文将养殖鱼池中主要水质条件的关键控制点和调节技术作初步简述。     

养殖大黄鱼加工和冰藏过程中鲜度和细菌类型的变化

通过对养殖海水以及捕获、加工、流通和冰藏等整个供应链过程养殖大黄鱼的温度履历、感官、化学、微生物的品质监测,评估养殖海水、碎冰和加工过程中大黄鱼细菌卫生状况,分析其在整个过程鲜度和细菌相变化。结果表明,养殖海水和碎冰的菌落总数分别为4.99±0.41 lg cfu/g和3.90±0.32 lg cfu/g,大肠菌群数分别为30~450 MNP/100 g和低于30 MNP/100 g;新捕获养殖大黄鱼的菌落总数为3.82±0.38 lg cfu/g,假单胞菌数为3.13±0.58 lg cfu/g,嗜冷菌数为2.82±0.60 lg cfu/g,大肠菌群数为低于30 MPN/100 g;冰藏第18天时TVBN含量为28.62±0.51 mg/100 g,菌落总数、假单胞菌数、嗜冷菌数和大肠菌群数分别为6.24±0.06lg cfu/g、6.01±0.25 lg cfu/g、5.68±0.21 lg cfu/g和30 MPN/100 g。养殖海水和新捕获鱼中细菌种类繁多,革兰氏阴性菌分别占其总菌株数的64.9%和56.8%;革兰氏阳性菌分别占其总菌株数的27.0%和42.0%;优势菌群为黏性威克斯菌、腐败希瓦氏菌和假单胞菌属。加工结束后,假单胞菌(34.9%)、玫瑰小球菌(32.6%)和缺陷短波单胞菌(14.0%)成为主要菌群。冰藏第4天时仅分离出4种不同类型的细菌,腐败希瓦氏菌比例上升明显,冰藏第10天和第18天时,所占比例分别为63.5%和69.1%,是冷却链养殖大黄鱼产品的优势腐败菌。     

官井洋大黄鱼夏季食物组成和摄食习性

2010年6月在福建省官井洋海域收集579尾大黄鱼(Larimichthys crocea)标本进行胃含物分析,同步采集取样点附近水域浮游动物及张网样品,比较大黄鱼胃含物种类与水域中生物种类组成的相似性。结果表明:大黄鱼食物种类共32种,种类广泛。大黄鱼主要摄食十足类(相对重要性指标百分比%IRI=49.14%)、鱼类(%IRI=20.47%)、磷虾类(%IRI=18.31%)和糠虾类(%IRI=2.34%),具有以游泳动物、浮游动物为主要食物对象的肉食性摄食习性。细螯虾(Leptochela gracilis)(相对重要性指标IRI=976.10,%IRI=35.38%)和中华假磷虾(Pseudeuphausia sinica)(IRI=505.27,%IRI=18.31%)为大黄鱼食物组成中最重要的食物种类。海区中,浮游动物以桡足类为主,占所有浮游动物总丰度的45.03%,主要优势种为太平洋纺锤水蚤(Acartia pacifica,优势度Y=0.14)、双刺唇角水蚤(Labidocera bipinnata,Y=0.09)和中华哲水蚤(Calanus sinicus,Y=0.06);张网渔获物共鉴定91种,主要为细螯虾、白姑鱼(Argyrosomus argentatus)、大黄鱼(Larimichthys crocea)蟳、双斑(Charybdis bimaculata)、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)、银鲳(Pampus argenteus)鮻和棱(Liza carinatus)。研究表明,大黄鱼对食物种类具有明显的选择性,主要体现在喜好追逐捕食海区中的小型虾类和仔、稚、幼鱼以及体型相对较大的浮游动物磷虾类和糠虾类。     

官井洋种群网箱养殖大黄鱼的形态特征与生长式型

测定和研究了闽-粤东族官井洋种群养殖大黄鱼群体的形态特征与生长类型,并与文献报道的其亲本野生大黄鱼群体的形态特征进行了比较。结果表明:养殖大黄鱼的眼径/头长和体高/体长的比值普遍大于野生大黄鱼,而吻长/头长和眼后头长/头长的比值普遍小于野生大黄鱼。同时,养殖大黄鱼群体的眼径/头长、吻长/头长和头长/体长三项比值具有随着鱼体体长的增长而逐渐减小的特点。养殖大黄鱼体长与体重、体长生长与养殖时间的关系分别为:W=0.0195L2.9775(R2=0.9959)、y=-0.0259x2+1.7125x+4.1534(R2=0.989),鳔重与体重的比值为0.61%~2.26%,月平均鳔重指数1.08%~1.85%。     

大黄鱼C型凝集素受体Clec4e的分子鉴定及凝集特性

C型凝集素受体（C-type lectin receptor，CTLR）是可以特异性结合糖类病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）的模式识别受体（pattern recognition receptors，PPRs），在先天性免疫中发挥着重要作用。为了揭示硬骨鱼CTLR的生物学功能，本研究以从大黄鱼（Larimichthys crocea）转录组数据库中筛选出的一个CTLR基因—C型凝集素结构域家族4成员E基因（C-type lectin domain family 4 member E gene，Clec4e）为研究对象，研究其分子特征、表达分布和凝集特性。结果显示，LcClec4e cDNA全长1546 bp，开放阅读框（open reading frame，ORF）771 bp，编码254个氨基酸。LcClec4e的N端有一个跨膜区，无信号肽，C端含有一个糖识别结构域（carbohydrate recognition domain，CRD），其中含有糖结合位点EPN和WFD以及6个可形成二硫键的保守半胱氨酸。系统发育分析表明，LcClec4e与多种鲈形目鱼类Clec4e具有较近的亲缘关系。荧光定量PCR结果显示，LcClec4e在所检测的10种组织中呈组成型分布，且在肝脏中表达量最高；LcClec4e在来源于大黄鱼头肾组织的原代巨噬细胞、淋巴细胞和粒细胞中均有表达，且在巨噬细胞中表达量最高；经灭活溶藻弧菌刺激后，LcClec4e在3种免疫细胞中的表达均极显著上调。原核表达的重组LcClec4e胞外段（recombinant LcClec4e-extracellular domain，rLcClec4e-ex）具有Ca2+依赖性的凝集活性，可凝集小鼠、家兔的红细胞，以及嗜水气单胞菌、变形假单胞菌、溶藻弧菌和坎氏弧菌等4种水产常见的革兰氏阴性菌。D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-麦芽糖、α-乳糖和脂多糖均可抑制rLcClec4e-ex对大黄鱼重要病原菌变形假单胞菌的凝集作用，说明LcClec4e可能与变形假单胞菌表面的糖类物质结合。这些研究结果提示，LcClec4e可能作为一种PPR，通过结合病原菌表面的糖类PAMPs来识别病原，参与大黄鱼抗细菌感染的免疫防御。     

刺激隐核虫感染对大黄鱼生理生化指标及免疫指标的影响

刺激隐核虫感染能够导致海水鱼类感染“白点病”,而大黄鱼是受“白点病”影响最严重的海水养殖鱼类。为了探究刺激隐核虫感染对大黄鱼生理生化指标及免疫指标的影响,本研究利用刺激隐核虫人工感染大黄鱼,分别在感染后0、12、24、48和72 h采集血液、肝脏、脾脏、肠、鳃、头肾和皮肤组织,并检测血清皮质酮、皮质醇以及肝脏谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量等指标的变化。同时使用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）实验检测肝脏、脾脏、肠、鳃、头肾和皮肤组织中TNF-α、IL-8和IL-1β基因的表达量。结果显示,在大黄鱼感染刺激隐核虫后的0~72 h内,实验组大黄鱼表现出刺激隐核虫病的发病症状;血清皮质醇和皮质酮含量显著增加;肝脏GSH-Px活性极显著降低;肝脏SOD活性极显著增加;肝脏MDA含量在0~12 h内急剧增加并达到峰值,随后含量缓慢降低;各组织中的TNF-α、IL-8和IL-1β的表达量均有不同程度的上调,在鳃、头肾、肝脏和皮肤中上调最为显著。研究表明,刺激隐核虫感染后有明显变化的皮质类激素含量和氧化应激指标能够反映大黄鱼的感染程度,有助于进一步辅助抗虫表型测量的优化。     

大黄鱼幼鱼饲料中大豆磷脂油与菜籽油的适宜配比

配制浓缩大豆磷脂油与精制菜籽油的添加比例分别为0:6、2:4、4:2和6:0的4种等氮、等能和等脂的饲料(P0R6、P2R4、P4R2和P6R0),在海水浮式网箱中,养殖初始体重为(20.84±0.05)g的大黄鱼(Larimichthys crocea)幼鱼51 d,每个处理组设3个重复,每个重复40尾鱼。通过评定2种油脂的不同配比对大黄鱼幼鱼的生长、体组成和脂肪酸组成的影响,以得出大黄鱼幼鱼饲料中大豆磷脂油与菜籽油的适宜配比。结果显示,各组实验鱼的存活率均高于91%,且无显著差异(P0.05)。P2R4组实验鱼的特定生长率显著高于P4R2和P6R0组(P0.05)。P2R4组实验鱼的蛋白质沉积率和脂肪沉积率显著高于P0R6和P6R0组(P0.05)。P0R6和P2R4组全鱼的粗脂肪含量显著高于P4R2和P6R0组(P0.05)。全鱼和肌肉的脂肪酸组成受实验鱼所摄食饲料的脂肪酸组成的影响。P6R0饲料显著降低了实验鱼的肝脏脂肪含量和肥满度(P0.05)。研究表明,大黄鱼幼鱼饲料中浓缩大豆磷脂油与精制菜籽油的适宜配比为2:4。     

几种大黄鱼饲料应用效果比较

在福建宁德三都澳大黄鱼主养区,开展全程分别投喂市场反馈好、销量较大的某3种品牌大黄鱼配合饲料及(鲜杂鱼糜+A)饲养大黄鱼的对比试验。经过2年多来的应用试验,结果表明:配合饲料的诱食效果优于鲜杂鱼糜;大黄鱼养成投喂粗蛋白含量≥46.0%的配合饲料的养殖效果、经济效益与投喂(鲜杂鱼糜料+A)差异不显著(P0.05),但大黄鱼成活率显著提高;粗蛋白含量≥46.0%的优质配合饲料可以完全替代传统的(鲜杂鱼糜+优质配合饲料),可在大黄鱼养殖生产上大规模推广应用。     

大黄鱼仔稚鱼不同发育阶段矢耳石形态发育和微结构特征

对人工培育大黄鱼(Larimichthys crocea)的生长发育与矢耳石形态及微结构特征进行研究,结果表明:(1)大黄鱼矢耳石上的轮纹是每日形成的,第1日轮在孵化后第2天形成,与其初次摄食相对应。(2)大黄鱼卵黄囊期和前弯曲期仔鱼的耳石形态为圆形,进入弯曲期耳石长轴迅速伸长,在后弯曲期耳石形态变为椭圆形。进入稚鱼期,矢耳石开始形成次生核。随后次生核数量逐渐增加,在孵化后47～78 d的个体中,次生核数量稳定在5～7个,耳石近似盾形。(3)根据耳石日轮宽度推算的大黄鱼稚鱼在其仔鱼期生长率(b)与第1个次生核的形成时间(tsp1)之间存在明显的线性关系,表明生长较快的个体形成次生核的时间较早,进入稚鱼期所需的时间更短。以上结论表明,大黄鱼矢耳石可以反演其早期生活史阶段的生长发育特征。