钩丝孢属真菌高产蛋白酶菌株的筛选及其发酵条件优化

【目的】筛选钩丝孢属真菌高产蛋白酶菌株,并优化其产酶培养基和发酵条件,为寄生线虫病的生物防治提供优良菌种。【方法】以15株钩丝孢属真菌为材料,在28℃、180 r/min振荡培养10 d后,采用福林酚法测定其蛋白酶活性,筛选高产蛋白酶菌株,测定其产酶周期,并利用全齿复活线虫测定该菌株发酵液的杀线虫率。通过单因素试验和正交试验对高产蛋白酶菌株的产酶培养基及发酵条件进行优化,并对优化条件进行验证。【结果】从15株钩丝孢属真菌中筛选出1株高产蛋白酶菌株H6,其蛋白酶活性在发酵5 d最高。最佳产酶培养基成分为葡萄糖8 g/L、明胶8 g/L、蛋白胨8 g/L、酵母提取物4 g/L。最佳发酵条件为pH 7.0、20℃、260 r/min、接种2块直径5 mm的菌块。在此优化条件下,菌株H6蛋白酶活性为216.42 U/mL,比优化前(67.84 U/mL)提高了2.19倍。【结论】筛选出1株钩丝孢属高产蛋白酶菌株H6,获得了其优化产酶培养基和发酵条件。     

链格孢菌产细交链孢菌酮酸条件的优化研究

鉴于链格孢霉毒素细交链孢菌酮酸（TeA）对防治月季长管蚜有明显效果,为了进一步开发利用TeA,对1株链格孢菌（编号5390）产TeA的条件进行研究,通过单因素试验的方法,研究了不同培养基、不同培养温度、不同培养时间及不同光照条件对TeA含量的影响,在此基础上用响应面对链格孢菌产毒条件进行优化。结果表明产TeA的最佳条件为：理查培养基,黑暗培养,温度30 ℃,培养时间29 d。在此条件下进行试验验证,TeA含量为14.99 μg/g,与模型预测接近。对链格孢属真菌产TeA的培养条件进行筛选,探索真菌培养方式获得链格孢菌毒素TeA的方法,将有利于TeA的进一步开发利用。     

血散薯内生真菌的分离鉴定及其抗菌活性研究

从血散薯(Stephania dielsiana Y.C.Wu)中寻找活性内生真菌,为血散薯植物资源的保护及活性天然产物的开发提供依据,对其茎、叶中内生真菌进行分离鉴定,并研究其抗菌活性。结果表明,从血散薯茎、叶中共分离得到38株内生真菌,其中31株经形态学结合分子生物学的方法鉴定表明,其归为14个不同的属,包括链格孢属(Alternaria)、炭团菌属(Hypoxylon)、枝孢属(Cladosporium)、茎点霉属(Phoma)、镰刀属(Fusarium)、Stagonosporopsis、Ascomycete、毛壳菌属(Chaetomium)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)、弯孢霉属(Curvularia)、短梗霉属(Aureobasidium)、Annulohypoxylon、小光壳属(Leptosphaerulina)、刺盘孢属(Colletotrichum)。其中,优势属为链格孢属和茎点霉属。基于前期对峙拮抗预试验结果,选取14株内生真菌进行发酵培养,并测定其对9种植物病原真菌和10种动物病原细菌的抗菌活性。结果表明,内生真菌发酵产物粗提物对供试病原菌具有不同程度的抑制作用。其中,7株内生真菌(叶-8、Y-66、YB-12、J-12、J-34、J-36、J-55)的粗提物对5株或5株以上供试植物病原真菌具有明显抗菌活性。叶-8、J-12分别对玉米大斑病菌、金橘砂皮病菌表现出最佳的抗菌活性,EC_(50)值分别为0.063 1、0.006 2 mg/mL;J-34对甘蓝黑斑病菌、甘蔗凤梨病菌表现出最佳的抗菌活性,EC_(50)值分别为0.018 1、0.004 2 mg/mL。10株内生真菌的粗提物对金黄色葡萄球菌均具有抑制作用,MIC值介于0.500～10.000 mg/mL,4株内生真菌的粗提物对大肠杆菌具有抗菌活性,MIC值介于0.156～4.000 mg/mL。上述结果表明,血散薯茎叶中存在丰富的内生真菌资源,且其次生代谢产物具有广谱抗菌活性。     

顶孢霉菌(Acremonium hansfordii)液体培养最适条件及杀蚜毒力的研究

对自然感病的桃蚜幼虫上获得的顶孢霉菌株(Acremonium hansfordii)的最适培养条件及对甘蓝蚜的致病力进行了研究.结果表明,顶孢霉菌生长和产孢的最佳碳源为木糖,菌丝生物量和产孢量分别为1.806 mg/mL和7.061×106个孢子/mL;最佳氮源为尿素,其菌丝体含量和产孢量分别为0.242 mg/mL和54.07×106个孢子/mL;最适于顶孢霉菌菌丝生长和产孢的C/N为10∶1.液体培养至6-7 d时,菌丝生物量和产孢量均达到高峰,因此液体发酵终止时间应选择在接种后6-7 d.在接种后的第6 d,顶孢霉菌对甘蓝蚜的LC50为1.650×106个孢子/mL.     

堆肥中产纤维素酶真菌的筛选及其产酶条件

采集牛粪及其堆肥样品,通过纤维素—刚果红平板培养基初筛和摇瓶发酵复筛得到1株分解纤维素能力较强的真菌菌株F12,经形态学初步鉴定为青霉属(Penillium)。对该株真菌进行了产纤维素酶的适宜碳源、氮源、初始pH、接种量、培养时间和温度等培养特性的研究,结果显示：F12菌株的适宜碳源为麸皮和微晶纤维素复合碳源,氮源为硫酸铵,最佳培养条件为：pH值在5～6之间,接种量为5%左右,培养时间120 h,培养温度30～35℃。在此条件下,该菌株的CMCase活性达到47.5 IU/mL,FPA活性达11.1 IU/mL。     

不同碳源条件下链格孢菌培养特征的差异

利用不同的碳源培养基培养链格孢属真菌的7个种,观察7种链格孢菌的培养特征的差异,对其差异性进行分析研究,找出培养特征差异的规律,为链格孢属真菌的分类鉴定寻找新的途径。     

一株具有高毒力的蜡蚧轮枝菌最适培养条件筛选

为了筛选出一株具有高毒力的蜡蚧轮枝菌菌株,根据已有文献所记载的蜡蚧轮枝菌的培养条件,对一株蜡蚧轮枝菌菌株培养条件进行筛选,在不同接菌量、不同摇床转速、不同碳源和氮源条件下,分别比较了各处理组蜡蚧轮枝菌的产孢数量。结果表明,在接菌量为1%的液体培养基中产孢量最大,同时在培养转速160 r/min的条件下菌株产孢量与其他摇床转速处理差异显著,产孢量为1.46×10~9个/mL,在第6天供试碳源为葡萄糖的处理产孢量为1.26×10~9个/mL。菌株在供试氮源为蛋白胨的培养基中产孢量最大,为1.31×10~9个/mL,与供试氮源为酵母浸粉的处理之间差异显著。在以上条件下,蜡蚧轮枝菌菌株具有生长速度快、产孢量大和菌丝活力高等优点,并为更好地将该菌应用于大田生产提供了崭新的思路。     

厚垣孢普可尼亚菌PC7菌株液态发酵条件的筛选

为优化厚垣孢普可尼亚菌(Pochonia chlamydosporia)菌株PC7的液态发酵条件，研究不同发酵条件下厚垣孢普可尼亚菌PC7的产孢量与菌丝生物量，分析培养温度、初始pH、供氧量、接菌量对于PC7菌株液态发酵的影响。结果表明：PC7菌株培养液在培养温度为26℃、初始pH值为8、500 mL三角瓶装瓶量200 mL时，以0.5 mL为初始接菌量，产孢量在培养5～7 d时达到最大，是最适产孢条件。以菌丝生产为目标，进行液体发酵生产时，温度24℃、初始pH值为8、500 mL三角瓶装瓶量150 mL时，以1.0 mL为初始接菌量，菌丝干质量在培养5 d时达到最大，有利于提高菌丝产量，是最适培养条件。     

防治蓟马的球孢白僵菌SDDZ-9菌株液体发酵工艺优化

【目的】球孢白僵菌(Beauveria bassiana)作为一种重要的虫生真菌,已广泛应用于害虫生物防治,但其不成熟的规模化生产技术一直是限制球孢白僵菌广泛应用的主要问题之一。开展球孢白僵菌液体发酵工艺研究,提高液体发酵生物量,从而为固体发酵阶段提供优质的种子液,进而提高固体发酵的产孢量,为球孢白僵菌规模化生产提供参考。【方法】影响球孢白僵菌液体发酵的培养条件有温度、装样量、摇床转速、接种浓度和pH等,首先采用Plackett-Burman试验设计,筛选出影响球孢白僵菌菌株SDDZ-9的液体发酵的主要因子,然后运用最陡爬坡路径法,以试验值变化的梯度方向和各因素效应值的大小分别确定爬坡方向和变化步长,确定响应面的中心点,逼近最佳值区域,最后采用central composite design (CCD)响应曲面法,建立多元二次回归方程来拟合各因素与效应值之间的关系,并对影响发酵生物量的各因素及其交互作用进行响应面分析和评价,确定对西花蓟马(Frankliniella occidentalis)毒力较高的球孢白僵菌菌株SDDZ-9液体发酵的最优培养条件。【结果】培养温度、装样量、转速和浓度是影响发酵生物量的主要因子,一定范围内的pH变化对此菌株的液体发酵影响较小。在自然pH下,当培养温度27.08℃、装样49.72 mL（250 mL三角瓶）、摇床转速205.45 r/min、接种浓度1.122×10⁷孢子/mL时,发酵48 h产生的生物量最大。在优化发酵条件下进行液固双相发酵试验,得到的球孢白僵菌液体发酵生物量为14.769 g·L^-1,与模型预测生物量相符,固体发酵后产孢量为20.16 g·kg^-1,含孢量1.84×10¹¹孢子/g。【结论】在优化发酵工艺条件下进行发酵,可显著提高球孢白僵菌的产孢量,此液体发酵工艺为球孢白僵菌的规模化生产奠定了基础。     

鹿蹄草素对几种果蔬采后病原真菌的离体抑制作用研究

为寻找天然果蔬防腐剂,在离体条件下,采用生长速率法和培养板连续稀释法研究了鹿蹄草素对几种果蔬采后病原真菌的抑制效应,并对其最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)进行了初步确定。结果表明:鹿蹄草素的浓度越高,抑菌率越高,在2.5 mg/mL及以上浓度时对供试病原真菌均有较好的抑制效果。根据EC50值所得到的抑制作用由强到弱依次为链核盘菌(Monilinia fructicola),苹果轮纹病菌(Physalosporapiricola),链格孢菌(Alternaria alternata),根霉菌(Rhizopus stolonifer),灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)。其中链核盘菌的MIC和MBC分别为:0.156,1.25 mg/mL;苹果轮纹病菌的MIC和MBC分别为:0.078,0.156 mg/mL;链格孢菌的MIC和MBC分别为:0.313,0.625 mg/mL;灰葡萄孢菌的MIC和MBC分别为:0.156,0.313 mg/mL。     

缙云山土壤拮抗放线菌的分离、筛选与发酵条件优化

以烟草赤星病菌为指示菌,从缙云山土壤中分离和筛选出6株拮抗放线菌,其中JY-22对指示菌拮抗效果最好。对JY-22的抑菌谱测定结果表明:JY-22对棉花枯萎病菌、烟草赤星病菌、小麦纹枯病菌、柑橘疮痂病菌、茶云纹叶枯病菌和柑橘青霉病菌都具有较强的拮抗作用,抑菌率达41.9%~75.7%。通过单因子和正交试验对拮抗放线菌JY-22进行发酵条件的研究,结果表明,其最佳培养基组成和培养条件为:1 000 mL培养基中含葡萄糖2.0%、玉米粉1.5%、黄豆粉3.0%、氯化钠0.25%、碳酸钙0.2%,初始pH值为自然,250 mL三角瓶装液量为50 mL,发酵周期为72 h。     

褐多孔菌发酵代谢物的抑菌活性初步研究

采用滤纸片法和生长速率法分别研究了褐多孔菌发酵代谢物对7种常见细菌和6种植物病原菌的抑制作用。结果表明,发酵液乙酸乙酯部分对金黄色葡萄球菌、巨大芽孢杆菌抑制效果显著,最小抑菌浓度分别为2.50 mg/mL和1.25 mg/mL,浓度为0.5 mg/mL时对小麦赤霉病菌抑菌率达到100%,菌丝乙酸乙酯部分对蜡状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌最小抑菌浓度分别为1.25mg/mL和0.625 mg/mL,对白菜黑斑病菌和小麦赤霉病菌抑菌率均高于70%,菌丝及发酵液正丁醇部分对几乎所有病原菌抑制作用都很明显。     

五味子种苗带菌初步检测

通过洗涤法对五味子种子进行表面带菌检测,发现种子表面带有大量的青霉菌;采用平皿培养的方法对种子内部真菌进行检测,发现种皮携带的真菌有青霉菌、曲霉菌;种胚所带真菌主要为青霉菌、镰刀菌、曲霉菌、链格孢、根足霉。对五味子幼苗茎基部携带的真菌分离培养,发现此部位多带镰刀菌、链格孢和其他真菌。     

黄芪种子带菌检测及药剂消毒处理

采用离体平皿法,对黄芪种子进行了表面与内部的带菌检测;通过平皿培养法,分析了不同药剂对黄芪种子发芽率的影响,观察了药剂浸种的消毒效果。结果表明,黄芪种子携带的主要真菌类群为链格孢菌(Alternaria spp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)和青霉属(Penicilliun spp.)。世高、多菌灵和甲基托布津浸种处理对黄芪种子的发芽率无影响,而高浓度三唑酮浸种处理会显著降低黄芪种子的发芽率(P0.05)。100μg/mL的世高和500μg/mL的多菌灵浸种处理对黄芪种子有较好消毒效果,达到85.0%以上,建议选择作为黄芪播种前种子处理的药剂。     

番茄采后早疫病菌拮抗菌的筛选及发酵条件优化研究

[目的]筛选番茄采后早疫病菌拮抗菌,并优化其发酵条件。[方法]从番茄果实中分离出15株菌株,通过平板对峙法从中筛选出对番茄早疫病有拮抗效果的菌株,并对其摇瓶发酵培养条件（pH、温度、培养时间、转速、装瓶量和接种量）进行了优化。[结果]从番茄果实中筛选出了对番茄采后早疫病菌具有明显拮抗效果的菌株004,其最佳发酵条件为：初始pH7.0,温度30℃,装液量100/250 ml,接种量2.0%,培养时间48 h,转速210 r/min。通过发酵条件优化,发酵滤液抗菌活性得以提高,抑菌圈从0.20 cm提高至0.70 cm。[结论]为防治番茄早疫病菌提供了参考。     

粘小奥德蘑发酵液抑菌活性初步研究

摇瓶发酵粘小奥德蘑,对所得发酵液用滤纸片法和固体稀释法进行抑菌活性测定,发现其具有明显的抑制植物病原菌作用。确定具有活性的发酵液依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取,然后对乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃取后的发酵液进行抑菌试验。结果表明:粘小奥德蘑发酵液的活性物质主要集中在乙酸乙酯萃取物中,乙酸乙酯萃取物对白菜黑斑、烟草赤星、葡萄炭疽的最低抑菌浓度(MIC)为10 mg/ml,对小麦赤霉、番茄黑霉的最低抑菌浓度(MIC)为5 mg/ml。     

内生真菌2K3代谢产物抗菌活性研究

研究了从苦皮藤根皮中分离的一株编号为2K3内生真菌代谢产物的杀菌活性。生物测定结果表明，2K3菌株菌丝体的甲醇和乙酸乙酯提取物对多种植物病原真菌具有较强的抑菌活性。其中，甲醇提取物的抑菌活性比乙酸乙酯提取物强，在1 000μg/mL浓度下对烟草赤星病菌、马铃薯干腐病菌、小麦赤霉病菌、苹果炭疽病菌、玉米大斑病菌的菌丝生长抑制率均大于90%；抑制孢子萌发法试验结果表明，2K3菌株菌丝体的甲醇提取物对烟草赤星病菌玉米大斑病菌和马铃薯干腐病菌的EC50分别为59.4μg/mL、96.5μg/mL和132.5μg/mL；管碟法生测结果表明，2K3菌株菌丝体的甲醇提取物对枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌的抑菌圈直径分别为20 mm和27 mm；盆栽试验结果表明，2K3菌株菌丝体的甲醇提取物在2 000μg/mL浓度下对小麦白粉病的治疗和保护作用均在70%以上。     

油菜花瓣附生真菌区系及对核盘菌拮抗作用的研究

采集油菜不同部位脱落花瓣和未脱落花瓣进行附生真菌区系的分析,得到1908个菌株．除了核盘菌Sclerotinia sclerotiorum外,其他真菌经鉴定后主要属于10个属,它们是短梗霉属Aureubas／d／umspp．、镰刀菌属Fusarium spp．、交链孢菌属Alternaria spp．、葡萄孢属Botrytis spp．、黑葱花霉属Pericorda spp．、曲霉属Aspergillus spp．、黑孢属Nigrospora spp．、青霉属Peniccillium spp．、木霉属Trichoderma spp．和附球孢菌属Epicoccum spp．．其中,短梗霉菌、镰刀菌和交链孢菌为优势真菌群．通过菌丝间的相互作用、对峙培养方法测定160个菌株对核盘菌抑制作用．结果表明,供试菌株与核盘菌之间存在重寄生作用和溶菌作用等方面的拮抗机制．并初步筛选得到了一批拮抗作用较强、定殖能力也强的菌株．     

利用活体微生物农药防治铁皮石斛黑斑病研究

为利用活体微生物控制铁皮石斛生长过程中出现的黑斑病,采用测量抑菌圈的方法,通过从铁皮石斛土壤中筛选到的15种抑制菌,对显著抑制石斛黑斑病原菌的拮抗微生物进行了优选,并研究其单一发酵液和复合发酵液对石斛黑斑病菌的抑制作用。结果表明：筛选出的细菌进行单一发酵液试验,细菌B6、B8和B10有较强的抑菌能力;进一步将单一发酵液两两复合后发现,部分复合发酵液出现了明显的增效作用,其中抑菌能力最高及增效作用最强的是细菌B6和B8浓度为10.0mg/mL的复合发酵液,抑菌圈直径达到了32.4mm,该方法简便,费用低,实验周期较短,现象容易观察,适合小型的实验室研究。     

新疆小麦黑胚籽粒分离鉴定初报

对采自南北疆的31个县市119份小麦样品,初步的分离鉴定结果表明:新疆地区小麦黑胚病籽粒的分离物以细链格孢[Alternaria tenuis C. G. Nees]和小麦根腐离蠕孢[Biplaris sorokiniana (Sacc.) Shoem]为主,同时分离到细极链格孢[Alternaria tenuissima (Kunze ex Pers.) Wiltshire]、芽枝霉[Cladosporum spp.]、匍枝霉[Stemphylium spp.]、镰刀菌[Fusarium spp.]、球黑孢霉[Nigrospora sphaerica (Sacc.) Mason],但出现的几率不大.在吐鲁番地区小麦黑胚籽粒中分离到喙状突脐霉(拟)[Exserohilum rostratum (Drech) Leo.& Sug.],在和静的黑胚籽粒中,匍枝霉[Stemphylium spp.]分离率较多,同时分离出小麦生链格孢[Alternaria triticicola Vasant Rao].