过表达AtNEK6转基因烟草的耐旱耐盐性研究

NEK6基因编码一种丝/苏氨酸蛋白激酶,具有调控植物细胞周期蛋白基因表达和乙烯信号转导的功能,与植物抵抗逆境胁迫相关。将拟南芥AtNEK6基因导入烟草,利用甘露醇和NaCl模拟干旱和盐胁迫环境对T2代转基因烟草进行研究。结果表明,在无胁迫处理条件下,转基因烟草根长、侧根数和鲜重显著高于野生型;在干旱和盐胁迫条件下,转基因烟草根长、侧根数和鲜重均极显著高于野生型,表现出较强的耐旱耐盐性;胁迫处理的转基因烟草叶片叶绿素荧光参数值(Fv/Fm)、SOD和CAT活性以及Pro含量极显著高于野生型,MDA含量极显著低于野生型,进一步证明了AtNEK6基因能够促进烟草的生长和提高转基因烟草对于干旱与盐碱的抵抗能力。     

盐胁迫下MaAQP1转基因拟南芥幼苗的生长和生理响应

为了探讨盐胁迫对香蕉水通道蛋白质基因(Ma AQP1)转基因拟南芥幼苗的生长及抗逆性生理指标的影响,以Ma AQP1转基因拟南芥为研究对象,研究不同盐(Na Cl)浓度(0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、150mmol/L)处理下转基因拟南芥的表型及生理指标变化。结果显示:(1)经过盐胁迫后,野生型和转基因株系钾离子(K+)浓度降低,钠离子(Na+)浓度升高,而转基因株系K+和Na+浓度均明显低于野生型株系,同时,转基因株系具有较高的K+/Na+;(2)随着盐胁迫浓度的增加,野生型和转基因株系中电导率、丙二醛含量、脯氨酸含量及过氧化氢酶活性均逐渐升高,当盐胁迫浓度达到150 mmol/L时4个指标均达到高峰,其中,转基因株系中的电导率、脯氨酸含量及过氧化氢酶活性均比野生型的高,而丙二醛含量比野生型的低;(3)随着盐胁迫浓度的增加,野生型株系幼苗的根长缩短程度大于转基因株系,同时,转基因株系的根毛要远多于野生型。表明Ma AQP1能够提高转基因拟南芥的耐盐性。     

不同钠盐胁迫对黑心菊种子萌发的影响

为了解盐胁迫对黑心菊种子萌发的影响,采用纸上发芽法研究了不同浓度(0、50、100、150 mmol/L)Na2CO3、Na HCO3、Na Cl胁迫对黑心菊种子发芽率、发芽势、发芽指数及胚生长的影响。结果表明:随着盐溶液浓度的增加,黑心菊种子的发芽率、发芽势、发芽指数呈下降趋势,当盐浓度达到150 mmol/L时,Na HCO3和Na Cl处理的发芽势均等于0。种子对3种盐的耐受力大小为Na2CO3>Na HCO3>Na Cl;不同种类的盐胁迫对胚根和胚芽的影响不同,但总体表现为高盐抑制了胚根的生长,反映出胚根是对盐分胁迫较敏感的部位。     

组织培养下盐碱胁迫紫穗槐种子的萌发特性研究

将紫穗槐种子以MS为基本培养基添加不同浓度盐(Na Cl)、碱(Na HCO3,Na2CO3)进行种子萌发试验,结果表明:碱性盐(Na HCO3,Na2CO3)和中性盐(Na Cl)对紫穗槐种子萌发胁迫效应不一致。在碱性盐(Na HCO3,Na2CO3)胁迫下,低浓度处理对其种子相对发芽率和胚根有抑制作用,并且对各指标的抑制程度均大于Na Cl胁迫,同时随胁迫程度的增大,抑制作用越显著。在适应碱性盐(Na HCO3,Na2CO3)胁迫过程中耗能过多,可能活性氧清除系统失衡或其他膜系统等受到严重损害,说明碱性盐(Na HCO3,Na2CO3)胁迫对紫穗槐萌发的伤害作用远大于Na Cl,但是相关回归分析表明在283.11 mmol/L盐(Na Cl)的半致死的高浓度胁迫下仍能生长,说明紫穗槐对盐(Na Cl)胁迫有一定的耐受性。     

异源表达irrE转基因烟草的耐盐耐旱性

【目的】IrrE是从耐辐射异常球菌中发现的全局调控蛋白,主要通过修复强辐射等逆境条件下DNA损伤,提高耐辐射异常球菌对极端逆境环境的抗性。研究按植物密码子优化的irrE后导入烟草对转基因烟草耐逆能力的提高,为棉花等作物耐逆育种研究打下基础。【方法】按照植物密码子优化细菌irrE并合成基因;通过酶切连接法构建irrE植物表达载体;通过叶盘法转化烟草并PCR验证获得阳性转基因再生苗;通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析转基因株系中irrE的表达量;通过蛋白免疫印迹法(Western blot)检测IrrE编码蛋白;通过NaCl和甘露醇模拟盐处理和干旱处理分析纯和转基因株系的耐盐耐旱性,通过测定抗逆相关生理指标鉴定其对植物耐逆的贡献。【结果】按照植物密码子对irrE进行改造,共优化了241个密码子;构建了高效植物表达载体GBI-IE;利用除草剂草甘膦作为筛选剂获得转基因再生幼苗,并通过PCR验证共获得15个独立的转基因株系;通过q RT-PCR分析从中选取两个表达量最高的株系GO1和GO2进行后续的抗逆性分析;Western blot验证IrrE编码蛋白在GO1和GO2中能正确翻译。转基因烟草耐盐耐旱性分析:种子萌发试验表明,正常1/2 MS培养基上,转基因株系GO1和GO2发芽率和非转基因野生型对照之间没有明显的差异。然而250 mmol·L~(-1)NaCl培养基上GO1和GO2萌发率分别为78.8%和90.0%,野生型仅为10.3%,分别提高了68.5%和79.7%。类似地,300 mmol·L~(-1)甘露醇条件下,野生型的萌发率为39.7%,转基因株系GO1和GO2分别提高了42.9%和50.8%;正常萌发的种子移栽到250 mmol·L~(-1) NaCl和300 mmol·L~(-1)甘露醇条件12 d后,转基因株系根长、侧根数以及鲜重等生理指标显著高于野生型对照;温室中正常生长30 d的苗期烟草在250 mmol·L~(-1) NaCl处理下,转基因烟草SOD、CAT活性比野生型对照分别提高了48.80%和88.55%,而MDA含量比野生型对照降低了61.61%,胁迫响应基因Nt ABF2、Nt LEA5、Ntzfp、Nt CDPK2在GO1和GO2转基因株系中表达量均显著高于非转基因野生型。和盐处理结果类似,300 mmol·L~(-1)甘露醇的处理下,转基因烟草的耐旱生理生化指标均优于非转基因对照。【结论】烟草中异源表达耐辐射异常球菌irrE可以显著提高耐盐耐旱性;其多效性耐非生物胁迫能力的提高表明其可作为植物耐逆基因工程的优良基因源。     

大肠杆菌otsA基因的克隆和转化本生烟草

海藻糖是一类重要的渗透调节剂,可以提高植物抵抗多种非生物胁迫的能力。6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)是海藻糖生物合成的关键酶,在大肠杆菌中,ots A基因编码TPS。本试验通过PCR技术克隆ots A基因,构建p2300-ots A-GFP表达载体,用农杆菌介导的方法将ots A基因导入到本生烟草中。对筛选获得的转基因植株进行检测表明,ots A基因已成功整合到本生烟草的基因组中,并能进行有效转录。而且研究发现,转基因幼苗在含有150mmol/L Na Cl的培养基中能够生长,具有一定的抗盐胁迫能力。     

盐和干旱胁迫对芥菜型油菜种子萌发及幼苗生长的影响

【目的】 研究三种油菜种子萌发和幼苗生长对盐胁迫和干旱胁迫的响应,对不同种盐、旱胁迫油菜的耐受性提供科学参考。【方法】 以三种芥菜型油菜为材料,通过不同浓度的NaCl和甘露醇处理,研究其对三种芥菜型油菜种子萌发和幼苗生长的影响。【结果】 (1)在盐和旱胁迫中,随着NaCl和甘露醇浓度的升高,其种子发芽率、根长和株高均呈下降趋势。NaCl (<150 mmol/L)和甘露醇(<200 mmol/L)时,三种芥菜型油菜种子发芽率跟对照组没有显著差异;NaCl (≥200 mmol/L)和甘露醇(≥300 mmol/L)时,显著抑制了其种子萌发,CBJ004-34油菜保持了78%的发芽率。(2)NaCl (<150mmol/L) 和甘露醇(<100 mmol/L)时, Xinyou9 和CBJ004-34 油菜幼苗的根长跟对照没有显著差异;NaCl (<100 mmol/L)时,促进新油9号油菜幼苗根的伸长。【结论】 新油9号和CBJ004-34油菜种子的耐盐性和耐旱性好,该研究为选育油菜耐盐耐旱材料提供了参考依据。     

盐胁迫对黑龙江5种红小豆种子萌发的影响

为研究不同浓度Na Cl胁迫对黑龙江省红小豆种子芽期的影响,评价红小豆种子在芽期耐盐性,本试验以黑龙江地区5种红小豆为材料,设置5个Na Cl浓度梯度(32.5 mmol/L、65 mmol/L、97.5 mmol/L、130 mmol/L、162.5 mmol/L)及0浓度对照,探讨盐胁迫对5种红小豆种子发芽率、发芽势、根长、芽长、侧根数、根重及芽重的影响。结果表明:(1)盐胁迫具有抑制红小豆种子萌发作用;(2)低浓度(65 mmol/L)盐胁迫的抑制作用会随盐溶液浓度增加而增强,盐浓度高于65 mmol/L时严重抑制红小豆种子萌发;(3)综合各项指标5种红小豆中珍珠红的耐盐性最高。     

棉花亲环素基因GhCYP1的功能分析

【目的】研究转棉花GhCYP1对烟草耐旱能力的影响。【方法】利用Gateway技术构建GhCYP1的植物表达载体pGWB-GhCYP1,采用农杆菌介导的遗传转化技术,获得融合目的基因的转基因烟草植株。以烟草野生型（WT）、L1和L2转基因系为试验材料,测定水分胁迫条件下烟草叶圆片中叶绿素的相对含量、叶片中相对水分含量、丙二醛含量和相对电导率。【结果】与野生型烟草植株相比,转GhCYP1烟草植株根系粗壮、发达。水分胁迫下转基因烟草叶圆片中的叶绿素相对含量显著高于野生型。水分胁迫3 d,WT、L1和L2中相对含水量、丙二醛含量和相对电导率无显著差异（P<0.05）。水分胁迫13 d,转基因系叶片中相对含水量明显高于野生型（P<0.05）,丙二醛含量和相对电导率均明显低于野生型（P<0.05）。【结论】干旱胁迫对野生型烟草产生了较大影响,而转基因烟草显示出较强的耐旱能力,表明GhCYP1的过量表达有助于提高烟草的耐旱能力。     

转番茄正义抗坏血酸过氧化物酶基因提高烟草耐盐能力

 【目的】探讨叶绿体类囊体膜抗坏血酸过氧化物酶（tAPX）与耐盐性的关系。【方法】从番茄叶片中分离到类囊体膜抗坏血酸过氧化物酶基因（LetAPX）,利用农杆菌介导的叶盘法转入到烟草中。Northern 杂交分析了LetAPX在盐胁迫（NaCl）下的表达特征。以野生型（WT）,转正义LetAPX烟草株系T2-2（+）和T2-6（+）为试材,测定了盐胁迫条件下APX酶活性,过氧化氢（H2O2）含量,种子发芽率,植株的鲜重、干重,光合速率及叶绿素荧光参数。【结果】Northern杂交显示LetAPX已转到烟草基因组中,且基因的表达受盐胁迫的诱导。盐胁迫下转基因烟草的种子发芽率,植株的鲜重与干重,APX酶活性和清除H2O2的能力都显著高于野生型,并且转基因烟草比野生型具有更高的净光合速率（Pn）和PSII最大光化学效率（Fv/Fm）。【结论】LetAPX的过量表达有助于提高烟草的耐盐能力。     

过量表达AtNHXS1新基因显著提高水稻的耐盐性

以转基因和野生型水稻为材料,通过农杆菌介导法将AtNHXS1转到水稻植株中花11号中,分析在盐胁迫下Na+、K+含量的变化,对两者耐盐性进行比较,并对转基因株系进行分子鉴定和转录表达分析。结果表明:PCR初步鉴定得到了20个转基因株系,随机挑选2个PCR阳性株系进行Southern blot鉴定,确定AtNHXS1以单拷贝的形式成功插入到水稻基因组中。耐盐性分析表明,在盐胁迫条件下,转基因水稻植株的生长状况、干质量、鲜质量、Na+含量显著优于或高于野生型水稻植株;此外,300mmol/L NaCl处理下,转基因水稻植株能够正常存活,而野生型水稻5d内几乎全部死亡。将300mmol/L NaCl处理过的植株在无盐胁迫的条件下进行恢复生长试验,转基因植株10d内恢复正常,而野生型则不能。过量表达改组后的AtNHXS1新基因显著提高了水稻的耐盐性。     

盐胁迫对2种基因型波斯菊种子萌发和幼苗生长的影响

比较2种基因型波斯菊的耐盐性,采用不同浓度的Na Cl溶液(0、15、35、100、180 mmol/L)模拟盐胁迫环境,对种子发芽率、发芽势、相对发芽率、发芽指数、幼苗鲜质量、芽长、根长、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量等指标进行系统研究。结果表明,盐胁迫条件下,波斯菊的发芽率、发芽势、鲜质量、根长、芽长、SOD活性和MDA含量均受到显著影响。粉色波斯菊在低浓度(≤35 mmol/L)盐胁迫下可提高种子的萌发能力,促进幼苗生长;高浓度(≥100 mmol/L)则表现出明显的抑制作用。白色波斯菊对盐胁迫较为敏感,低浓度(≤15 mmol/L)胁迫就对种子萌发和幼苗生长产生抑制作用。粉色波斯菊的耐盐性较白色波斯菊强,可应用于盐碱化地区的植被修复和园林绿化。     

转Mz_2NHX_1基因拟南芥对盐胁迫的生理响应

为了探讨珠美海棠Na~+/H~+逆向转运蛋白基因Mz_2NHX_1在植物耐盐中的作用,以野生型拟南芥和转Mz_2NHX_1基因拟南芥为材料,研究不同盐浓度对转基因和野生型拟南芥种子萌发、植株耐盐性相关生理指标的影响。结果表明:在不同盐胁迫下,转基因拟南芥种子发芽率明显高于野生型。随着盐浓度的增加,野生型和转基因植株的电导率呈上升趋势;SOD活性呈先上升后下降趋势;POD活性、可溶性糖含量、脯氨酸含量在野生型植株中呈先上升后下降趋势,在转基因植株中呈不断升高的趋势。盐胁迫下,转基因植株的各项生理指标均优于野生型,表明Mz_2NHX_1基因的过量表达,提高了转基因拟南芥的耐盐性。     

秋茄KcTIP1基因克隆及其对植物耐盐性作用的研究

【目的】从秋茄中克隆液泡膜水通道蛋白KcTIP1基因,并研究其对植物耐盐性的作用机制。【方法】以秋茄幼嫩叶片为材料,通过PCR扩增克隆KcTIP1基因并构建其表达载体,采用根癌农杆菌介导法,用含重组质粒的农杆菌转化烟草植株,通过卡那霉素筛选和转基因烟草基因组PCR、RT-PCR鉴定,获得转基因再生植株;并选取其中2个阳性株系和野生型株系进行盐处理,测定野生型烟草(对照)与盐处理烟草根、茎、叶鲜质量,光合参数,叶片组织Na+、K+浓度以及根尖Na+、K+的流速。【结果】成功克隆得到了KcTIP1基因,对其编码蛋白氨基酸序列进行分析表明,秋茄KcTIP1包含MIP家族的特征序列SGGHVNPAVT和2个保守的NPA(Asn-Pro-Ala)位点。RT-PCR检测结果显示,KcTIP1基因在转基因烟草株系中成功表达。盐胁迫后,转基因烟草植株根、茎、叶鲜质量,叶片净光合速率,蒸腾速率,叶片组织Na+、K+积累和根尖Na+、K+内流幅度均高于野生型烟草。【结论】KcTIP1具有与其他水通道蛋白类似的蛋白结构和酶学功能,KcTIP1基因过表达可以提高转基因烟草的抗盐能力。     

NaCl和Na2SO4胁迫对萝卜种子萌发的影响

以萝卜种子为材料,采用培养皿滤纸发芽法研究了不同浓度的NaCl和Na2SO4胁迫对种子发芽特性的影响,以及解除盐胁迫后对发芽率进行测定.结果表明,低浓度的NaCl(≤50 mmol/L)和Na2SO4(≤25 mmol/L)促进种子的萌发,而高浓度的NaCl(＞ 100 mmol/L)和Na2SO4(＞50 mmol/L)抑制种子的萌发.解除盐胁迫后,萝卜种子的发芽率随原盐浓度的升高而呈降低趋势.     

农杆菌介导的转拟南芥AtCHX23基因玉米及其耐盐性

本研究通过农杆菌介导法将拟南芥耐盐基因AtCHX23导入玉米自交系郑58中,用PCR、Southern blot和RT-PCR法对转化玉米进行检测,并在150 mmol/L盐(NaCl)胁迫下对T3代转基因玉米和野生型进行耐盐性分析。结果显示:共获得26株转基因阳性植株;挑选长势较好的2个PCR阳性株系进行Southern blot鉴定,确定AtCHX23基因以单拷贝的形式成功插入到玉米基因组中,且AtCHX23基因在转基因玉米中过量表达。非盐胁迫条件下,野生型和2个转基因株系间生长状态及其可溶性糖、脯氨酸和丙二醛含量无显著差异;在150 mmol/L盐处理下,2个转基因株系的生长状态优于野生型,2个转基因玉米株系的可溶性糖和脯氨酸含量均高于野生型,丙二醛的含量低于野生型。综上所述:AtCHX23基因过量表达可以提高玉米苗期的耐盐性。     

过量表达TaNHX2基因提高转基因棉花的抗旱耐盐性

液泡膜Na+/H+反向转运蛋白在调节离子平衡,提高植物耐盐耐旱方面起着重要功能.为了研究液泡膜Na+/H+反向转运蛋白基因TaNHX2在棉花耐盐耐旱中的作用,以晋棉7号为受体,利用农杆菌介导法将克隆自小麦的TaNHX2基因转入棉花愈伤组织,通过组织培养胚状体发生途径获得转基因再生植株.以0.5％卡那霉素对再生苗筛选后,利用PCR和RT-PCR进行分子检测,证实外源基因已导入棉花并正常表达.在温室盆栽条件下,于4片真叶期对转TaNHX2基因棉花及其野生型对照施加NaCl或PEG胁迫处理,处理10天后发现盐胁迫或干旱胁迫显著抑制了棉花光合作用,提高了丙二醛(MDA)含量;转TaNHX2基因棉花的光合速率(Pn)显著高于野生型,MDA含量显著低于野生型;转TaNHX2基因棉花在盐旱胁迫后,叶片和根系中的Na+含量显著低于野生型对照.这些结果说明:在棉花中过量表达TaNHX2基因,盐旱胁迫下可以降低转基因棉花的Na+含量,提高光合速率,降低MDA含量,从而提高转基因棉花的耐盐抗旱能力.     

转P5CS基因马铃薯“东农303”耐盐、抗旱性研究

利用拟南芥Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因(P5CS)进行了马铃薯品种"东农303"的遗传转化,在盐和干旱胁迫下研究转基因植株的耐盐性和抗旱性。经PCR扩增,证实P5CS基因已整合到马铃薯基因组中。用150 mmol/L Na Cl溶液和干旱(基质含水量为20%~25%)胁迫处理20 d,发现转基因植株叶片的脯氨酸含量显著增加,SOD活性明显上升,而丙二醛积累量则缓慢,从而说明该品种更适合生长在干旱和盐胁迫条件下。     

河北省海岸带6种木本植物种子萌芽期的耐盐性比较

通过对不同浓度梯度(0、50、100、150、200、250、300 mmol/L)Na Cl胁迫下种子发芽势、相对发芽率指标的测定,分析白蜡、杜梨、沙枣、紫穗槐、小果白刺、柽柳6种木本植物种子的耐盐能力。结果表明:低浓度的Na Cl溶液对小果白刺、白蜡、杜梨种子的萌发具有促进作用,对沙枣、紫穗槐、柽柳有轻度抑制作用;当Na Cl浓度超过100 mmol/L时,6种植物种子的萌发均受到不同程度的抑制,发芽势、相对发芽率指标均呈明显下降趋势;当Na Cl浓度达到300 mmol/L时,白蜡、杜梨、沙枣的发芽势、相对发芽率均为0,紫穗槐的发芽率、发芽势为2%,说明胁迫强度超过了上述4种植物种子的忍受极限,而小果白刺、柽柳种子仍具有一定的活力,柽柳种子的发芽率高于小果白刺,表明柽柳种子在高浓度盐胁迫下的耐性最强。综合分析认为,白蜡的耐盐性最弱;杜梨、沙枣、紫穗槐、小果白刺的耐盐性中等;柽柳的耐盐性最强。     

AtNEK6在棉花旱盐胁迫响应中的功能分析

【目的】AtNEK6是在拟南芥中发现的一种NIMA相关激酶,在拟南芥中过表达AtNEK6能够促进植物的生长发育,提高植物的耐盐耐旱性。通过将AtNEK6转化棉花,研究其在抗逆中的分子机理,为培育耐旱耐盐碱棉花新品种提供理论基础和种质资源。【方法】采用农杆菌转化法,将来源于拟南芥的AtNEK6导入棉花,通过实时荧光定量PCR分析转基因株系中AtNEK6的表达量;通过观察转基因植株表型和扫描电镜观察细胞表皮细胞,分析转基因棉花的生长发育情况;利用甘露醇和NaCl模拟干旱处理和盐处理分析转基因棉花的耐盐耐旱能力,通过测定相关生理指标,鉴定AtNEK6对转基因棉花耐逆的贡献。【结果】利用卡那霉素筛选获得转基因幼苗,通过PCR鉴定获得10个不同的转基因株系;利用qRT-PCR分析筛选出表达量较高的L7、L17、L25株系。正常条件下,与野生型相比,转基因棉花的株高增高、叶面积增大,生长发育得到了促进,通过扫描电镜观察发现转基因棉花叶片的细胞表面积与野生型并无明显差异,细胞周期相关基因CYCB1;1和CYCA3;1及生长发育相关基因GhGRF5、GhEOD、GhAN3和GhEBP1的表达量均上调。通过耐盐耐旱性分析,正常条件下,与野生型相比,转基因株系的根长、鲜重和干重均无明显差异,仅侧根数增多;在250 mmol·L~(-1)甘露醇处理条件下,转基因株系的根长、侧根数、鲜重和干重均显著高于野生型,表现出更好的生长状态;在200 mmol·L~(-1)NaCl处理条件下,转基因株系的侧根数、鲜重和干重均显著高于野生型,相比于野生型生长状态更好。温室中正常生长1月龄的转基因棉花,在300 mmol·L~(-1)甘露醇处理条件下,转基因植株的SOD活性比野生型提高了0.65倍、0.42倍和1.45倍,CAT活性提高了0.65倍、0.64倍和0.42倍,MDA含量降低了0.51倍、0.41倍和0.22倍;250 mmol·L~(-1)NaCl处理结果与甘露醇类似,转基因棉花的耐盐生理指标均优于野生型。另外,相关胁迫响应基因GhAREB、GhDREB、GhNCED和GhLEA5在转基因棉花中的表达量均显著高于野生型棉花。【结论】AtNEK6通过参与细胞周期和生长发育的调控过程促进棉花的生长发育,同时提高棉花在逆境中的耐盐耐旱性。