枣树水通道蛋白基因生物信息学分析及原核表达载体的构建

利用生物信息学软件对已获得的枣树水通道蛋白基因cDNA序列ZjPIP2(DDBJ/EMBL/GenBank的注册号为:AB530493)进行了同源性及功能位点等多项参数分析,结果表明,此序列为全长846 bp的开放读码框(ORF),编码281氨基酸,分子量为29.87 kD,理论等电点为8.77;具有膜蛋白(MIP)家族典型的保守氨基酸序列HINPAVTFG和2个NPA保守肽段。序列相似性分析表明,该蛋白与已知的其他12种植物膜蛋白中的水通道蛋白具有极高的同源性,属于水通道蛋白的质膜膜内蛋白PIP2类。三级结构预测表明,其与菠菜(Spinacia oleracea)水通道蛋白(1z98A)有相似的三维结构。以克隆载体pSPORT1携带的枣树水通道蛋白基因cDNA序列为模板,PCR扩增后,经BamHⅠ和SalⅠ消化,与pET28a载体进行重组连接,测序结果显示,其原核表达载体构建成功。此结果为研究枣水通道蛋白基因在植物组织的分布、生物学功能以及可能的活性调节方式奠定了基础。     

鮸鱼应激蛋白STI1基因克隆及表达分析

根据获得的鮸鱼应激蛋白(stress-inducible protein I,STI1)基因的EST序列,克隆测序获得鮸鱼STI1基因的全长cDNA序列。鮸鱼STI1基因全长为2 194bp,包括5’非翻译区31bp,3’非翻译区634bp,开放阅读框1 629bp,编码542个氨基酸。根据氨基酸序列推测鮸鱼STI1分子中含有5个酪氨酸激酶磷酸化位点,1个多聚脯氨酸识别位点,2个核定位信号识别位点,9个TPR结构域。对物种间STI1基因比对表明,鮸鱼存在保守的半胱氨酸位点,与其他物种STI1基因的相似性在76.5%～94.3%之间。用邻接法构建的STI1基因的系统发育树表明,硬骨鱼类的STI1基因形成独立的一支,其中鮸鱼与大黄鱼的STI1基因同源性最高。荧光定量PCR结果显示,鮸鱼STI1基因的mRNA主要分布于肌肉和肾脏中。     

植物水通道蛋白的结构特征及其表达调控

水是生物体的主要组成部分,水在细胞和组织间的进出是所有生物代谢的基础。水通道蛋白形成选择性运输水、小分子溶质及气体的膜通道,在植物生长发育过程中起重要的作用。基因所编码蛋白的结构特征及其表达调控与其行使的功能密切相关。随着越来越多的水通道蛋白基因在高等植物中发现,人们对其结构、调控和功能有了更多了解。就水通道蛋白的分子结构以及表达调控方面的研究进展进行了概述。     

干旱-溃疡病菌胁迫下北京杨水通道蛋白基因表达特征分析

为揭示杨树溃疡病发生进程中的水分生理学机制,本研究以1年生北京杨为材料,对干旱-溃疡病菌胁迫下的杨树管家基因表达稳定性、与植物水分运输密切相关的杨树水通道蛋白基因家族的表达特征进行了实时定量PCR(RT-qPCR)分析。结果表明:12个管家基因的表达稳定性不同,TUB、UBQ、EIF4β-L、CYP、EF1α2表达稳定性最高,ACT2和ACT11稳定性最差;配对分析显示TUB、EIF4β-L和UBQ为干旱胁迫-溃疡病菌胁迫下基因表达检测的最优内参基因组合;干旱及溃疡病菌胁迫下,水通道蛋白基因的表达模式并不相同,说明这两种胁迫对杨树水分代谢具有不同的影响;干旱-溃疡病菌双重作用下,PIP1;1、PIP1;3、PIP1;5、PIP2;4、PIP2;7等5个基因的表达显著高于干旱、溃疡病菌两种胁迫的单独作用,揭示这两种环境胁迫对水通道蛋白基因表达具有一定的协同作用。     

猪水通道蛋白AQP1多克隆抗体制备及其在猪体内的免疫定位

采用分子克隆技术制备了猪AQP1多克隆抗体,并应用所制备的抗体分析了AQP1在猪体内的表达定位.结果表明:获得了特异性较强、效价较高的猪AQP1多克隆抗体;应用该抗体进行的免疫印迹和免疫组织化学试验显示,AQP1在猪小肠中央乳糜管内皮细胞、小胆管上皮细胞、肾脏的近曲小管上皮细胞以及大脑脉络丛上皮细胞表达.     

山核桃水通道蛋白CcPIP同源基因克隆与表达分析

利用RACE方法,在山核桃嫁接过程中扩增出山核桃水通道蛋白同源基因CcPIP。应用生物信息学软件进行分析,预测该序列编码294个氨基酸,具有6个跨膜区,有MIP家族信号序列和高等植物PIP高度保守序列。通过NCBI同源性比较分析表明,该基因与葡萄、菜豆等物种的水通道蛋白基因同源性达到99%。荧光定量RT-PCR分析表明,CcPIP基因在芽中的表达量最低,其次是雄花序,果实,幼叶和茎,而在根中表达量最高。在山核桃嫁接前后,CcPIP基因在接穗中表达趋势和在砧木中的表达一致。CcPIP基因的表达量在山核桃嫁接前砧木和接穗中都有强烈表达,但在嫁接后3 d急剧下降,分别在砧木和接穗中下降了5倍和2倍。在随后的11 d里,CcPIP基因的表达量在砧木和接穗中开始上升,至嫁接后14 d基因的转录水平比嫁接后3 d分别增加了7倍和4倍。该CcPIP基因参与山核桃嫁接成活的水分运输过程中起到基因表达调控的作用。     

蜡梅水通道蛋白基因分子特征分析及植物表达载体的构建

在已构建的蜡梅花cDNA文库及EST分析的基础上,通过对文库cDNA克隆全长测序,得到了1个蜡梅水通道蛋白基因,命名为CpAQP(GenBank登录号为:GU433105).cDNA全长1154 bp,最大ORF 810 bp,编码269个氨基酸.聚类分析和同源性比对表明,该蛋白基因属于TIPS亚族类,具有高度保守的MIP家族结构域.该蛋白具有6个跨膜结构,N-末端和C-末端都在细胞内.利用NetPbos 2.0对CpAQP蛋白进行磷酸化位点预浏,该蛋白C端丝氛酸磷酸化,可能在植物胁迫和亚细胞定位中起着重要作用.将该基因的cDNA编码序列连接到植物表达载体pCAMBIA2301g中,成功构建了CpAQP基因的植物表达载体pCAM-CpAQP.     

不同苹果矮化砧木导水特性与水通道蛋白基因表达对干旱胁迫的响应

研究苹果不同矮化砧木水力学特性与水通道蛋白基因表达对干旱胁迫的响应,以探讨干旱条件下苹果矮化砧木的水力学机制。以不同苹果矮化砧木自根苗M9、M26、MM106、GM256、SH6为试材,测定在干旱胁迫条件下,苹果矮化砧木叶片水势、光合作用相关参数、水力学特性参数,并采用荧光定量PCR的方法,对不同苹果矮化砧木叶片和根系中水通道蛋白基因PIPs(MpPIP1;1、MpPIP2;1)转录水平相对表达量进行测定。结果表明,水分亏缺下,5种苹果矮化砧木的叶片水势和对照相比均显著降低。净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)、胞间CO2摩尔分数(Ci)均出现下降。干旱胁迫下,5种苹果矮化砧木根系水力学导度均降低,但是水分处理间差异不显著。水通道蛋白基因MpPIP1;1、MpPIP2;1在5种苹果矮化砧木根系和叶片中的表达具有器官和组织特异性,MpPIP1;1、MpPIP2;1在各苹果矮化砧木根系中转录水平表达量均高于叶片。水通道蛋白PIPs(MpPIP1;1、MpPIP2;1)转录水平的表达对水分亏缺的响应在5种苹果矮化砧木间差异很大,干旱胁迫诱导后,水通道蛋白PIPs(MpPIP1;1、MpPIP2;1)既有表达上调,也有表达下调。MM106根系水力学导度和其他砧木相比,水分处理间差异最小,可能与干旱胁迫条件下PIPs(MpPIP1;1、MpPIP2;1)在MM106砧木根系中表达量较高相关联。水通道蛋白基因PIPs经干旱胁迫诱导后,在不同苹果矮化砧木品种中具有不同的表达模式。水分亏缺条件下,水通道蛋白基因PIPs在苹果矮化砧木水分运输、细胞水分的保持和维持适当的叶片水势以及光合作用中的积极作用,有助于提高苹果矮化砧木对水分胁迫的耐受性。     

香蕉水通道蛋白基因的克隆与表达分析

[目的]更好了解香蕉果实与水分代谢的关系。[方法]依据从抑制差减杂交文库(SSH)中获得的一个cDNA序列,设计5′和3′RACE引物,从香蕉果实中扩增基因5′和3′末端片段,并用RT-PCR的方法探讨该基因在香蕉各组织中的表达情况。[结果]获得一个1 132 bp的水通道蛋白全长基因,命名为MaPIPl;1。MaPIPl;1基因包含861 bp的完整阅读框架,编码的蛋白有6个跨膜结构及aspara-gine-proline-alanine(NPA)和aromatic/arginine 2个保守区。其与水稻水通道蛋白基因OsPIP1;2在氨基酸序列上有94.1%的一致性和97.9%的相似性。且MaPIP1;1在香蕉各器官中均稳定表达。[结论]MaPIPl;1可能与香蕉的水分代谢相关。     

珠眉海棠(Malus zumi Mats)盐应答MzSTO基因的克隆与表达分析

通过微列阵芯片(Microarray)分析,从珠眉海棠盐胁迫cDNA文库中分离得到MzSTO (Salt tolerance protein)全长基因.结果表明:MzSTO基因cDNA全长1 066 bp,开放阅读框共729 bp,5'-UTR和3'-UTR的长度分别是49 bp和288 bp; MzSTO编码242个氨基酸,N端有2个保守的B-box锌指结构域(CX2CX8CX7CX2CX4HX8H);半定量RT-PCR表明MzSTO基因受到盐和干旱胁迫抑制,受冷处理诱导,并响应ABA(abscisic acid).以上结果表明MzSTO基因可能通过依赖ABA的途径参与非生物逆境胁迫.     

干旱胁迫对马尾松菌根化苗木生长的影响

为了研究干旱胁迫下,不同菌根化苗木在生长形态方面的抗旱作用。以接种5种外生菌根真菌的马尾松苗木为材料,在温室内采用盆栽方法人工模拟自然干旱。结果表明：干旱胁迫下,外生菌根真菌能促进苗木的高、地径、根系生长及生物量积累,且不同菌种、相对含水量以及菌种与含水量间交互项均差异极显著( P<0.01)。中度胁迫时,接种土生空团菌苗木的高和地径生长最好,比对照分别增加了27.8%和52.9%;不同胁迫条件下,均以接种褐环乳牛肝菌1的苗木生物量积累最大,较对照增加了230%;干旱胁迫下,菌根菌能促进苗木地上和地下部分生长,尤其对根系作用明显,使菌根化苗木的根冠比显著高于对照,但不同菌种对宿主的亲和力大小有差异,且苗木对各菌根菌的依赖性也不相同。     

珠眉海棠水通道蛋白MzPIP1;1基因的克隆与表达分析

通过对珠眉海棠盐胁迫微列阵分析,从盐胁迫cDNA文库中分离得到盐诱导的水通道蛋白基因MzPIP1;1 cDNA序列全长1 135bp,开放阅读框共870bp,5′-UTR和3′-UTR的长度分别是91和174bp。MzPIP1;1编码289个氨基酸,有6个跨膜结构和2个NPA(Asp-Pro-Ala)保守区。聚类分析表明:MzPIP1;1和其他4个物种PIP1类同源性在80%以上,属于质膜水通道蛋白PIP1类。拟南芥原生质体瞬时转化结果表明MzPIP1;1定位在质膜上。半定量RT-PCR表明MzPIP1;1基因受到盐和低温诱导。推断MzPIP1;1基因在盐胁迫下的表达调控与珠眉海棠耐盐能力密切相关。     

甘蔗ATP结合蛋白基因克隆及其干旱胁迫下的表达特性分析

[目的]克隆甘蔗ATP结合蛋白基因,分析其基本生物学信息及在干旱胁迫下的表达特性,为ATP结合蛋白的功能研究提供理论依据.[方法]从乙烯诱导甘蔗差异表达转录组和水分胁迫下甘蔗cDNA文库中获取ATP结合蛋白基因序列,设计其引物进行RT-PCR扩增,利用生物信息学软件进行序列分析及其蛋白结构和功能预测,并采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测干旱胁迫处理下的甘蔗ATP结合蛋白基因的表达情况.[结果]克隆获得的甘蔗ATP结合蛋白基因全长2145bp,编码714个氨基酸,其蛋白分子质量为79.430kD,理论等电点(pI)为9.33,不稳定系数为44.38;甘蔗ATP结合蛋白与玉米ATP结合蛋白的核苷酸序列及其推导氨基酸系列同源性最高,均达93%.甘蔗ATP结合蛋白主要由无规则卷曲(42.02%)、α螺旋(25.63%)和延伸链(22.27%)结构组成,具有蛋白激酶催化结构域、ATP结合位点、核苷酸结合位点(NBS)、糖基化位点、激酶磷酸化结合位点及核定位信号等;甘蔗ATP结合蛋白可能主要定位在细胞核、叶绿体、线粒体和过氧化物酶体中,起中间代谢调控作用,或参与转录调控、免疫应答、胁迫应答及信号转导等生物反应.qPCR检测结果显示,在干旱胁迫7d后,甘蔗ATP结合蛋白基因的表达量明显下调,约为对照的30%,恢复正常供水(复水)后,表达量回升.[结论]甘蔗ATP结合蛋白基因表达受干旱胁迫诱导,可能参与甘蔗对干旱逆境胁迫响应的代谢调控.     

海岛棉GbMYB25基因的克隆及表达分析

根据陆地棉GhMYB25的序列,设计1对引物,通过RT-PCR技术从海岛棉品种新海21号中克隆了1个同源基因,命名为GbMYB25。GbMYB25基因具有1个930bp的开放阅读框,编码309个氨基酸,预测分子量约为34.762ku,等电点为8.08,推测的氨基酸序列中含有2个高度保守的SANT结构域。GbMYB25基因序列包含2个内含子。氨基酸序列比对表明,该蛋白和其他高等植物的MYB蛋白有较高的同源性。进化树分析表明,GbMYB25基因和陆地棉GhMYB25基因处在同一进化树分支。亚细胞定位表明GbMYB25基因在细胞核中表达,实时荧光定量PCR结果表明GbMYB25基因在胚珠(0doa)、纤维(5dpa)和叶片中的表达量较高。以上结果表明,GbMYB25转录因子可能参与棉花纤维发育。     

唐菖蒲丙二烯氧化物环化酶基因GhAOC的克隆与表达分析

克隆唐菖蒲AOC基因的全长cDNA序列,并分析该基因的表达模式及其对茉莉酸(Jasmonic acid,JA)生物合成的影响。以唐菖蒲栽培品种‘Rose Supreme’的球茎为试材,利用RT-PCR和RACE技术克隆AOC基因的全长cDNA序列;利用基因枪方法进行GhAOC基因的亚细胞定位分析;运用实时荧光定量PCR技术分析GhAOC基因的表达模式。克隆了1个全长为898bp的茉莉酸生物合成关键酶丙二烯氧化物环化酶(allene oxide cyclase,AOC)基因的cDNA序列,命名为GhAOC。该序列含有1个735bp的开放阅读框(ORF),编码244个氨基酸,推导的蛋白质分子量为26.52ku。亚细胞定位分析表明GhAOC是叶绿体蛋白。实时荧光定量RT-PCR表达分析显示,该基因在唐菖蒲叶、花、根、匍匐茎、新球茎和籽球上都表达,其中在新球茎和籽球中表达量最高;经过0.1～0.5mmol/L的MJ(methyl jasmonate,茉莉酸甲酯)处理后,逐渐提高了GhAOC基因在球茎中的表达量和内源MJ含量。GhAOC基因的表达促进了唐菖蒲茉莉酸的生物合成。     

菜粉蝶HSP20基因的克隆及温度胁迫下表达分析

[目的]克隆分析菜粉蝶(Pieris rapae)热激蛋白20基因(HSP20),并检测其在温度胁迫下的表达情况,为探析菜粉蝶适应温度胁迫机制提供参考.[方法]以菜粉蝶为试验材料,采用RT-PCR和RACE克隆获得菜粉蝶HSP20基因cDNA全长,并通过生物学软件分析其序列,明确其基因结构特征和亲缘关系;采用实时荧光定量PCR检测菜粉蝶HSP20基因在低温(-20~0℃)和高温(5~45℃)胁迫下的表达响应.[结果]菜粉蝶HSP20基因全长725 bp,5'-端非编码区105 bp,3'-端非编码区109 bp,开放阅读框531 bp,编码176个氨基酸,预测蛋白分子量19.5 kD,理论等电点6.61;其编码氨基酸序列中含有1个典型的HSP20家族结构域(位于第60~142位氨基酸)、1个α-晶体蛋白(位于第60~157位氨基酸)和1个Allato allatostatin(位于第14~24位氨基酸);基序列相似度分析其与二化螟、家蚕和甘蓝夜蛾HSP20蛋白氨基酸相似度较高并聚为一族.该基因随环境温度的升高或降低发生变化,在-5和40℃诱发该基因高效表达.[结论]低温和高温均能诱导菜粉蝶HSP20基因高效表达.     

大蒜己糖激酶基因AsHXK2的克隆及其参与根际促生菌缓解干旱胁迫的表达分析

为明确AsHXK2基因在根际促生菌缓解干旱胁迫下的作用,采用TA克隆方法克隆得到乐都紫皮大蒜AsHXK2基因序列,并对其基本特性进行生物信息学分析。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析了AsHXK2基因在大蒜不同组织和干旱胁迫、根际促生菌等条件下的表达情况。结果表明,AsHXK2开放阅读框全长1 500 bp,可编码499个氨基酸,分子量约为57.77 ku,理论等电点为6.37;亚细胞定位预测结果显示,AsHXK2蛋白主要定位于叶绿体,含有一个特异位点,属于己糖激酶2家族。在进化关系上,大蒜AsHXK2与天门冬科的芦笋HXK2亲缘关系最为接近。qRT-PCR分析表明,AsHXK2基因表达具有明显的组织特异性,其中鳞芽中的表达量最高。此外,不同组织中AsHXK2对根际促生菌作用下的干旱胁迫表现出不同的响应模式。干旱胁迫能够显著上调大蒜根、叶和鳞芽的AsHXK2表达水平;而在干旱胁迫施加根际促生菌的处理下,仅在叶中AsHXK2表达量显著高于干旱胁迫,表明叶片中AsHXK2对根际促生菌缓解干旱胁迫的响应较为明显。本研究为进一步探究根际促生菌缓解大蒜干旱胁迫的作用机制奠定了基础。     

草莓CO基因克隆与表达分析

采用RT-PCR和RACE技术从短日照草莓品种‘卡姆罗莎’(Fragaria×ananassaDuch.cv.‘Cama-rosa’)嫩叶中克隆得到与草莓成花相关的基因,命名为FaCO(GenBank登录号,FJ377616)。该基因cDNA全长1475 bp,1 152 bp的开放阅读框编码一个含有384个氨基酸,分子质量为42 ku的蛋白。该蛋白具有典型的CO同源蛋白结构,包含B-box1,B-box2,CCT结构域及COOH区域。序列分析结果表明,草莓CO蛋白与其他物种的CO蛋白具有较高的同源性,其中与杨树(Populus deltoids)的CO蛋白同源性最高,差异为80%。构建pGEX-4T-1/FaCO原核表达体系,获得了分子质量为60 ku的融合蛋白。     

黄瓜膜联蛋白基因CsANN2的克隆和表达分析

以‘津研四号’黄瓜品种为材料,克隆得到一个黄瓜膜联蛋白基因的cDNA全长,命名为CsANN2。为进一步探究黄瓜CsANN2基因的功能,对CsANN2基因编码的蛋白序列进行生物信息学分析后,发现其理化性质、保守结构域以及多个功能蛋白位点都和其他植物的膜联蛋白一致。系统进化树分析表明,黄瓜CsANN2与AtANN2、AtANN6、AtANN7、BjANN2和BjANN6有较近的亲缘关系。亚细胞定位结果显示,CsANN2蛋白在细胞膜、细胞质与细胞核内都有分布。qRT-PCR结果分析表明,CsANN2基因受ABA、SA、PEG和H2O2诱导表达,但对NaCl胁迫无响应。