MicroRNA828负调控缺磷胁迫诱导的番茄花青素生物合成

【目的】深入解析番茄miR828的生物学功能,特别是参与番茄缺磷胁迫响应和花青素生物合成的调控作用。【方法】分别利用psRNATarget和RLM-5′ RACE预测和验证miR828在番茄中的靶基因。用MegAlign和MEGA5对番茄SlMYB7-like与部分R2R3 MYB转录因子氨基酸序列进行了多重比对和进化树分析。用qRT-PCR分析miR828及其靶基因SlMyb7-like在AC、MicroTom和LA1996 3个不同番茄种质中的表达和miR828在番茄（AC）中的组织特异性表达模式。以miR828过表达转基因番茄和野生番茄为材料,设置正常供磷（+Pi,MS+KH₂PO₄ 3.4 g·L^-1）和缺磷（-Pi,MS+KCl 1.86 g·L^-1）2个处理的培养试验。用qRT-PCR分析miR828及其靶基因在缺磷胁迫下的表达模式。将野生型和miR828过表达的转基因番茄植株缺磷培养15 d后,观察番茄植株地上部分和地下部分的表型差异,通过qRT-PCR分析miR828、miR828的靶基因SlMyb7-like（SGN-U320618）和花青素合成相关酶基因（PAL、CHS、DFR、ANS、3GT和F3′H）的表达模式,应用分光光度计测量各样品的花青素含量。【结果】RLM-5′ RACE剪切试验表明miR828对靶基因SlMyb7-like存在剪切调控作用,且剪切作用位点位于成熟miR828的第10位和第11位核苷酸之间,从而验证了SlMyb7-like是 miR828直接作用的靶基因。氨基酸序列多重比对及进化树分析显示番茄SlMYB7-like与拟南芥AtMYB7和金鱼草MYB330的序列相似性最高。SlMYB7-like含有与花青素合成相关的保守氨基酸基序。miR828在MicroTom幼苗中的表达最高,在LA1996中的表达最低。相反,miR828靶基因SlMyb7-like在LA1996中的表达水平最高,在MicroTom中的表达水平最低。qRT-PCR分析显示SlMyb7-like的表达模式与miR828相反,证明SlMyb7-like被miR828调控。正常供磷条件下,野生型番茄各组织中miR828的表达量普遍较低,但在花芽、花和绿果中相对较高;miR828过表达转基因番茄植株中各花青素合成相关基因的表达量降低为野生型植株的30%-60%,花青素含量降低为野生型植株的40%。在缺磷胁迫下,野生型和miR828过表达转基因番茄植株中miR828及其靶基因SlMyb7-like的表达均受到诱导上调表达;转基因番茄植株地上部分和根系生长受到的抑制程度均小于野生型番茄;转基因番茄植株的颜色较野生型番茄植株颜色浅;转基因番茄植株中SlMyb7-like、花青素合成相关基因的表达以及花青素含量均低于野生型植株;miR828过表达转基因番茄植株缺磷胁迫耐受性却高于野生型番茄。【结论】在番茄中,miR828直接作用的靶基因是SlMyb7-like。野生型番茄所测组织中miR828的表达量普遍较低,但在花芽、花和绿果中相对较高。miR828及其靶基因SlMyb7-like的表达受缺磷胁迫诱导。在正常供磷和缺磷条件下,miR828过表达转基因番茄植株中各花青素合成相关基因的表达量和花青素含量均低于野生型,表明miR828通过靶向SlMyb7-like负调控花青素合成相关基因的表达,进而负调控番茄植株中花青素的生物合成。miR828能够提高番茄对缺磷胁迫的耐受性。     

过量表达转录因子OsbZIP60对水稻抗热和抗旱能力的研究

 【目的】利用转基因技术研究转录因子OsbZIP60的生物学功能,为培育抗逆水稻、减轻高温干旱对水稻的伤害奠定基础。【方法】构建水稻OsbZIP60的过表达载体pHB-OsbZIP60,通过根癌农杆菌介导的遗传转化法将其导入水稻品种日本晴,通过观察转基因植株和野生型植株在胁迫条件下的表型差异,分析其生物学功能。采用半定量PCR和荧光定量PCR检测OsbZIP60的表达模式以及其在转基因植株中的表达水平。【结果】在转基因植株中,OsbZIP60表达量明显高于野生型日本晴植株。OsbZIP60的表达受热信号诱导,在热激条件下,转基因植株的OsbZIP60表达量进一步升高。OsbZIP60在水稻各组织中均有表达,且在成熟植株叶片中表达量最高。转基因植株与野生型相比具有更强的抗胁迫能力,并且离体部分失水率更低。【结论】水稻转录因子OsbZIP60在水稻热胁迫和干旱胁迫应答中具有重要的作用,过量表达转录因子OsbZIP60能够增强水稻的抗热和抗旱能力。     

水稻顺式还原酮加双氧酶基因的表达分析及功能研究

【目的】农作物对逆境胁迫的耐受能力与产量息息相关,是作物育种要考虑的重要因素。文中对水稻顺式还原酮加双氧酶基因OsARD1进行研究,分析其表达模式,明确其在水稻应对非生物胁迫中的功能,为水稻耐旱品种的分子设计及育种提供参考依据。【方法】提取不同组织器官的总RNA,利用RT-PCR方法分析OsARD1表达的组织特异性。利用不同的非生物胁迫处理14 d大小的野生型（中花11）植株,在不同时间点提取总RNA,利用RT-PCR方法分析OsARD1表达的受诱导情况。通过农杆菌遗传转化法转化水稻愈伤组织,经过一系列分子检测后获得稳定遗传的T1代OsARD1的过量表达转基因植株,以转入空载体的野生型植株作为对照。将在营养液中正常培养的12 d大小的野生型和过表达幼苗移出营养液进行缺水处理并进行恢复试验。将催芽后的野生型和过表达转基因植株种子种在含有5% PEG6000的agar培养基中进行渗透胁迫处理,以不含PEG6000的agar培养基作为对照,观察二者的表型。【结果】组织特异性表达分析表明OsARD1主要在根及成熟的组织中表达,尤其在衰老的组织中有较高表达。非生物胁迫处理表明OsARD1的表达明显受机械损伤、高盐和渗透胁迫的诱导。获得6个独立株系的可稳定遗传的OsARD1过量表达转基因植株。对过量表达转基因植株及空载体野生型对照进行干旱胁迫处理,缺水处理5 h后,野生型植株叶片卷曲皱缩成针状表现出严重的缺水症状,但此时过表达转基因植株叶片仍处于舒展状态;缺水处理8 h后开始复水培养3 d,野生型植株的存活率仅为10%,而过表达植株存活率为80%,远远高于野生型,说明过量表达OsARD1提高了水稻对缺水的耐受能力。用PEG渗透胁迫模拟干旱胁迫处理6 d后发现,不含PEG6000对照组中野生型和过表达植株的幼苗生长情况没有明显的差别;在PEG处理组中,野生型幼苗根的生长受到严重抑制,而过表达植株幼苗根的生长受到抑制较小,根长明显长于野生型对照植株,说明过量表达OsARD1增强了水稻耐受干旱胁迫的能力。【结论】OsARD1主要在水稻根及成熟的组织中表达,并且受机械损伤、高盐和渗透胁迫的诱导。过量表达OsARD1提高了水稻抗旱性能。     

水稻顺式还原酮加双氧酶基因的表达及功能分析

【目的】农作物对逆境胁迫的耐受能力与产量息息相关,是作物育种要考虑的重要因素。文中对水稻顺式还原酮加双氧酶基因Os ARD1进行研究,分析其表达模式,明确其在水稻应对非生物胁迫中的功能,为水稻耐旱品种的分子设计及育种提供参考依据。【方法】提取不同组织器官的总RNA,利用RT-PCR方法分析Os ARD1表达的组织特异性。利用不同的非生物胁迫处理14 d大小的野生型(中花11)植株,在不同时间点提取总RNA,利用RT-PCR方法分析Os ARD1表达的受诱导情况。通过农杆菌遗传转化法转化水稻愈伤组织,经过一系列分子检测后获得稳定遗传的T1代Os ARD1的过量表达转基因植株,以转入空载体的野生型植株作为对照。将在营养液中正常培养的12 d大小的野生型和过表达幼苗移出营养液进行缺水处理并进行恢复试验。将催芽后的野生型和过表达转基因植株种子种在含有5%PEG6000的agar培养基中进行渗透胁迫处理,以不含PEG6000的agar培养基作为对照,观察二者的表型。【结果】组织特异性表达分析表明Os ARD1主要在根及成熟的组织中表达,尤其在衰老的组织中有较高表达。非生物胁迫处理表明Os ARD1的表达明显受机械损伤、高盐和渗透胁迫的诱导。获得6个独立株系的可稳定遗传的Os ARD1过量表达转基因植株。对过量表达转基因植株及空载体野生型对照进行干旱胁迫处理,缺水处理5 h后,野生型植株叶片卷曲皱缩成针状表现出严重的缺水症状,但此时过表达转基因植株叶片仍处于舒展状态;缺水处理8 h后开始复水培养3 d,野生型植株的存活率仅为10%,而过表达植株存活率为80%,远远高于野生型,说明过量表达Os ARD1提高了水稻对缺水的耐受能力。用PEG渗透胁迫模拟干旱胁迫处理6 d后发现,不含PEG6000对照组中野生型和过表达植株的幼苗生长情况没有明显的差别;在PEG处理组中,野生型幼苗根的生长受到严重抑制,而过表达植株幼苗根的生长受到抑制较小,根长明显长于野生型对照植株,说明过量表达Os ARD1增强了水稻耐受干旱胁迫的能力。【结论】Os ARD1主要在水稻根及成熟的组织中表达,并且受机械损伤、高盐和渗透胁迫的诱导。过量表达Os ARD1提高了水稻抗旱性能。     

水通道蛋白基因OsPIP2;6的功能分析

【目的】分析水稻过表达OsPIP2;6在逆境胁迫条件下的表型差异,探讨水通道蛋白基因在水稻逆境应答中的作用。【方法】构建水稻水通道蛋白OsPIP2;6的过表达载体,通过农杆菌介导将其导入水稻日本晴的愈伤中,经遗传转化,阳性鉴定,得到转基因植株。通过逆境胁迫下转基因植株的表型分析来探讨OsPIP2;6的功能。【结果】Real-time PCR结果显示,OsPIP2;6受GA、ABA调控。转基因植株的OsPIP2;6表达量显著提高。正常条件下,转基因植株与野生型植株生长发育情况并无显著差异。在逆境胁迫条件下,转基因植株的耐受能力均显著强于野生型植株。【结论】过表达水稻水通道蛋白基因OsPIP2;6的转基因植株表型显示,OsPIP2;6在水稻的抗旱、抗水淹和抗盐中发挥作用。     

过量表达OsAPX1基因增强水稻的抗热和抗氧化能力

抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)是植物体内活性氧清除的关键酶,在植物逆境应答中发挥着重要作用。通过构建水稻OsAPX1基因的过表达植物载体,利用根癌农杆菌介导法导入水稻品种日本晴获得转基因植株。半定量RT-PCR分析表明,转基因植株中OsAPX1表达水平明显提高。田间T0代过表达转基因植株在高温条件下的秕谷率显著低于野生型。热激胁迫实验显示,转基因株系比野生型具有更强的耐热性。在过氧化氢胁迫下,转基因植株也表现出更强的抗氧化能力。该结果表明水稻OsAPX1基因在活性氧清除中发挥功能,过量表达OsAPX1能够增强水稻的高温抗性。     

水稻木葡聚糖内糖基转移酶基因OsXTH11过表达的作用分析

【目的】利用转基因技术对水稻XTH（OsXTH11）进行分析,了解其在水稻生长发育调节和逆境应答中的作用。【方法】构建OsXTH11过表达载体,利用农杆菌介导法将其导入水稻品种日本晴,通过对转基因植株进行表型分析和分子检测验证OsXTH11功能。【结果】Real-time PCR分析结果表明,转基因植株中OsXTH11表达水平明显提高。对T1转基因幼苗的表型分析显示,在正常生长条件下,转基因幼苗生长速度快于野生型;对赤霉素（GA）和生长素（IAA）的响应程度强于野生型;在黑暗和深水条件下,茎伸长速度均显著快于野生型;对100 mmol•L-1 NaCl的耐受能力也优于野生型植株。【结论】过量表达水稻木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶基因OsXTH11的转基因植株表型显示,OsXTH11在水稻生长发育和抗盐胁迫中发挥作用。     

异源表达Peu-miR473 a增强拟南芥的抗旱性

为了探究胡杨miR473a基因的功能,本文克隆了miR473a的前体Pre-Peu-miR473a,并利用农杆菌花序侵染法将其遗传转化入拟南芥。通过普通PCR和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)组织化学染色检测获得CaMV35S: miR473a过表达植株,然后对转基因和野生型植株在甘露醇模拟高渗环境与土壤自然干旱条件下的生长状况及各项生理指标进行评价。结果表明,胡杨miR473a前体长度为100 bp,与毛果杨前体序列相似度为100%,可以形成完美的二级茎环结构。相比于野生型,过表达胡杨miR473a的拟南芥在200 mmol/L甘露醇胁迫条件下的萌发率、根长和生长状况都优于野生型;在土壤干旱处理条件下,转基因拟南芥的株高、相对含水量、脯氨酸含量以及光系统Ⅱ(PSⅡ)最大光合效率均显著高于野生型10%以上(P0.05)。半定量PCR检测显示:Peu-miR473a参与胡杨受干旱胁迫的正调控,杨树中预测的靶基因Potri.012G093900、Potri.007G100200、Potri.009G165300、Potri.004G204400受干旱胁迫的负调控;拟南芥中预测的靶基因AT1G24530、AT5G45000、AT5G46070及AT3G52950在转基因株系中表达量下降。初步预测它们有可能被miR473a靶向调控。本研究表明,miR473a基因在干旱胁迫条件下通过调控植株的抗脱水能力和渗透调节能力发挥一定抗旱作用。      

过量表达AtNHXS1新基因显著提高水稻的耐盐性

以转基因和野生型水稻为材料,通过农杆菌介导法将AtNHXS1转到水稻植株中花11号中,分析在盐胁迫下Na+、K+含量的变化,对两者耐盐性进行比较,并对转基因株系进行分子鉴定和转录表达分析。结果表明:PCR初步鉴定得到了20个转基因株系,随机挑选2个PCR阳性株系进行Southern blot鉴定,确定AtNHXS1以单拷贝的形式成功插入到水稻基因组中。耐盐性分析表明,在盐胁迫条件下,转基因水稻植株的生长状况、干质量、鲜质量、Na+含量显著优于或高于野生型水稻植株;此外,300mmol/L NaCl处理下,转基因水稻植株能够正常存活,而野生型水稻5d内几乎全部死亡。将300mmol/L NaCl处理过的植株在无盐胁迫的条件下进行恢复生长试验,转基因植株10d内恢复正常,而野生型则不能。过量表达改组后的AtNHXS1新基因显著提高了水稻的耐盐性。     

过表达番茄Sly-miR397基因增强拟南芥的耐旱性

为研究番茄miRNA在非生物逆境胁迫下的表达模式和功能分析。利用Real-time PCR检测番茄miRNA397在非生物逆境(干旱、盐害、ABA)条件下的表达量变化,发现Sly-miR397响应这些逆境胁迫,尤其在干旱胁迫下表达最明显。故将Sly-miR397过表达载体转入拟南芥中,进行转基因功能验证。结果表明:与野生型相比,转基因拟南芥植株叶片相对含水量下降速率更缓慢,保水能力更好,且在干旱胁迫下,转基因植株的长势明显优于野生型,其最大光合效率、3种抗氧化酶活性SOD、POD、CAT均明显高于野生型,同时胁迫所产生的丙二醛含量明显低于野生型拟南芥。表明Sly-miR397能提高拟南芥对干旱胁迫的耐受性,在植物抗旱过程中起着重要作用。     

超量表达胡杨peu-MIR156j基因增强拟南芥耐盐性

Micro RNAs（miRNAs）是一类内源性的非编码小分子RNA。本文克隆了miR156j的前体（peu-MIR156j）,并将其转入拟南芥获得35S：MIR156j转基因植株。对转基因植株的鉴定表明,过量表达miR156j增加了拟南芥莲座叶的发生,导致叶片浓密及开花延迟。这一结果表明：同拟南芥、水稻等物种类似,胡...     

水稻砷污染健康风险与砷代谢机制的研究

水稻是人类主要的粮食作物之一，然而，目前稻米主要生产区（东南亚地区）的土壤和灌溉水砷污染严重，导致稻米中砷的积累；砷在稻米中的积累通过食物链传递，对人体健康构成严重威胁。所以，稻米砷污染问题已成为东南亚地区比较突出且急需解决的环境问题之一，而减少水稻对砷的吸收、控制水稻体内砷向籽粒转移、降低籽粒中砷的生物有效性是解决这一问题的关键途径。因此，深入理解水稻对砷的吸收、体内转运和转化等代谢机制非常有必要。近年来有关水稻对砷的吸收和体内砷代谢机制的研究取得了很大进展。研究表明，水稻根系通过磷吸收通道吸收五价砷（As（Ⅴ）），水通道吸收三价砷（As（Ⅲ））。进入水稻体内的砷，一部分由地下部转运到地上部，其中一部分进一步被转运到水稻籽粒中。根表铁膜能抑制水稻对As（Ⅴ）的吸收和向地上部的转运。在水稻的地下部和（或）地上部还存在着As（Ⅴ）还原、As（Ⅲ）甲基化等砷形态的转化过程。最近，水稻砷酸盐还原酶基因已经被克隆和表征。     

棉花亲环素基因GhCYP1的功能分析

【目的】研究转棉花GhCYP1对烟草耐旱能力的影响。【方法】利用Gateway技术构建GhCYP1的植物表达载体pGWB-GhCYP1,采用农杆菌介导的遗传转化技术,获得融合目的基因的转基因烟草植株。以烟草野生型（WT）、L1和L2转基因系为试验材料,测定水分胁迫条件下烟草叶圆片中叶绿素的相对含量、叶片中相对水分含量、丙二醛含量和相对电导率。【结果】与野生型烟草植株相比,转GhCYP1烟草植株根系粗壮、发达。水分胁迫下转基因烟草叶圆片中的叶绿素相对含量显著高于野生型。水分胁迫3 d,WT、L1和L2中相对含水量、丙二醛含量和相对电导率无显著差异（P<0.05）。水分胁迫13 d,转基因系叶片中相对含水量明显高于野生型（P<0.05）,丙二醛含量和相对电导率均明显低于野生型（P<0.05）。【结论】干旱胁迫对野生型烟草产生了较大影响,而转基因烟草显示出较强的耐旱能力,表明GhCYP1的过量表达有助于提高烟草的耐旱能力。     

过量表达OsRRK1对水稻叶片发育的影响

[目的]OsRRK1(rop-interacting receptor-like kinase 1)属于胞质类受体激酶RLCK VI家族成员,通过对OE-OsRRK1转基因水稻的叶片形态观察,明确OsRRK1在水稻叶片发育中的作用.[方法]依据水稻基因组数据库公布的目标序列设计引物并构建OsRRK1超量表达载体,利用农...     

梭梭HaNAC12转录因子抗逆功能验证

【目的】验证梭梭NAC转录因子基因（HaNAC12）的抗逆功能,以期解析梭梭响应逆境胁迫的分子机制,为梭梭及其他作物抗逆遗传改良提供理论参考。【方法】通过实时荧光定量PCR对HaNAC12基因在干旱、高盐、ABA处理下的表达模式分析。利用同源重组法、农杆菌介导喷花法、喷洒除草剂等方法构建并筛选HaNAC12转基因拟南芥...     

OsmiR530正调控水稻的耐旱和耐盐性

以粳稻品种日本晴(CK)和农杆菌介导转化的OsmiR530–OE转基因水稻为材料进行耐旱和耐盐性相关功能的鉴定。结果表明：OsmiR530有2种成熟的序列形式OsmiR530–5p和OsmiR530–3p,其表达量在OsmiR530–OE转基因植株均有明显增加;靶基因表达量预测分析发现,OsmiR530–5p的靶基因OsTAP46、OsC3HC4、OsPWI和OsE1等在OsmiR530–OE转基因植株中的表达都有一定程度的下调;在干旱、盐胁迫条件下,OsmiR530能提高种子的发芽率、根长和苗高以及萌芽期幼苗对干旱胁迫和盐胁迫的耐受性;检测干旱处理植株的SOD、POD和CAT活性,发现OsmiR530–OE转基因水稻的SOD、POD和CAT活性增长显著;对成熟期水稻植株的农艺性状进行统计分析,发现过表达OsmiR530水稻植株的剑叶的叶表面积、千粒质量以及结实率显著降低。推测OsmiR530可以调控水稻对盐胁迫、干旱胁迫的耐受性。