葡萄霜霉病菌实时荧光定量PCR检测体系的建立和应用

【目的】葡萄霜霉病是葡萄生产上重要的单年流行病害,研究旨在构建葡萄霜霉病菌（Plasmopara viticola）的实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测体系,为葡萄霜霉病的早期诊断和预测预报提供依据。【方法】依据GenBank中葡萄霜霉病菌cox2基因序列设计1对特异性引物（F-cox-Pv/R-Pv）,建立并优化常规PCR和real-time PCR反应体系,利用葡萄霜霉病菌、葡萄炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、葡萄白粉病菌（Uncinula necator）、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、葡萄白腐病菌（Coniella diplodiella）、葡萄溃疡病菌（Botryosphaeria dothidea）、白菜黑斑病菌（Alternaria brassicae)、辣椒炭疽病菌（C. capsica）、甘草根腐病菌（Fusarium solani）、西葫芦白粉病菌（Sphaerotheca fuliginea）、番茄菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、马铃薯干腐病菌（F. equiseti）、西瓜枯萎病菌（F. oxysporum）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）等14种葡萄及其他作物病原菌和拮抗菌的菌丝DNA进行常规PCR和real-time PCR特异性检测,并对灵敏度和可重复性进行评价。运用已构建的real-time PCR体系对人工接种葡萄霜霉病菌的潜育期叶片内病原菌DNA进行定量检测,利用SPSS 19.0软件分析接种时间与叶片内葡萄霜霉病菌潜伏侵染量的关系。【结果】研究设计的引物特异性高,常规PCR仅对葡萄霜霉病菌DNA有扩增条带,为139 bp;real-time PCR检测结果表明该对引物对葡萄霜霉病菌有唯一的产物吸收峰,对其他供试菌株均未检测到产物吸收峰。常规PCR检测的灵敏度为10 pg·μL ^-1,real-time PCR的灵敏度可达到0.1 pg·μL ^-1,是常规PCR检测灵敏度的100倍。以携带目的基因片段的重组质粒为标准品,构建real-time PCR循环阈值（Ct）与模板浓度的线性关系,标准曲线y=42.27-3.36x,相关系数R ²=0.997,扩增效率为98.50%,线性范围达7个数量级,在2.4×10 ³—2.4×10 ⁹ copies/μL呈现良好的线性关系。对人工接种葡萄霜霉病菌的潜育期叶片内病原菌DNA进行real-time PCR检测,结果表明叶片内病原菌潜伏侵染量随接种时间的变化呈指数关系增长,y=6.34×10 ⁴·e ^{0.084 x},相关系数R ²=0.936。该real-time PCR检测体系在接种6 h后就可以检测到葡萄霜霉病菌DNA,检测量为5.68×10 ⁴ copies/μL病原菌DNA。 【结论】构建的葡萄霜霉病菌real-time PCR检测体系的灵敏度远高于常规PCR,且特异性强、重复性好,其Ct值与模板浓度呈较好的线性关系,扩增效率高,可用于定量检测葡萄霜霉病菌的潜伏侵染量。     

利用实时荧光定量PCR特异检测多环芳烃污染土壤中的外源降解菌

生物强化法修复有机污染土壤过程中,外源降解菌的丰度直接关系着修复效果,有必要开发出特定外源降解菌在土壤中的数量检测方法。针对多环芳烃降解菌PPZ-1,基于基因组测序结果,筛选可能的特异基因序列,设计对应引物。比对各组引物对菌株及污染土壤样品DNA的PCR扩增产物,确定适于实时荧光定量PCR检测的特异性基因序列和引物。以含有特异性基因序列的重组质粒为标准品,确定实时荧光定量PCR反应试验条件,建立标准曲线。将该方法应用于投加了菌株PPZ-1的多环芳烃污染土壤,验证其可行性。结果表明,所筛选的特异性引物在菌株中可以扩增出条带,在土壤样品相同位置无明显条带,具有较好的特异性。实时荧光定量PCR反应标准曲线相关系数为0.999 9,斜率为-3.365,扩增效率为98.233%,熔点曲线无杂峰。对投加了外源降解菌PPZ-1的多环芳烃污染土壤进行绝对定量检测,检测数值与理论值数量级相同,该检测方法能较准确地反映土壤中PPZ-1的数量。     

山核桃干腐病菌环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测体系的建立

为了建立一种能够快速、准确、高效地检测山核桃干腐病菌的技术,本研究根据茶藨子葡萄座腔菌的β-tubulin基因序列设计外引物、内引物和环引物,并对扩增体系和条件进行了优化、并分析其特异性和灵敏度。结果使用羟基萘酚蓝(HNB)作为反应指示剂,反应体系(Bst DNA聚合酶0.16U/μL,外引物F3和B3均为0.2μmol/L,内引物FIP和BIP均为1.6μmol/L,环引物LB为0.8μmol/L,Mg~(2+)为4 mmol/L,dNTP为1mmol/L,甜菜碱Betaine为0.6mmol/L)在等温(64℃)条件下反应1h能特异性检测山核桃干腐病菌:以山核桃干腐病菌DNA为模板的反应液呈阳性(变为蓝色),而其余的病菌均为阴性(仍为紫色),该技术的最低检测限为1pg/μL。     

SYBR Green I 实时荧光定量PCR检测小麦纹枯病菌体系的建立和应用

【目的】纹枯病是小麦生产上重要的土传病害之一,早期准确定量检测病原是病害预测预报及实现有效防控的基础。传统组织分离鉴定方法费时、程序复杂,而且无法做到准确定量。为实现小麦纹枯病早期快速准确定量检测,研究旨在建立小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis）的SYBR Green I实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测方法。【方法】根据小麦纹枯病菌的β-tubilin序列,设计1对特异性引物,建立并优化SYBR Green I real-time PCR反应体系,利用小麦纹枯病菌、立枯丝核菌（R. solani）、双核丝核菌AG-A和AG-F菌株、小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis var. tritici）、小麦根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）、小麦茎基腐病菌假禾谷镰孢（Fusarium pseudograminearum）和禾谷镰孢（F. graminearum）等8种小麦根部或土壤病原物的菌丝DNA进行普通PCR和real-time PCR特异性检测,并对灵敏度、可重复性进行评价。利用该体系分别检测接种后5、10、60 d不同接种浓度的盆栽小麦病株。【结果】研究设计的引物特异性强,普通PCR检测结果仅小麦纹枯病菌DNA有扩增条带。Real-time检测结果表明该对引物对小麦纹枯病菌只有唯一的产物吸收峰,对其余供试菌株均未检测到荧光信号。普通PCR检测的灵敏度为6.5×10³ copies/μL, real-time PCR的灵敏度可达到6.5×10² copies/μL。以携带目的基因片段的重组质粒为标准品,构建的real-time PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,熔解曲线的吸收峰单一,相关系数为0.997,扩增效率为0.91。对人工接种的盆栽小麦病株进行real-time PCR检测,结果表明与病情指数和接种量分别呈显著正相关。【结论】研究建立的基于real-time PCR技术的小麦纹枯病菌快速检测方法速度快、灵敏度高、特异性强、重复性好。可以用于小麦纹枯病菌检测、指导病害预测和防治。     

甜瓜种子细菌性果斑病菌PCR检测方法的研究

以携带细菌性果斑病菌(Acidovoras avenae subsp. citrulli)的甜瓜种子为材料,比较了不同引物、不同种子处理方式、不同浸提液及不同提取时间对细菌性果斑病菌PCR及实时荧光定量PCR检测结果的影响。结果表明:以完整带菌种子浸提液为模板进行PCR扩增,操作最简单且特异条带亮度最高,"种壳+种仁"处理次之,而以磨碎种子浸提液为模板,未能扩增出特异条带。以无菌水作为浸提液的PCR扩增效果明显优于磷酸缓冲液和液体KB培养基,浸提时间以3—12 h为宜。实时荧光定量PCR检测结果与普通PCR一致。在3对特异引物中,引物BX-L_1/BX-S-R_2的普通PCR扩增效果最佳,引物SEQID4~m/SEQID5更适用于实时荧光定量PCR检测。     

肠球菌SYBR Green I实时定量PCR检测方法的建立及应用

为了建立肠球菌的实时定量PCR检测方法,以便更加快捷、准确检测肠球菌.根据肠球菌16S rDNA高度保守的特性,在保守区设计1对引物,对其扩增条件进行探索,建立荧光定量PCR检测肠球菌的方法,并对方法的灵敏性、特异性、重复性进行评价,并在临床实践中进行检验.结果表明,所设计的引物能够在阳性样品中扩增出144 bp的目的片段,并且与常见的菌群如绿脓杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、变形杆菌等均不发生特异性扩增,检测的灵敏度为17拷贝·μL-1,在临床应用中,荧光定量PCR检测阳性率比普通PCR高18.87%.     

山核桃干腐病病原菌的鉴定

葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae真菌是很多木本植物溃疡病和枯梢病的重要病原菌。已有报道认为:山核桃干腐病病原菌为茶藨子葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea,但对于葡萄座腔菌科其他真菌与山核桃干腐病的关系还没有深入研究。分离得到了山核桃干腐病相关病原菌,通过比较其形态学特征和核糖体DNA内转录间隔区(rDNA ITS)序列特征,将分离得到的供试菌株分为3组。根据形态学特征和基于ITS序列的系统发育分析,3组菌株分别鉴定为Botryosphaeria dothidea,B.fabicercianum和B.obtusa。其中B.dothidea为优势菌株,分离频率为71.42%,B.fabicercianum和B.obtusa分离频率分别为14.28%。经致病性测定,上述分离菌株均能引起健康山核桃Carya cathayensis枝条发病,但致病性存在差异。在山核桃上发现的B.obtusa和B.fabicercianum为首次报道。     

巢式PCR检测油茶根腐病菌的研究

为建立油茶Camellia oleifera根腐病菌层生镰刀菌Fusarium proliferatum的巢式聚合酶链式反应（PCR）快速检测体系．扩增层生镰刀菌核糖体DNA基因间隔序列（ITS）区并测定其序列,比较该序列与GenBank中近似种的ITS序列差异．设计了特异性引物GF1和GR2,利用该对引物与ITS1和ITS4进行巢式PCR扩增检测层生镰刀菌。结果显示,巢式PCR对层生镰刀菌的检测灵敏度可达100ag基因组DNA,比常规扩增方法提高了1万倍。利用设计的GF1／GR2特异性引物与ITS区通用引物进行巢式PCR扩增．可灵敏地扩增出油茶根腐病菌层生镰刀菌DNA。     

桑花叶型萎缩病相关病毒的 SYBR Green I实时荧光定量 PCR 检测方法

【目的】建立桑花叶型萎缩病相关病毒（Mulberry Mosaic Dwarf associated Virus,MMDaV）的实 时荧光定量 PCR 检测方法。【方法】以 MMDaV 保守的外壳蛋白基因为靶基因,设计特异引物,构建外壳蛋白 基因序列的阳性质粒,建立阳性质粒的标准曲线,并对 MMDaV 特异引物的灵敏性和特异性进行检测,并使用 建立的 MMDaV 实时荧光定量 PCR 检测方法检测广东、广西、海南、重庆、陕西和江西 6 个省区的桑病叶样品。 【结果】构建的标准曲线具有良好的扩增效率（97.88%）,设计的特异引物可特异的检测到 MMDaV,最低的 质粒检测浓度为 8 copies/μL,是普通 PCR 灵敏度的 24 倍,并且 MMDaV 实时荧光定量 PCR 检测方法对 6 个 省区的桑病叶样品均有良好的检测结果,检测的 Cq 值在 9.69~26.17 之间。【结论】建立的 MMDaV 实时荧光 定量 PCR 检测方法具有高效率、特异性好和灵敏度高等特性,可被应用于寄主体内 MMDaV 的定量检测。     

马达加斯加龙树实时荧光定量PCR鉴定方法的研究

[目的]通过设计特异性引物与荧光探针,建立马达加斯加龙树（Didierea madagascariensis）实时荧光定量PCR鉴定方法。[方法]提取26份龙树科植物基因组,并用内源基因检测DNA质量;根据GenBank中已发表的马达加斯加龙树的PEPC基因序列,设计特异性引物与荧光探针,通过检测26份供试样本,检测该方法的特异性;将样品DNA进行10倍梯度稀释,以检测实时荧光定量PCR方法的灵敏度。[结果]只有3份马达加斯加龙树样本出现典型的扩增曲线,其他23份龙树科植物无典型的扩增曲线;核酸原液与10^-1～10^-4倍稀释液样本均能够得到典型扩增曲线,标准曲线的决定系数（R²）为0.995,检测限量为5.2×10^-3 ng/μL。[结论]该方法特异性强、灵敏度高,可有效地应用于马达加斯加龙树的鉴定。     

马铃薯早疫病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

马铃薯早疫病主要是由茄链格孢(Alternaria solani)引起的一种常见真菌性病害。本试验依据GenBank中链格孢属的ITS序列(Internal Transcribed Spacer),设计并合成了1对特异性引物ptAsQ-F(5′-TTTGCAATGGCAATCAGCG-3′)/ptAs-R(5′-CCCGCAAG-GGGAGACAAA-3′),以重组质粒为标准品构建实时荧光定量标准曲线。结果表明,建立的实时荧光定量PCR检测方法,引物特异性好,灵敏度高。重复性试验表明,组内和组间变异系数均小于2.51%,显示该方法具有较好的检测稳定性。利用该定量检测技术,可以检测出潜伏侵染于叶片和土壤中的早疫病菌。该方法为马铃薯早疫病田间发病的动态监测以及指导高效防控措施提供了技术支持。     

城市绿地中立枯丝核菌和齐整小核菌的qPCR快速检测方法

  目的  土传病原真菌立枯丝核菌Rhizoctonia solani和齐整小核菌Sclerotium rolfsii严重威胁园林绿化植物正常生长。建立针对这2种土壤病原真菌的快速定量检测方法。  方法  通过筛选2种病原菌特异性引物，优化反应条件。  结果  初步建立了2种病原菌的实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法。引物ST-RS1/ITS4和SRITSF/SRITSR可以分别用于立枯丝核菌和齐整小核菌的qPCR检测，其灵敏度分别达24×106和22×106拷贝·L?1，2次重复反应的变异系数分别为3.37%~4.61%和0.66%~8.61%。对上海绿地土壤样品的检测结果表明:立枯丝核菌和齐整小核菌的检出率分别为100%和19%。  结论  建立的qPCR检测方法具有较强特异性、较高灵敏度和较强重复性，可以用于上海城市绿地土壤中立枯丝核菌和齐整小核菌的快速、有效定量检测。图2表5参29     

SDS-PAGE和PCR检测1B/1R易位系研究初报

采用18个冬小麦品种作为供试材料,分别通过SDS-PAGE检测黑麦Secalin蛋白和PCR检测黑麦1RS染色体或其片段,结果表明:SDS-PAGE检测不出不带有secalin蛋白的1B/1R小片段易位系,而PCR则能检测出,从而提高1B/1R易位系的检出率;SDS-PAGE和PCR结合是检测1B/1R易位系的一种快速经济的有效方法。     

柑橘黑点病菌(Diaporthe citri)快速分子检测技术

柑橘黑点病是一种严重危害柑橘生产的世界性真菌病害,快速及时地检测出柑橘黑点病病菌(Diaporthe citri)对柑橘黑点病早期诊断和科学防控具有重要的实践意义。本研究基于β-微管蛋白序列,设计柑橘黑点病病菌的特异引物对,基于常规PCR和SYBR Green I实时荧光定量PCR(qRT-PCR)建立了快速分子检测体系,对柑橘黑点病病菌的菌丝和典型带病叶片进行检测验证。结果发现,在常规PCR检测中,该引物可从柑橘黑点病病菌获得244 bp的特异性扩增片段,检测灵敏度达0.78 ng·μL^-1;在实时qRT-PCR中,该引物也只有在柑橘黑点病病菌中获得唯一的产物吸收峰,检测灵敏度达0.35 ng·μL^-1。利用PCR检测体系对发病黑点叶片进行检测,结果显示,常规PCR的阳性检出率为30%,qRT-PCR的阳性检出率为60%,表明qRT-PCR比常规PCR的灵敏度更高。因此,研究设计的柑橘黑点病病菌特异性引物,以及所建立的常规和实时qRT-PCR检测方法具有速度快、特异性强等特点,可以用于柑橘黑点病病菌的分子鉴定,对病害诊断具有参考价值。     

山羊痘病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中山羊痘病毒(AY077835)gp063基因DNA序列,应用Beacon Designer 7.0软件,设计合成1对引物和1条TaqMan探针,同时制备含有靶DNA序列的pEASY-T1重组质粒标准品。通过引物、探针浓度的筛选及反应条件的优化,建立了山羊痘病毒TaqMan法实时荧光定量PCR。该方法组内和组间重复试验变异系数均低于2%,最低浓度检测极限值为1×100copies/μL,上机检测时间少于40 min。运用该方法对不同时期流行于云南局部的山羊痘临床组织病料进行定量检测,生成的标准曲线斜率(Slope)为-3.36,截距(Intercept)为41.08,相关系数(R2)为0.999 989,阳性对照及送检样品抽提DNA中病毒含量依次为:P(TK)2.70×105copies/μL,华坪(HP)毒株1.45×106copies/μL,景谷(JG)毒株5.12×105copies/μL,保山(BS)毒株2.96×105copies/μL,宣威(XW)毒株1.86×105copies/μL,永胜(YS)毒株1.36×103copies/μL。结果表明:所建立方法具有灵敏、特异、安全、快速的特点,适合于山羊痘的早期检测。     

武汉单极虫巢式聚合酶链反应检测方法的建立与优化

应用巢式聚合酶链反应(nested PCR)建立了一种检测异育银鲫武汉单极虫(Thelohanellus wuhanensis)基因组DNA的方法,提取的DNA作为模板进行两次扩增,第一次扩增用单极虫18S rRNA序列通用引物:5'-CTGCGGACGGCTCAG TAAATCAGT-3'和5'-CCAGGACATCTTAGGGCATCACAGA-3',扩增长度为1 584 bp;第二次依据第一次扩增产物中武汉单极虫特有的高度保守区设计特异性引物:5'-ACCCACTTCTGTGGC CTTTC-3'和5'-AATCCGACCTACAACGCTGG-3',扩增长度为853 bp。结果表明,通过PCR反应体系中退火温度、dNTP、Mg2+、延伸时间、扩增循环数和模板浓度的优化,优化后的巢式PCR最低DNA检测量达10 fg,优化后比常规PCR检测的灵敏度高104倍。因此,本文所建立的巢式PCR检测方法适合于水环境或水生动物中武汉单极虫的微量检测,也为异育银鲫武汉单极虫病的诊断和流行病调查提供了一种高灵敏的检测技术。     

香蕉枯萎病镰刀菌ITS序列的PCR扩增及其分子检测

根据香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)ITS序列设计合成的三条引物:FusF1(5′AACCC CTGTGAACATACCACTTG3′)、FusR1(5′GAGGAACGCGAATTAACGCGAC3′)和FusR2(5′GACGATTACCAGTAGCGAGGGT3′)构成引物对A(FusF1/R1)和B(Fus F1/R2),对尖廉孢菌古巴专化型病菌进行PCR特异扩增试验,结果表明,两对引物对引起香蕉枯萎病的镰刀菌全基因组DNA分别有338bp和408bp的特异扩增产物;在镰刀菌种以上的阶元有较好的分辨力;对目标菌株的检测下限分别是A(100fg)、B(10pg);而且B对香蕉感染枯萎病的病组织有相应的扩增产物,表明该引物对可用于香蕉枯萎病的早期鉴定和病原菌的检测。     

实时荧光定量PCR在植物病害中的应用

实时荧光定量PCR技术作为一项新兴技术,越来越受到人们的重视.它以快速、准确定量、便捷等优点广泛应用于科学研究各个领域,近年来,实时荧光定量PCR技术在植物病害研究上不断深入,大大提高了植物病害的检测效率和监测防治水平.结合了最近几年来应用于检测和鉴定植物病原病害的实时荧光定量PCR过程中引物与探针的设计、反应过程、结果评价情况,综合论述了实时荧光定量PCR技术在由真菌、细菌、病毒、线虫引发的植物病害的检测与应用.