鸡卵清蛋白5''端调控区的克隆和序列分析

通过PCR技术从产蛋鸡输卵管基因组中扩增出1．1kb的鸡卵清蛋白5’调控区，将其克隆入pMD18-T载体的多克隆位点(命名为pOV)，经酶切鉴定和序列测定可作为调控序列来启动外源基因的表达。为下一步构建其调控外源基因的质粒表达载体作准备。     

鸡卵清蛋白基因调控序列指导人促红细胞生成素转基因鸡的制备

本研究将鸡卵清蛋白5端调控区调控人促红细胞生成素的pOV-hEPO特异表达载体用脂质体包埋，和供体细胞融合后，显微注射入450枚受体胚盘，采用代用蛋壳法培养制备转基因鸡，PCR和斑点杂交检测外源基因已整合入早期鸡胚胎生殖系统，为制备表达人促红细胞生成素的鸡输卵管生物反应器奠定了基础。     

大豆铁结合蛋白基因cDNA的克隆、序列分析和表达载体的构建

根据已报道的植物铁结合蛋白基因的保守序列设计引物，用RT－PCR方法，成功地从大豆总RNA中扩增出一大小为0.771kb的cDNA片断。将该片段克隆到pUCm-T载体上，测序和序列的同源怀分析表明该片断与Proudhon等（1996）报道的大豆铁结合蛋白基因的氨基酸序列同源性达95％。利用pUCm-T和pBI121载体上共同的XbaI和SacI双酶切位点，构建了克隆片段的植物表达载体pSFKna。该载体含CaMV35S启动子、NOS终止子和NPT－Ⅱ基因，在遗传转化中可用基因枪导入受体，并通过卡那霉素抗性筛选转化子。     

白羽王鸽卵清蛋白关联蛋白Y基因(OVALY)克隆与生物信息学分析

旨在获得白羽王鸽(Columba livia)卵清蛋白关联蛋白Y基因(OVALY)的cDNA序列,并进行生物信息分析。研究结果显示:OVALY基因cDNA全长为2 068 bp,其中5'非编码区序列180 bp,3'非编码区序列720 bp,开放阅读框1 164 bp,编码的蛋白分子量约44.19 ku,含氨基酸残基388个(GenBank∶KX230792);与NCBI数据库中朱鹮(Nipponianippon)OVALY基因序列同源性最高(81%),与白尾鹰(Haliaeetusalbicilla)和沙鸡(Pteroclesgutturalis)OVALY基因序列的同源性分别为80%和79%。经潜在糖基化位点和磷酸化位点预测分析发现,OVALY蛋白结构中潜在糖基化位点和磷酸化位点分别为4个和22个;经CDD(conserved domain database)数据库分析发现,OVALY蛋白具有丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的反应中心区域,属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族。     

鸭卵清蛋白5'端调控区的克隆和序列分析

通过PCR技术从产蛋鸭输卵管基因组中扩增出1．2kb的鸭清蛋白5’端调控区,将其亚克隆入phDl8-T载体的多克隆位点(命名为pOV),经酶切和测序鉴定可作为启动外源基因表达的调控序列。为构建其启动外源基因的质粒表达载体作准备。     

鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白基因的克隆及序列测定

根据IBV病毒的已报道基因序列设计了用于扩增鸡传染性支气管炎病毒M41株S1基因和T株核衣壳蛋白基因(N)的引物。经RT-PCR得到了预期大小的扩增产物；将目的条带纯化并回收以后，克隆到pMD18-T质粒载体中，对插入片段进行序列测定。并与已发表的IBV S1、N基因序列进行了比较和分析，表明具有高度同源性。证明我们克隆了IBV S1和N结构蛋白基因。     

大麦黄矮病毒外壳蛋白基因和运动蛋白基因酵母表达载体的构建

根据已知的大麦黄矮病毒GPV株系的外壳蛋白（Coat Protein CP）和移动蛋白（Movement Protein MP）基因序列合成了CP、MP基因的上下游引物。通过PCR扩增获得含有目的基因的片段，经过SalⅠ和PstⅠ双酶切、连接、转化、重组质粒的酶切鉴定及基因测序，构建了酵母表达载体pGBKT7-GPV-CP和pGBKT7-GPV-MP，用于在酵母双杂交分析中表达诱饵融合蛋白，为进一步筛选小麦cDNA文库内与大麦黄矮病毒互作的寄主因子、克隆寄主因子、推测其种类和功能奠定了基础。     

油棕乙酰基酰基载体蛋白硫酯酶EgFATA基因的克隆与功能分析

为了探索油棕(Elaeis guineensis Jacq.)EgFATA基因的生物学功能,解析EgFATA基因在油棕中与脂肪酸积累的对应关系,为进一步研究EgFATA作用机制奠定基础,从油棕果cDNA中克隆得到了EgFATA基因的全长序列,经生物信息学分析发现,EgFATA编码区由1 155个碱基组成,可编码385个氨基酸,相对分子量为91.89 kDa,与海藻PdFATA亲缘关系最近。在此基础上,构建EgFATA的病毒沉默载体并侵染油棕胚状体,RT-qPCR结果表明,EgFATA的表达量被下调85%～90%。同时,对基因沉默胚状体进行脂肪酸气相色谱法分析,硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)的含量均显著性降低。以上结果表明在油棕胚状体中,EgFATA对C18:0-ACP、C18:1-ACP、C18:2-ACP的水解具有催化作用,且对C18:1-ACP的催化活性最强。     

浅谈卵清蛋白在日常生活中的作用

卵清蛋白是在鸟类卵清中大量存在的一种功能未知的蛋白。令人惊讶的是,卵清蛋白属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)家族,尽管它缺乏任何的抑制活性。卵清蛋白是鸟类卵清中最主要的蛋白,也是最早分离提纯的蛋白之一。由于它具有可迅速大量制备的性质,因此,在蛋白结构性质研究以及过敏实验模型中得到广泛的应用。卵清蛋白在鸡输卵管中的合成以及它受到类固醇激素的调节,为蛋白合成与分泌研究提供了一个模型。     

猪TPST1基因的克隆、序列分析及真核表达载体的构建

酪氨酸硫化转移酶(Tyrosylrotein sulfotransferase,TPST)在酪氨酸硫化修饰过程中起调节作用.试验参照人、鼠、牛等动物的TPST1 mRNA全长序列设计引物,通过电子克隆结合RT-RCR的方法首次克隆获得包括完整CDS区的猪TPST1基因cDNA序列(HQ439987),分析其核苷酸序列及...     

Bt基因的克隆及植物表达载体的构建

试验将从质粒pB110上克隆得到的Bt基因的片段,连接到高效的植物表达载体质粒pBI121上,此重组质粒经过限制性内切酶酶切分析和PCR鉴定,证明含有抗虫基因的植物表达重组质粒已构建成功。     

EPSPS基因克隆及其表达载体的构建

[目的]克隆大豆EPSPS基因并构建其表达载体,为培育抗草甘膦作物提供理论基础和技术储备.[方法]以抗草甘膦大豆总基因组为模板,扩增EPSPS基因,构建EPSPS基因的植物表达载体PCAMBIA1300-UBI-GFP-EPSPS,并导入农杆菌,使其能够进行作物的遗传转化.[结果]扩增获得EPSP基因全长1368 bp,共编码455个氨基酸.测序结果表明,其与GenBank(AF464188.1)中已知的CDS序列完全一致,成功构建了EPSPS值物表达载体,并将其导入农杆菌菌株EHA105中.[结论]构建的表达载体可用于甜高粱等单子叶作物抗草甘膦性状的遗传改良.     

翅碱蓬脱水素基因克隆及表达载体构建

【目的】克隆翅碱蓬脱水素蛋白基因并构建其植物表达载体,为其耐盐性研究奠定基础。【方法】提取翅碱蓬总RNA,通过同源克隆和RACE方法分离获得翅碱蓬脱水素蛋白基因,并构建该基因的植物表达载体pBI121-DHN。【结果】克隆获得翅碱蓬脱水素蛋白基因的全长cDNA为847bp（GenBank序列编号：KC013239）,命名为SsDHN。序列分析结果表明,SsDHN全长cDNA中5＇-UTR为61bp,ORF为678bp,3＇-UTR为108bp且包含29bp的poly（A）尾巴,其起始密码子ATG位于62bp处,终止密码子TAA位于737bp处,编码225个氨基酸。氨基酸比对结果表明,该基因推导的氨基酸与已知其他植物DHN基因序列有35%～48%的相似性。聚类分析结果显示,翅碱蓬（SsDHN）与拟南芥和荠菜DHN亲缘关系较近,与咖啡、杜鹃花的亲缘关系较远。【结论】成功克隆了翅碱蓬脱水素基因,并构建了其表达载体,可用于翅碱蓬抗盐的遗传改良。     

OsMAPK4基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

以低温处理的耐盐水稻辽盐241植株叶片总RNA为模板,用OsMAPK4基因特异引物通过RT-PCR扩增出1500bp的片段,并将该片段克隆至pUC18上。序列分析结果表明,该克隆序列与GenBank上的OsMAPK4基因序列同源性达99.4%,氨基酸同源性达99.1%。进一步将OsMAPK4基因分别克隆至植物表达载体卡盒pBCE12和pBC29A上,构建了分别由E12启动子、rd29A启动子调控的OsMAPK4基因植物表达载体pBME12和pBM29A。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为农杆菌介导法转化植物,分析OsMAPK4基因的功能奠定了基础。     

OsMAPK7基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

以低温处理的耐盐水稻辽盐241植株叶片总RNA为模板,用OsCDPK7基因特异引物通过RT-PCR扩增出1 700 bp的片段,并将该片段克隆至pUC18上。序列分析结果表明,该序列与GenBank上的OsCDPK7基因序列相比,缺失了CDS序列中157￣234处的78个核苷酸,其编码的蛋白序列缺失了53￣78的26个氨基酸。但是缺失部分位于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性中心和钙结合基序等结构域之外,因此预计该基因产物应具备钙依赖的蛋白激酶活性。进一步将OsCDPK7基因分别克隆至植物表达载体卡盒pBE12和pB29A上,构建了分别由E12启动子、rd29A启动子调控的OsCDPK7基因植物表达载体pBC7E12和pBC729A。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为农杆菌介导法转化植物,分析OsCDPK7基因的功能奠定了基础。     

DREB 2A基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

研究提取盐处理的拟南芥植株叶片总RNA,用DREB2A基因特异引物通过RT-PCR扩增出1050bp的片段,并将该片段克隆至pUC18上。序列分析结果表明,该克隆序列与GenBank上的DREB2A基因序列同源性达100%。进一步将DREB2A基因分别克隆至植物表达载体卡盒pCCE12和pCC29A上,构建了分别由E12启动子、rd29A启动子调控的DREB2A基因植物表达载体pCDRE12和pCDR29A。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为农杆菌介导的DREB2A基因对植物的遗传转化奠定基础。     

苏云金芽孢杆菌aiiA基因的克隆及植物表达载体构建

N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones,AHLs)是革兰氏阴性细菌致病过程中的关键信号分子,芽孢杆菌中广泛存在的aiiA基因编码AHL-Lactonase能够水解信号分子AHLs。利用PCR方法从苏云金芽孢杆菌中克隆了aiiA基因,序列分析表明该基因由753个碱基组成,编码含有250个氨基酸残基的蛋白质,核苷酸序列与已报道aiiA的同源性为89%～97%。将该基因连接到植物表达载体pCAMBIA1301中,成功构建了aiiA基因的植物表达载体pCAM-aiiA,为进一步通过转基因技术研究该基因的功能奠定了基础。     

胰蛋白酶抑制剂SKTI3基因的克隆及其植物表达载体的构建

以大豆基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了大豆胰蛋白酶抑制剂基因SKTI3的全长DNA片段,并将其构建到pMD18-T vector上。核苷酸序列测定结果表明:该基因片段全长654 bp,与已发表的SKTI3基因序列同源性达99%。将目的基因片段插入到pB I121 35S启动子下,构建重组质粒pB ISKTI3,采用冻融法将该重组质粒转入农杆菌EHA105中,获得了植物表达载体。     

蒺藜苜蓿二氢黄酮还原酶基因克隆及植物表达载体构建

采用RT-PCR方法,从蒺藜苜蓿(Medicargotrunctula)中克隆了二氢黄酮还原酶(DFR)基因cDNA片段,并进行DFR基因植物表达载体的构建.结果表明:扩增的DFR基因片段全长约1 000 bp,编码337个氨基酸,与Gen-Bank中已注册的DFR基因核苷酸序列的同源性为99.80%.以pBI121为基础载体,构建了CaMV35S启动子驱动的DFR基因的植物表达载体pBIDFR,然后导入农杆菌EHA105,经PCR验证确定构建出植物表达载体.     

微小牛蜱Bm91基因的克隆及其真核表达载体的构建

参照GenBank中收录的微小牛蜱Bm91基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物,从我国微小牛蜱半饱血雌性成蜱肠道和唾液腺研磨物中提取总RNA,利用M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit合成双链cDNA,并采用PCR技术扩增获得的Bm91基因,将其克隆到pGEM-T Easy载体中并进行PCR、酶切和测序分析鉴定.结果表明:所克隆的Bm91基因序列与GenBank上收录的Bm91基因序列的同源性达97.1%,而且该片段含有完整的开放阅读框;将该基因从克隆载体上用EcoRⅠ单酶切消化并亚克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pP1C9K的EcoRⅠ酶切位点,再次进行PCR、酶切和测序分析鉴定,结果表明成功构建并获得了微小牛蜱Bm91基因的重组真核表达载体pP1C9K-Bm91.