玻璃化法及小液滴玻璃化法对香石竹茎尖超低温保存效果的影响

[目的]探索更有效的香石竹茎尖超低温保存方法,为球宿根花卉的超低温保存提供相关技术支持。[方法]以香石竹茎尖为材料,研究预培养条件(蔗糖浓度、预培养时间)、玻璃化处理时间和玻璃化方法(常规玻璃化法、小液滴玻璃化法)对香石竹茎尖超低温保存效果的影响。[结果]在0.5 mol/L的蔗糖浓度培养基上预培养5 d香石竹茎尖成活率最高,为88.3%;玻璃化处理80 min成活率最高,可达86.7%;常规玻璃化法成活率及再生率在80%以上,小液滴玻璃化法成活率可达90%以上且全部再生,小液滴玻璃化法再生天数比常规玻璃化法少3~5 d。[结论]小液滴玻璃化法是一种有发展前景的超低温保存方法。     

罗汉果茎尖超低温保存后再生植株的遗传稳定性研究

[目的]检测罗汉果茎尖玻璃化法超低温保存后再生植株的遗传稳定性。[方法]对罗汉果玻璃化法超低温保存前后的植株进行过氧化物酶（POD）和酯酶（EST）同工酶酶谱分析、染色体计数和随机扩增多态性DNA（RAPD）分子标记。[结果]超低温保存前后,POD同工酶图谱上均显示9条酶带,且迁移率一致;EST同工酶图谱上均显示8条酶带,迁移率也一致;POD和EST同工酶谱、染色体数目和RAPD谱带均未发现差异。[结论]玻璃化法超低温保存罗汉果种质资源安全、稳定。     

香石竹茎尖的改良小液滴玻璃化法超低温保存

香石竹(Dianthus caryophyfllus L.)为石竹科石竹属常绿亚灌木花卉,是世界著名的切花之一,其栽培种及野生种的资源有效保存对香石竹的国产化至关重要。超低温保存(-196℃)是无性繁殖的植物种质资源最安全经济的保存方法。超低温保存方法中常用的为玻璃化法,近年来在传统玻璃化法上发展出来小液滴法,即将植物材料经玻璃化处理后,在铝箔上滴成小液滴,后直接投入液氮进行迅速冷冻。由于冻存及解冻速度快,组织不易形成冰晶,易成活再生,是一有发展前景的方法。超低温保存中,茎尖大小及结构的完整性对超低温保存的成活率及恢复培养均有影响。我们以香石竹为模式植物,结合包埋法及小液滴法的特点,对相关技术进行改进,探索一种适用于植物茎尖超低温保存方法及冷冻植株后再生的技术。试材为香石竹红花品种,从上海花卉市场购买。切取花茎繁殖试管苗,获得花茎无性繁殖系。取组培继代3个月以上的无菌组培苗。茎尖超低温保存的试验方法为:1、常规玻璃化法:(1)剥取1~2mm无菌苗茎尖,接种到含0.3 mol·L-1蔗糖浓度的MS培养基中,在25℃下培养1~3d;(2)经预培养后,将茎尖置于含预处理液(含2 mol·L-1甘油及0.4 mol·L-1蔗糖的MS培养液)的2ml冷冻管中,于室温下处理60min,然后将预处理液吸出,换入预冷玻璃化保护剂PVS2中在冰浴中处理60~120min;(3)冷冻管换入预冷新鲜PVS2约0.5ml,迅速投入液氮中保存。解冻取出在液氮中冻存1 h以上的冷冻管,立即放入40℃水浴中快速解冻2 min。(4)茎尖在室温下用含1.2mol·L-1蔗糖的MS培养液洗涤2~3次,每次5~10 min。(5)洗涤后的茎尖在滤纸上吸干后,转移至恢复培养基中暗培养,等茎尖返绿并有萌动迹象时再转入MS固体培养基中常光培养。2、小液滴法:步骤(1)、(2)同常规玻璃化法;(3)在冻存前5min将含有1个茎尖的液滴(约5ul)滴在5mm×20mm的无菌铝箔条上,每个铝箔条含5个茎尖,将含液滴的铝箔条直接投入装满液氮的安培管中。(4)解冻时直接将含液滴的铝箔条投入洗涤液中进行解冻20 min。步骤(5)同上。3、改良小液滴法:(1)剥取1~2mm无菌苗茎尖,浸入2%的无钙离子海藻酸钠溶液中轻蘸,即用镊子将茎尖轻放在3mm×20mm无菌滤纸小条上,每个滤纸条上放5~10个茎尖;(2)将含有茎尖的滤纸小条浸入到0.1%氯化钙溶液中,经10min固定,在无菌滤纸上吸干多余液体;(3)将带有茎尖的滤纸小条放入0.3 mol·L-1蔗糖的MS液体或固体培养基中,培养1~3d;(4)经预培养后,将带有茎尖的滤纸小条置于预处理液(含2 mol·L-1甘油及0.4 mol·L-1蔗糖的MS培养液)中于室温下处理60min,然后转入玻璃化保护剂PVS2中在冰浴中处理60~120min;(5)将带有茎尖的滤纸小条直接投入液氮中,长期保存可转移至无菌冷冻管;(6)解冻时将带有茎尖的滤纸小条由管中拿出后迅速放入含1.2 mol·L-1蔗糖的MS培养液解冻及洗涤20min;(7)将带茎尖的滤纸条在无菌滤纸上吸干后放入恢复培养基进行培养,经恢复培养后茎尖可直接生长成植株。结果表明:3种玻璃化法冻存的香石竹茎尖成活率及再生率均可达80%。其中小液滴玻璃化法在优化程序下进行冻存,最高存活率可达95%,高于常规玻璃化法(82%)及改良小液滴玻璃化法(87%)。恢复培养时,最快1d即可见茎尖萌动,再生时间较常规玻璃化法要短3~5d,但再生率不稳定(60%~100%),易形成愈伤组织及玻璃化苗。改良小液滴法成活率(80%~90%)略高于常规玻璃化法,再生时间与常规玻璃化法相同(7~13d),植株再生率均在80%以上且植株生长健壮一致。改良小液滴法结合包埋法及小液滴法的特点,并采用滤纸小条为操作载体,以批量处理茎尖以提高操作效率,减少在操作过程中机械损伤,从而达到稳定的成活率及再生率,受操作者水平影响较小,可用于种质库批量化植物茎尖资源超低温保存。     

甜樱桃砧木吉塞拉离体茎尖玻璃化法超低温保存研究

为保持甜樱桃矮化砧木吉塞拉的遗传稳定性和避免种质遗传资源丢失,以玻璃化法超低温冷冻保存过程中涉及的主要因子设计正交试验,摸索适合吉塞拉的最佳保存体系;设计单因子试验,观察不同单因子对吉塞拉超低温冷冻保存的影响。结果表明,取生长90 d的组培苗于4℃低温锻炼3周或4周,剥取茎尖放于含0.3 mol/L蔗糖的预培养液中预培养1 d,在装载液中渗透30 min,用PVS3玻璃化试剂0℃处理60min后投入到液氮中保存24 h,取出后经40℃水浴快速化冻1 min,卸载液洗涤两次,每次10 min,后置于恢复培养基上,茎尖的存活率最高且遗传稳定性好。本试验成功建立了甜樱桃矮化砧木吉塞拉的玻璃化法超低温保存技术,为甜樱桃种质资源的长期保存提供了一条有效途径。     

苹果种质资源玻璃化法超低温保存技术

研究了苹果茎的玻璃化法超低温保存技术。实现了低温锻炼、预培养及恢复培养基对成活率的影响，筛选出了合适的冰冻保护剂PVS3，构建了苹果茎玻璃化法超低温保存体系。同时对冻存成活苗的叶片再生能力和过氧化物酶（POD）同工酶进行了检测。     

库车小白杏的组织培养及玻璃化法超低温保存试验初探

[目的]采用玻璃化法对杏资源茎尖进行超低温保存.超低温保存是目前植物种质资源长期稳定保存的最好方法,保存后的材料遗传上较为稳定.[方法]以库车小白杏为试材,对茎尖(外植体)组织培养的培养基及激素浓度做了初步选择.[结果]选择MS +0.5NAA +0.2 6 -BA激素配方可使杏的茎尖最易形成愈伤材料,而选择MS +0.1 NAA +0.1 6- BA +0.1GA激素配方可使由茎尖获得的愈伤材料最易分化出根.[结论]用玻璃化法对组织培养获得的愈伤材料结合不同的低温保存时间、脱水处理时间与化冻方法进行比较试验可知,预冻温度- 30℃、玻璃化液保护剂脱水60 min、40℃水浴5 min解冻,可使超低温保存的材料复活率最高.     

树莓茎尖玻璃化法超低温保存及植株再生研究

为了建立适于树莓茎尖的超低温保存技术程序,试验以树莓茎尖为试材,对树莓玻璃化法超低温保存进行了研究。结果表明适于树莓的超低温保存技术流程是先低温驯化21d,在含0.8mol/L蔗糖的固体培养基预培养4d,再经玻璃化液(PVS2)处理120min后浸入液氮,解冻后茎尖存活率达75%。     

留兰香茎尖超低温保存及遗传变异分析

为了长久保存留兰香种质资源,以留兰香(Menthae spicatae L.)茎尖为材料,对其玻璃化超低温保存条件进行研究,并运用扩增片段长度多态性(AFLP)和甲基敏感扩增多态性(MSAP)对玻璃化超低温保存再生材料(处理组)的遗传与表观遗传稳定性进行分析。结果表明:留兰香试管苗于4℃低温锻炼28d,于添加2mol/L甘油的MS培养基中预培养4d,0℃下于PVS2中脱水50min,液氮保存1h或者更长时间,成活率最高,可达60%左右,再生植株分化正常;超低温处理后再生材料(处理组)与正常继代材料(对照组)之间未发现有DNA片段的差异;与对照相比,处理组的材料均发生了甲基化状态与水平的变化,全基因组DNA胞嘧啶甲基化水平降低,另外,甲基化与去甲基化位点比率分别为8.93%和12.3%,说明超低温处理能够引起DNA甲基化的变化。由此推测,DNA甲基化可能是植物适应超低温保存的机制之一。     

高山红景天(Rhodiola sachalinensis A.Bor)茎尖包埋-玻璃化法超低温保存与植株再生

使用包埋-玻璃化法对两种来源的高山红景天茎尖进行超低温保存研究,探讨蔗糖预处理、包埋过程中渗透处理和不同温度下玻璃化液PVS2处理的时间对超低温保存后茎尖存活率的影响.结果表明,茎尖依次在0.3、0.5、0.7、1.0 mol.L-1的蔗糖溶液中各预培养1 d后,转入1.0 mol.L-1的蔗糖溶液中继续培养4 d,然后使用附加2 mol.L-1甘油和1 mol.L-1蔗糖的包埋液渗透处理60 min,包埋珠在0℃处理180～210 min后投入液氮,48 h后用40℃水浴快速化冻3 min,用合有1 mol.L-1蔗糖的改良MS培养液洗涤20 min,转入MS+6-BA 1 mg.L-1+NAA 0.1 mg.L-1固体培养基中在22℃条件下进行暗培养,2 d后转移入光照培养,最高成活率接近100%,再生植株生长和分化正常.     

甘薯茎尖超低温保存技术研究

本试验采用包埋玻璃化法超低温冷冻技术保存徐薯18号的茎尖,结果表明,当剥取茎尖大小为1.0~1.5 mm,玻璃化处理时间为90 min时,茎尖存活率达85%以上。     

植物种质资源包埋脱水法超低温保存研究进展

植物种质资源是植物育种的基础,理论上植物材料可以无限期的保存在超低温环境中,同时还能保持遗传稳定性。为植物种质的超低温保存的后续研究参考,从材料选择、包埋前预处理、包埋、预培养、脱水、冷冻、化冻与恢复培养等方法面对植物种质资源包埋脱水发超低保存的关键技术及其影响因素进行综述,介绍其优点和应用前景。     

包埋玻璃化法超低温保存灰杨休眠茎尖的研究

采用包埋玻璃化法,对灰杨休眠茎尖进行了超低温保存研究。将灰杨休眠茎尖包埋在含3%褐藻酸钙的胶球中,研究了预培养中的蔗糖浓度、培养时间和不同玻璃化保护液处理时间对灰杨休眠茎尖存活率的影响。结果表明:含灰杨茎尖的胶球在0.8 mol/L的蔗糖溶液中培养24 h,可获得较高的存活率;胶球经玻璃化保护液[40%甘油+45%(0.4 mol/L)蔗糖+10%聚乙二醇(分子量4 000)+5%二甲基亚砜]在25℃处理20 m in,可以显著提高其存活率,在优化条件下存活率可高达58.3%。     

梨离体茎尖超低温保存方法的比较研究

以梨为试材 ,从操作程序、存活率、再生方式及恢复生长速度等方面对 3种超低温保存方法进行了比较研究。结果表明 ,采用简单玻璃化法超低温保存梨离体茎尖的效果最佳。     

马铃薯茎尖超低温保存研究

以马铃薯栽培品种甘农薯1号的试管苗为材料,进行了茎尖超低温保存技术的研究,结果表明,预培养3～4 d,用玻璃化溶液PVS2室温下处理20～30 min,直接投入液氮中冷冻保存,然后接种在MS添加2.50 mg/L KT、1.25 mg/L IAA和1.25 mg/L 6-BA的培养基上,经过恢复培养,茎尖成活率可达42.8%.     

杂交兰种苗超低温脱毒技术研究

以携带建兰花叶病毒(CyMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)的杂交兰根状茎为试材,采用包埋玻璃化超低温保存法对杂交兰病毒脱除进行研究。结果表明：低温炼苗21 d的茎尖,在0.5 mol/L的蔗糖浓度预培养基中培养3 d,然后浸入0.4 mol/L高糖液体培养基中加载90 min,之后转入玻璃化溶液PVS2(protect vitrification solution 2)中冰上处理6 h,再液氮保存1 h,最后于37℃水浴中解冻2~3 min,1.2 mol/L高糖液体培养基中卸载20 min,待恢复培养后,杂交兰茎尖成活率为64%以上,随机检测30个样品,两种病毒脱毒率均为100%。研究为杂交兰种苗脱毒奠定了一定的理论基础。     

组培红叶臭椿遗传变异的RAPD分析

[目的]研究组织培养条件下红叶臭椿的遗传变异,为进一步遗传育种提供理论依据。[方法]以组培红叶臭椿苗为试材,通过CTAB法提取其基因组DNA,利用RAPD技术对其遗传稳定性进行相关分析。[结果]由同一母株茎尖再生的组培苗遗传物质稳定,在DNA水平上经RAPD鉴定未见明显变异,保持了母株的特性;遗传聚类结果显示,组培苗之间相似系数较高,母株与7个组培单株之间相似系数平均为0．8988,变异幅度很小,进一步证实同一母株茎尖培养后的组培苗后代具有较高的遗传稳定性。[结论]茎尖再生植株具有较好的遗传稳定性。