重组人磷脂酰肌醇3-激酶p110β催化亚基的原核表达

目的：表达人磷脂酰肌醇3－激酶p110β催化亚基。方法：将构建有人磷脂酰肌醇3－激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3-K)p110β催化亚基cDNA的重组质粒，转化大肠杆菌BL21（DE3），用IPTG进行诱导表达。用磷脂酰肌醇－4、5－二磷酸、[γ-^32P]ATP与重组PI 3－K p110β催化亚基一起保温的方法测定PI 3－K的活性；^32P标记的磷脂用氯仿和甲醇抽提、板薄层层析和放射自显影来分析。结果：SDS－PAGE显示表达出－110kD的新蛋白质分子，重组蛋白占菌体总蛋白的比例为15％，大多数重组蛋白以可溶性形成存在。wortmannin是PI3－K特异的抑制剂，wortmannin对重组PI 3－K p110β亚基有抑制作用，这种抑制作用呈剂量依赖关系（2.5-20nmol/L)。结论：重组蛋白是有活性的人PI3－Kp110β催化亚基。     

nisⅠ基因克隆和强化表达及其发酵条件的优化

nisⅠ基因能提高乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)产nisin的效价。本文自行设计引物,从乳酸乳球菌克隆获得了nisⅠ基因,构建了重组质粒pMG36e nisⅠ并电转化至乳酸乳球菌中,经筛选得到1株阳性转化子。考查了基因工程菌及原始菌株在不同时期nisⅠ基因的表达量,结果表明,重组菌在6、9、12 h的表达量比原始菌株分别提高了044、153、228倍。在摇瓶培养条件下,通过单因素研究和响应面法优化了重组菌的发酵培养基和培养条件,优化结果为：蔗糖267 g·L-1、蛋白胨2268 g·L-1、酵母粉7 g·L-1、牛肉膏7 g·L-1、Na2HPO4 218 g·L-1、MgSO4 02 g·L-1,最适pH值75,最佳接种量3%,发酵时间12 h,在该条件下,重组菌的nisin发酵水平比原始菌株提高了7542%。因此,在乳酸乳球菌中强化nisⅠ基因的表达是有效的。     

SQR基因在Nisin抗性乳酸乳球菌中的表达

为了研究硫化物-醌氧化还原酶(SQR)基因的乳酸菌表达载体pLEB590-SQR的构建及其在乳酸乳球菌MG1363中的表达,通过限制性内切酶酶切载体pLEB590与目的片段SQR,回收纯化并用T4连接酶进行连接,连接产物通过电转化法转化到乳酸菌中,提取所得到的乳酸乳球菌质粒pLEB590-SQR进行双酶切鉴定与普通PCR鉴定;并通过电转化将重组质粒导入乳酸乳球菌MG1363中,在含有Nisin(乳酸链球菌素)的选择培养基中筛选阳性克隆,采用SDS-PAGE电泳和Western杂交检测SQR蛋白质的表达情况。最后检测重组质粒在MG1363中的遗传稳定性。结果显示,SQR乳酸菌重组表达载体pLEB590-SQR构建成功,从MG1363中成功检测到目的蛋白质SQR的表达,携带pLEB590-SQR的MG1363遗传稳定性达90%以上。乳酸乳球菌MG1363可以用来表达硫化物-醌氧化还原酶(SQR)。     

植物非特异性磷脂酶C的研究进展

非特异性磷脂酶C(non-specific PLC,NPC)能够水解磷脂酸胆碱和磷脂酰乙醇胺生成二酰基甘油(diacylglycerol,DAG),虽然非特异性磷脂酶C没有PLC家族基因的C2、X、Y、EF等结构域,但它仍含有1个磷酸酯酶结构域,能够水解磷脂。近年来研究发现,非特异性磷脂酶C在植物逆境胁迫和信号转导的过程中起着重要的调节作用。因此本文对非特异性磷脂酶C的结构、生理功能及其作用机制进行概述,并对其研究前景进行了展望。     

Viili中乳酸菌的初步分离和鉴定

[目的]分离和鉴定Viili中的主要乳酸菌,为开发新型乳制品提供依据。[方法]首先,对Viili中的细菌进行活化、分离和纯化;然后,接种于相应的培养基上进行培养,从生长特性、形态特征以及生理生化特性对分离菌进行鉴定。[结果]Viili中主要含有乳酸乳球菌乳酸亚种（L.lactissub sp.lactis）、乳酸乳球菌乳脂亚种（L.lactissub sp.cremoris）、乳酸乳球菌乳酸亚种二乙酰乳酸亚种（L.lactissub sp.diacetylactis）和肠膜明串球菌乳脂亚种（L.mesenteroidessub sp.cremoris）。[结论]Viili中乳酸菌的种类比较丰富,其中乳酸乳球菌二乙酰乳酸亚种和肠膜明串球菌乳脂亚种在我国乳制品中很少分离到。     

磷脂酶D特性及其在功能性磷脂生产中的应用

磷脂酶D(Phospholipase D,PLD)是催化磷酸二脂键水解和碱基交换反应的一类酶的总称.生产中利用PLD的转酯作用来制备功能性磷脂.本文介绍了磷脂酶的分子结构、催化机理及功能,以及磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰肌醇(PI)的生产方法,包括物理萃取法、化学合成法和酶促合...     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位C末端26kDa片段在大肠杆菌中表达及免疫性

构建含幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位3'端720 bp序列表达载体pAMJ399-e,转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109后在低pH下诱导表达.经SDS-PAGE和Western blot分析表明,含pAMJ399-e的E.coli JM109所表达的外源蛋白相对分子量为26 kD,免疫印迹分析证实该重组蛋白可以被幽门螺杆菌阳性患者血清所识别;提纯重组的尿素酶B亚单位C-末端片段(rUreB-E),进行Balb/c小鼠的皮下注射免疫试验,ELISA检测发现,小鼠经rUreB-E免疫后,其血清中均可检测到抗rUreB-E的特异性IgG和IgA抗体,表明rUreB-E具有良好的免疫反应性和免疫原性.     

The mucosal Immune Response Induced in Chicks Immunized with LactobaciUus casei anchoring NDV HN Protein

以干酪乳杆菌作为呈递抗原活载体,表达新城疫病毒保护性抗原HN蛋白。重组于酪乳杆菌表达外源蛋白后,经SDS-PAGE、Westernblot及间接免疫荧光分析,表明目的蛋白表达并展示到乳酸菌表面。将重组菌及空质粒菌株分别滴鼻、点眼免疫雏鸡,于不同时间检测血清样品中特异性IgG;于三免后不同时间采集雏鸡的泪液、气管洗液、胆汁和肠洗液样品,采用间接ELISA方法检测样品的特异性sIgA;用MTY法检测免疫鸡脾淋巴细胞增殖情况,结果显示重组干酪乳杆菌表达系统能刺激动物黏膜免疫反应和系统免疫反应。     

表达猪轮状病毒VP4基因重组乳酸球菌表达载体构建及免疫原性分析

 【目的】构建猪轮状病毒主要保护性抗原VP4基因的重组乳酸乳球菌口服疫苗,为猪轮状病毒的防治提供有效方法。【方法】将猪轮状病毒免疫保护性抗原基因VP4主要结构功能区定向插入乳酸菌表面表达载体pNZ8112,电转化乳酸乳球菌NZ9000,构建了pNZ8112/NZ9000乳酸乳球菌表面表达系统。通过SDS-PAGE、Western-blot和免疫荧光方法鉴定,以此活菌系统口服免疫6～8周龄Balb/c小鼠,测定了免疫动物的局部体液免疫和系统免疫应答。【结果】证明插入的外源基因在菌体表面得到了正确表达,表达猪轮状病毒免疫保护性抗原的重组乳酸乳球菌免疫动物后,分别在粪便、泪液和阴道洗液中检测到了特异性分泌型IgA抗体和在血液中检测到了IgG抗体的存在;体外细胞中和试验结果表明,血清抗体对猪轮状病毒的中和效价为1﹕40。【结论】表达猪轮状病毒免疫保护性抗原的重组乳酸乳球菌口服免疫动物能够产生良好的局部和系统体液免疫应答而且具有免疫中和效力。     

锚定NDV HN蛋白重组干酪乳杆菌诱导雏鸡黏膜免疫应答

以干酪乳杆菌作为呈递抗原活载体,表达新城疫病毒保护性抗原HN蛋白。重组干酪乳杆菌表达外源蛋白后,经SDS-PAGE、Western blot及间接免疫荧光分析,表明目的蛋白表达并展示到乳酸菌表面。将重组菌及空质粒菌株分别滴鼻、点眼免疫雏鸡,于不同时间检测血清样品中特异性IgG;于三免后不同时间采集雏鸡的泪液、气管洗液、胆汁和肠洗液样品,采用间接ELISA方法检测样品的特异性sIgA;用MTT法检测免疫鸡脾淋巴细胞增殖情况,结果显示重组干酪乳杆菌表达系统能刺激动物黏膜免疫反应和系统免疫反应。     

乳酸乳球菌电击转化方法的优化

乳酸菌NICE系统是食品级表达系统，本实验以该系统的表达载体pNZ8148和宿主菌NZ9000为研究对象，对电击转化方法进行了优化。结果表明，在培养基中加入2.5%甘氨酸，收集OD₆₀₀值为0.3的细胞、用配方I[（洗涤液I:蔗糖0.5 mol·L?1+甘油10%；洗涤液II:蔗糖0.5 mol·L?1+甘油10%+EDTA50 mmol·L?1）]洗涤细胞，再转入0.2 μg质粒，利用2.5 kV电压和0.2 cm电击杯进行电击转化，恢复培养1.5 h后转化效率最高，达1.6×108 CFU·μg?1。本实验为乳酸乳球菌NZ9000的电击转化参数提供了数据参考，为基于乳酸菌NICE系统的深入研究奠定了基础。     

乳酸乳球工程菌表达L-苯丙氨酸解氨酶的工艺优化

[目的]提高乳酸乳球工程菌表达L-苯丙氨酸解氨酶的水平.[方法]对培养基种类、接种量、培养温度、诱导剂浓度、磷酸甘油二钠浓度等因素进行了优化.[结果]使用DifcoTM M17 Broth培养基培养乳酸乳球菌时,L-苯丙氨酸解氨酶表达活性最高;磷酸甘油二钠对L-苯丙氨酸解氨酶表达活性有较大影响,可提高活性93.8％.通过正交试验,得到PAL最佳表达条件为接种量2.0％,培养温度30℃,磷酸甘油二钠浓度2.0％,诱导剂浓度10.0 μg/L. PAL表达酶活可达3.05 IU/ml.[结论]在发酵扩大培养中优化了L-苯丙氨酸解氨酶在乳酸乳球菌中的表达条件,为今后生产及应用提供参考.     

PEDV ps420片段乳酸乳球菌表达及免疫中和活性检测

将猪流行性腹泻病毒LJB/03株S基因上编码中ps420(1 495～1 916 bp)基因片段插入乳酸乳球菌pNZ8112中,构建了重组表达载体pNZ8112-ps420,将其电转化入乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000,获得了表达猪流行性腹泻病毒S基因ps420的重组乳酸乳球菌,经乳链菌肽(...     

SQR基因在大肠杆菌和乳酸菌中的表达

为了研究硫化物-醌氧化还原酶(SQR)基因的乳酸菌表达载体pMG36e-SQR-Myc的构建及其在大肠杆菌DH5a和乳酸菌MG1363中的表达,通过限制性内切酶酶切大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pMG36e与目的片段SQR-Myc,回收纯化并用T4连接酶进行连接,连接产物通过KCM法转化到大肠杆菌DH5a中,提取所得到阳性大肠杆菌菌株质粒pMG36e-SQR-Myc进行双酶切鉴定与普通PCR鉴定;并通过电转化将重组质粒导入乳酸菌MG1363中,采用SDS-PAGE电泳和Western-blotting检测SQR蛋白质在其中的表达情况。结果显示,SQR乳酸菌重组表达载体pMG36e-SQR-Myc被成功构建,目的蛋白质SQR在大肠杆菌和乳酸菌MG1363中被成功检测到。因此,乳酸菌MG1363可以用来表达硫化物-醌氧化还原酶(SQR)。     

乳酸乳球菌NICE系统食品级分泌表达载体pRNV48的构建及铜绿假单胞菌融合外膜蛋白的表达

乳酸菌NICE系统是目前较理想的可控制蛋白质生产的食品级诱导表达系统,而乳酸菌分泌表达异源蛋白比细胞质表达更优越。本研究将以pVE5524为模板PCR扩增的1.5 kbSPUsp45-NucA-CWAM6-t1t2基因克隆到食品级细胞内诱导表达载体pRNA48上,构建成食品级细胞壁锚定表达载体pRNV48,与宿主菌L.lactisNZ9000共同构成乳酸乳球菌食品级细胞壁锚定诱导表达系统。为检测该系统的功能,将铜绿假单胞菌融合外膜蛋白基因OprF/H克隆进pRNV48中,并检测了OprF/H的表达量和免疫原性。     

乳酸乳球菌食品级表达载体的改造（摘要）

[目的]改造乳酸乳球菌食品级表达载体,拓宽原系统的应用范围。[方法]以pNZ8149为基础,在pNZ8149的启动子PnisA下游插入乳酸乳球菌MG1363未知分泌蛋白（Usp45）的胞外分泌信号肽基因序列SPusp45,利用特异性引物通过PCR方法删除启动子序列和信号肽基因序列间的酶切位点,确保SD序列和起始密码子间的距离相对最佳,构建分泌表达载体pNZS。将报告基因gus重组到pNZS的多克隆位点中,构建pNZS-gus,电击转化L.lactisNZ3900。以10ng/ml的nisin诱导培养,取培养液进行GUS染色试验。[结果]新构建的L.lactisN3900/pNZS-gus系统可以正确表达有活性的GUS蛋白,并可以将GUS蛋白分泌到细胞外。[结论]该系统的构建成功,为目的蛋白的分泌性表达研究和口服级疫苗的研制奠定了基础。     

TK酶基因在乳酸乳球菌中的表达

利用乳酸乳球菌nisin诱导基因表达系统(the Nisin Controlled gene Expression system,NICE)表达TK酶基因.采用基因克隆和表达方法,表达产物通过SDS-PAGE进行鉴定.重组质粒测序结果表明,转化到乳酸乳球菌中的TK基因与pWSTK6基因(登录号为EU530625.1)相...     

Roles of PLC-beta2 and -beta3 and PI3Kgamma in chemoattractant-mediated signal transduction

The roles of phosphoinositide 3-kinase (PI3K) and phospholipase C (PLC) in chemoattractant-elicited responses were studied in mice lacking these key enzymes. PI3Kgamma was required for chemoattractant-induced production of phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate [PtdIns (3,4,5)P3] and has an important role in chemoattractant-induced superoxide production and chemotaxis in mouse neutrophils and in production of T cell-independent antigen-specific antibodies composed of the immunoglobulin lambda light chain (TI-IglambdaL). The study of the mice lacking PLC-beta2 and -beta3 revealed that the PLC pathways have an important role in chemoattractant-mediated production of superoxide and regulation of protein kinases, but not chemotaxis. The PLC pathways also appear to inhibit the chemotactic activity induced by certain chemoattractants and to suppress TI-IglambdaL production.     

亚硝酸盐胁迫下植物乳杆菌WU14亚硝酸盐还原酶的食品级高效诱导表达及其酶学性质研究

【目的】研究亚硝酸盐胁迫下植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）WU14亚硝酸盐还原酶（nitrite reductase,NirS）的作用机制,为发酵食品中应用乳酸菌纯种培养技术降解亚硝酸盐奠定基础。【方法】在37℃培养条件下,测定含0.02%-0.16%NaNO₂的MRS培养液中L. plantarum WU14 24 h的生长密度、pH及NaNO₂降解量。通过PCR扩增和TA克隆得到NirS,并克隆到乳酸乳球菌食品级细胞内高效诱导表达载体pRNA48中,获得重组菌L. lactis NZ9000/pRNA48-NirS。重组菌经30 ng·mL^-1 nisin诱导后,经SDS-PAGE和盐酸萘乙二胺法分析目的蛋白的表达情况及NirS酶活。通过生物信息学软件预测分析NirS编码的蛋白质二三级结构、跨膜结构及疏水性。【结果】L. plantarum WU14能够在NaNO₂浓度小于0.12%的MRS培养基中生长并降解一部分NaNO₂,在0.10% NaNO₂培养液中发酵24 h后降解量达到最大,为56.34 μg·mL^-1,NirS酶活达2 347.5 U·mL^-1。NirS编码的蛋白质是一种以α-螺旋和无规则卷曲为主,不存在信号肽和跨膜结构的亲水蛋白。NirS可在L. lactis NZ9000中高效表达,该重组菌能够在NaNO₂浓度低于0.10%的GM17培养基中生长并降解一部分NaNO₂,在含0.04%NaNO₂的培养液中亚硝酸盐降解量达到最大,为22.21 mg·mL^-1,NirS酶活为925.41 U·mL^-1。【结论】L. plantarum WU14的NirS能够降解高浓度的亚硝酸盐,并且经食品级异源表达的NirS具有较高的酶活力。本研究为探索研究亚硝酸盐降解的机理,建立发酵食品中亚硝酸盐降解的可控发酵体系提供了参考。     

乳酸链球菌最适抑菌培养条件的研究

为降低天然防腐剂乳酸链球菌素（Nisin）的生产成本,以金黄色葡萄球菌为试验菌,探讨了直接利用乳酸链球菌（Lactococcus lactis）培养液进行抑菌的最适培养条件。首先通过单因素试验,初步确定了最适碳源、氮源、金属离子及其浓度或配比的范围,然后采用正交试验L9（3^3）优化后得到的乳酸链球菌抑茵的最佳发酵条件为：3.0g／100g葡萄糖,4g／100g蛋白胨,2g／100g酵母膏,1g／100g牛肉膏,0.005mol／L MgSO4。优化后的培养基抑菌能力明显提高,此结果可为乳酸链球菌素的生产提供参考。