分泌抗苹果茎沟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

 用苹果茎沟病毒（ASGV）免疫的BALB/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞（Sp2/0-Ag14）融合，经3次克隆化培养和ELISA筛选，建立了7株分泌抗ASGV的单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞株。上述细胞株的腹水McAb滴度在1:256000 ～ 1:4096000之间，而且均不与另一种常见的潜隐病毒苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）起交叉反应。腹水McAb经纯化和辣根过氧化物酶（HRP）标记后，用间接ELISA方法检测感染ASGV的昆诺藜汁液，具有特异性强、灵敏度高等特点。     

分泌抗传染性法氏囊病病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

利用超滤膜超滤浓缩法纯化的鸡传染性法氏囊病病毒 (Infectious Bursal Disease Virus)疫苗株 D78免疫 BALB/ c小鼠。取其脾细胞与 SP2 / 0骨髓瘤细胞进行融合 ,经筛选克隆 ,成功地建立了 13株分泌抗 IBDV D78的杂交瘤细胞株 ,这些杂交瘤细胞株的稳定性好、特异性强 ,腹水和无血清培养上清 (浓缩 30倍 )中 Mc Abs的效价分别达 16 6和 10 3以上     

分泌抗春雷霉素单克隆杂交瘤细胞株的建立 及免疫学特性鉴定

【目的】制备高灵敏、高特异性的抗春雷霉素单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。【方法】采用EDC法将KSM分别偶联于载体蛋白BSA和OVA上,分别合成免疫原KSM-BSA和包被原KSM-OVA,经SDS-PAGE鉴定后,免疫Balb/c小鼠,免疫间隔4周,4次免疫后,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠进行细胞融合,经过多次亚克隆筛选出分泌高敏感的特异性抗KSM单克隆抗体的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备抗KSM的单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。【结果】SDS-PAGE鉴定结果显示KSM-BSA成功偶联,间接ELISA检测显示免疫的6只小鼠血清效价均达1:104以上,其中3号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度IC50为73.9ng•mL-1,融合后筛选出两株杂交瘤细胞株1G7和2C8,亚型均为IgG1型,其细胞上清效价分别为1:5.12×103 和1:1.28×103,腹水效价分别为1:5.12×105和1:2.56×105,抗KSM的单克隆抗体对春雷霉素的IC50为8.902ng•mL-1,与其它竞争物的交叉率均小于0.03%。【结论】本试验成功合成了春雷霉素人工抗原,并制备了敏感性高、特异性好的单克隆抗体,为春雷霉素免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。     

抗秋季型钩体杂交瘤细胞株的建立

用杂交瘤技术所生产的单克隆抗体,为制备特异性抗体及钧端螺旋体(钩体)的分型研究提供新的试剂.我们应用国内标准株秋季型钧体建立了3个杂交瘤细胞株,定名为LA_(11),LA_(15),LA_(13).它们对秋季型钩体均有特异性反应.杂交瘤细胞注入同系小鼠腹腔,可诱生高效价单克隆抗体腹水.杂交瘤细胞培养上清液经鉴定分别属IgG_1,IgG_2,IgM. 应用多种钩体活抗原混合免疫接种BALB/C小鼠、取其脾细胞与FO骨髓瘤细胞融合,在一次融合中成功地建立了差异较大的不同亚类杂交瘤细胞株,这在动物方面国内尚未见报导.     

抗牛轮状病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

以从黑龙江省腹泻犊牛粪便中分离的牛轮状病毒(bovine rotavirus)为抗原,免疫6～8周龄BALB/_c小鼠,取血清抗体阳性小鼠的脾细胞与SP_(2/0)骨髓瘤细胞融合。用ELISA间接法检测抗体,通过有限稀释法,克隆出一株分泌抗牛轮状病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经鉴定,此杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体为IgM,轻链为K链。通过连续传代证明,此杂交瘤细胞株具有稳定分泌单克隆抗体的性质。杂交瘤细胞诱生BALB/_c小鼠腹水的单克隆抗体滴度可达1:10000以上。     

抗犬瘟热病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

[目的]筛选出稳定分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。[方法]用纯化的犬瘟热病毒(CDV)抗原免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA和有限稀释法克隆杂交瘤细胞。研究了杂交瘤细胞的稳定性和染色体数,测定了单克隆抗体的效价并鉴定其特异性和亚型。[结果]经反复筛选和亚克隆后,共获得3株能稳定分泌抗CDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。3株单抗对CDV均有较高的特异性,与犬传染性肝炎病毒、犬细小病毒均不反应。3株杂交瘤细胞的腹水效价为1∶(8 000~128 000),细胞培养上清效价为1∶(256~512),染色体数为80~100。3株单克隆抗体重链均属于IgG1,轻链均属于κ链。[结论]该研究为研制CDV快速检测试剂盒奠定了基础。     

抗鸡IgC单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

利用纯化鸡血清ＩｇＣ免疫的Ｂａｌｂ／ｃ小鼠脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞进行融合，用ＥＬＩＳＡ间接法和夹心法作阳性抗体检测，经有限稀释法克隆，结果筛选出１株可持续分泌抗鸡ＩｇＣ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞株３Ｅ３，其培养上清和诱生Ｂｌａｂ／ｃ小鼠腹水的ＭｃＡｂ效价分别为１：４×１０＾２－１．２８×１０＾４和１：８×１０＾５－１×１０＾１０，经染色体分析可见到两种形态的染色体，该细胞株经体连续     

抗绵羊进行性肺炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用提纯的OPPV细胞抗原免疫BALB/c小鼠脾脏与SP2/0小鼠骨髓细胞融合,融合率为70%,以ELISA双抗体夹心法进行检测,阳性率为20%,经过有限稀释法克隆出1A₆、2B₈、1G₃、2G₄4株分泌抗OPPV抗原的单克隆体杂交瘤细胞株.选择抗体分泌滴度高的1A₆细胞进行了较详细的研究,结果表明,其核内染色体数为96～110条,抗体属性为IgG1,轻链为K链,IFA试验表明产生的McAb对OPPV有特异性,细胞传30代并在液氮中保存半年后复苏仍能稳定地分泌抗OPPV McAb,细胞分泌抗体的ELISA滴度腹水为6.4×10⁴,上清为640,McAb经硫基乙醇还原后在SDS-PAG上呈现2条区带,一条为重链部分,MW50000,另一条为轻链部分,MW为25000.     

牛病毒性腹泻病毒RT—PCR检测方法研究

【目的】建立快速、简便、特异的检测牛病毒性腹泻病毒抗原的RT-PCR方法;【方法】根据已发表的牛病毒性腹泻病毒株(BVDV)5’端非编码区保守序列设计合成了两条引物,应用RT-PCR技术对两株BVDV标准株(OregonC24V and NADL)进行基因扩增,对扩增产物进行酶切鉴定。同时设猪瘟兔化弱毒疫苗株、轮状病毒株、MDBK细胞作对照;【结果】两株BVDV标准株均扩增出了长度为325bp的片段,扩增产物经酶切后形成长度为111bp和214bp两条片段,而对猪瘟兔化弱毒疫苗株、轮状病毒株、MDBK正常细胞扩增均为阴性,与预期结果一致。【结论】PCR检测方法可以快速准确地对牛病毒性腹泻-黏膜病作出诊断。该方法的敏感性可高达10-1TCID50。     

牛病毒性腹泻病毒反转录及3'-末端克隆测序方法研究

牛病毒性腹泻病毒为黄病毒科瘟病毒属代表种,其基因组为单股正链RNA,无Poly(A)尾。传统的3'-末端快速扩增方法不适用于牛病毒性腹泻病毒的3'-末端克隆测序。本研究根据牛病毒性腹泻病毒基因组3'-末端共有特征碱基,设计回文锚定引物CGend。以BVDVJZ05-1毒株为研究对象,进行了反转录及3'-末端克隆测序。结果表明,CGend的反转录效果优于随机引物和一般特异性下游引物,并且扩增得到了JZ05-1的3'-末端完整序列。本研究为瘟病毒属病毒反转录和3'-末端克隆测序提供了新思路。     

牛病毒性腹泻/黏膜病病毒河北分离株的生物学特性

【目的】了解牛病毒性腹泻病毒河北分离株HB株的特性,阐明牛病毒性腹泻/黏膜病致病机理,更好的控制BVDV感染、流行提供理论依据特进行此项试验;【方法】用理化学及生物学方法对BVDV河北分离毒株HB的特性进行检测,与BVDV准毒株OregonC24V株进行比较,分析了其理化性及生物学特性。电镜负染检查可见直径为40￣60nm有突起的圆形或近圆形的病毒颗粒,病毒在蔗糖中的浮密度为1.13￣1.14g/cm3。与牛病毒性腹泻-粘膜病病毒颗粒相似。毒力测定TCID50为10-4.5。理化学研究表明,该病毒对氯仿、乙醚、胰酶敏感;不耐酸、对碱具有较强的耐受性。牛病毒性腹泻/黏膜病病毒对56℃30min较敏感,56℃70min可使其完全灭活。血凝试验表明,该病毒对鸡、兔、猪和绵羊的红细胞均无血凝性;5-碘脱氧尿核苷(5,-IUDR)不能抑制病毒的增殖,核酸分型试验表明该病毒株基因组为RNA;病毒纯化后经SDS—PAGE电泳出现了5条主要结构蛋白带,与BVDV国际标准毒株OregonC24V株结果一致;【结论】河北分离株HB株为牛病毒性腹泻病毒。     

牛病毒性腹泻病毒HB-DCZ株NS2-3区基因克隆及序列分析

【目的】对牛病毒性腹泻病毒HB-DCZ株NS2-3区基因进行克隆及序列分析,为阐明本病致病机理,更好的控制BVDV感染、流行提供理论依据。【方法】以牛病毒性腹泻病毒河北分离株(HB-DCZ)基因组RNA为模板,扩增BVDVHB-DCZ株基因组NS2-3片段cDNA。将PCR产物克隆后进行PCR及双酶切鉴定。克隆产物进行序列测定及分析。【结果】HB-DCZcDNA体外扩增获得特异性条带,大小约为665bp,表明该分离毒株基因组中无插入序列。PCR产物克隆,提取重组质粒,扩增获得特异性的DNA条带,长度约为665bp,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,获得两条DNA片段,长度分别为2600bp和702bp左右,与理论值相符。序列测定结果表明,克隆得到的NS2-3重要区扩增片段共665核苷酸,NS2-3重要区的蛋白质由208个氨基酸残基组成。HB-DCZ毒株NS2-3重要区核苷酸序列与已公开发表的BVDV其他毒株相比的同源性依次为184株99.1%,ZM195株97.4%,Osloss株92.3%,C_(24)V株77%,NADL株76.4%。HB-DCZ在NS2-3扩增区域中既没有外源序列的插入,也没有基因重组、重排或缺失,但存在某些核苷酸的替换。【结论】HB-DCZ与Osloss株、国内的184株、ZM195株遗传距离较近,与C_(24)V株、NADL株遗传距离较远。HB-DCZ株应为BVDVIb基因亚型。     

牛病毒性腹泻病毒结构蛋白基因的克隆及其B细胞抗原表位的预测

[目的]以免疫信息学和反向疫苗学为理论根据,应用生物信息学相关软件和方法,对BVDV结构蛋白( Structural Protein,SP)的二级结构的不同方面及其B细胞表位进行了预测,综合评价了BVDV结构蛋白的抗原特异性细胞表位,并计算出一些潜在的抗原位点.[方法]利用RT- PCR扩增法获得牛病毒性腹泻病毒结构蛋白序列,通过克隆、测序分析结构蛋白基因的基因组序列和蛋白序列,采用DNAStar Protean软件对结构蛋白的二级结构、可塑性、亲水性、表面可及性及抗原指数等参数进行综合分析,并预测其B细胞的抗原表位分布.[结果]P14、gp48和gp53蛋白含有的细胞优势抗原表位较多,有的甚至有可能成为优势抗原表位或对优势抗原表位有协同作用.[结论]与已鉴定的B细胞抗原表位相比,试验所用方法预测的结果有较高的准确度,是一种较为先进的表位研究方法.     

传染性牛鼻气管炎病毒单克隆抗体的制备及其应用

采用改进的融合技术得到318个杂交瘤细胞系。经ELISA筛选,这些细胞系所分泌的抗体均和病毒抗原发生反应。亚克隆出26个杂交瘤细胞系,制出特异的单克隆抗体,并采用ELISA、放射免疫沉淀试验(RIPA)、SDS-PAGE、免疫印迹及病毒中和试验等对单克隆抗体的特性作了鉴定。应用单克隆抗体对牛疮瘆病毒Ⅰ型Bovine HerpesVirus I(BHV—Ⅰ)主要结构蛋白作了分析。     

牛病毒性腹泻病毒一步 RT-LAMP快速检测方法的建立

[目的]建立一种快速、敏感、特异的检测牛病毒性腹泻病毒（BVDV）反转录环介导等温扩增（RT-LAMP）方法,为诊断与监测BVDV 提供准确可靠工具。[方法]根据GenBank公布的BVDV序列,在其保守序列区域设计了一套 LAMP引物,优化了反应时间与反应温度,建立了检测 BVDV的 RT-LAMP方法。[结果]该方法能在56℃等温条件下40分钟完成扩增,扩增结果可通过凝胶电泳梯形带判定。该方法具有良好的特异性和敏感性,最低能检测到3.74×100 copies/μl的病毒 RNA,而且与其他病毒无交叉反应。[结论]该方法能用于牛病毒性腹泻病毒的诊断与监测。