坛紫菜优良品系的选育与特性分析

利用体细胞克隆技术,从象山湾采集回来的坛紫菜叶状体的体细胞再生群体中筛选出细长型生长快的叶状体,再次进行体细胞克隆,从它的体细胞再生体中再次选育出生长最快的叶状体,依此法连续筛选3次,最后获得一个快速生长的优良品系(XS-1),其F1代的叶状体在生长速度、成熟期、3种主要光合色素含量等方面明显优于野生型品系(wt)。在相同条件下培养80d,XS-1品系的F1代叶状体平均体长达128.8cm,是wt品系的10.45倍;XS-1品系的F1叶状体群体的成熟高峰出现时间比wt品系推迟20d;在波长350～750nm之间,两个品系的叶状体活体吸收光谱中均出现5个吸收峰,但XS-1品系的各峰峰值均远高于wt品系;XS-1品系的叶状体总藻胆蛋白含量高达80.4mg/g,比wt品系提高了188%,而它的Chl.a含量比wt品系提高了32%;XS-1品系的叶状体平均厚度为32.2μm,比wt品系减少15%。研究结果表明,XS-1品系是一个生长快、颜色和品质好、遗传稳定的优良品系,有望在生产中得到应用。     

坛紫菜优良品系的品质分析

坛紫菜优良品系（HR-5）具有叶状体薄、味道好、生长快、壳孢子放散量大等优良特性,为了将其培育成新品种,本文对该品系和传统栽培品系（WT-dt）的海区栽培菜的粗蛋白质、总氨基酸、游离氨基酸等含量进行了测定,其结果如下：1. 一至三水菜的粗蛋白质含量：HR-5为45.2~38.0%,WT-dt为39.5~33.2%,前者的含量均显著高于后者（P＜0.05）;且随着采收期的增加,它们的粗蛋白质含量均逐渐下降。2. 两个品系的总氨基酸含量：HR-5为361.8~287.4 mg/g,WT-dt为321.8~264.8 mg/g,前者的含量均高于后者（P＜0.05）,也随着采收期的增加,它们的总氨基酸含量均逐渐下降。3. 两个品系的游离氨基酸含量：HR-5为3391.8~1983.2 mg/100g,WT-dt为2930.2~2046.7 mg/100g,一水和二水菜的游离氨基酸含量前者均显著高于后者（P＜0.05）。4.前三水菜的主要呈味氨基酸：HR-5显著高于WT-dt（P＜0.05）,且随着采收期的增加,它们的含量均逐渐下降。上述结果证实：HR-5品系的粗蛋白质、总氨基酸、游离氨基酸和主要呈味氨基酸等含量等均比WT-dt品系高,这是该新品系的味道明显好于WT-dt品系的原因所在。     

坛紫菜优良品系“申福1号”苗种培育技术研究

试验于2003～2005年连续进行了3年。“申福1号”的贝壳丝状体培育条件与传统品种基本相同,但也有不同之处。培育良好的“申福1号”贝壳丝状体其壳孢子放散量与传统品种几乎一样,完全能满足生产大规模采苗要求。“申福1号”苗种下海养殖1个月,其藻体平均长度是传统品种的2倍多,表现出生长快,生长期长,不易成熟,色泽好等优点,增产增值效果很显著。     

紫菜优良品系苗种培育技术

引进优良品系“申福2号”坛紫菜及“太空1号”条斑紫菜,对其苗种培育关键技术进行了研究及示范推广.将“申福2号”坛紫菜及“太空1号”条斑紫菜自由丝状体用搅碎机60 ～120 S切碎成300～500μm的藻丝段,喷洒于平铺的贝壳上,密度约为500段/cm2,进行移植贝壳培育.并对移植后的贝壳丝状体采用控制光时、光强、温度等调控措施,结果显示:坛紫菜“申福2号”在水温26 ～29℃下,获得丝状体贝壳10972.5 m2;条斑紫菜“太空1号”在水温22 ～21℃下,获得丝状体贝壳60 m2;两个品系的丝状体成熟率均达40％以上.在显微镜(10×10倍)下观察,成熟的坛紫菜丝状体经10 h的夜间海水刺激,一滴孢子水(面积约204.1 mm2)一个视野(面积约3.14 mm2)平均80个壳孢子;条斑紫菜丝状体经7d左右的池水搅动刺激,采苗帘—根纱头一视野平均20个壳孢子,采苗效果良好.采苗后的养成面积,坛紫菜“申福2号”为12194亩,条斑紫菜“太空1号”为29亩.     

开敞性滩涂海区坛紫菜品系引进试验

引进“杂交重组1号”与HMY2个坛紫菜品系,以本地龙沙种系为对照组,通过苗种培育、壳孢子采苗、海上栽培及采收试验,综合评估藻体生长、采收量、经济性状及柔韧性等因素,认为：HMY坛紫菜品系综合效果较好,可作为西湾滩涂坛紫菜栽培的主推品系之一。     

坛紫菜“申福2号”的SSR分子标记

利用微卫星(SSR)分子标记技术, 对坛紫菜(Porphyra haitanensis)优良品系“申福2号”的丝状体和叶状体分别进行了特异性分子标记鉴定, 结果发现: 用9^#引物(序列为F: TCACAATGGGTGATATGGC; R: CCACAT TTAAGTCCGACTCTG) 对“申福2号”丝状体的DNA进行扩增, 出现了能区别于其他14个品系(6个优良品系, 3个杂交品系, 5个野生品系)的特异性条带。用该引物对室内培养的“申福2号”叶状体的DNA进行扩增, 也均获得了与丝状体相同的特异性条带。此外, 用该引物分别对栽培在不同海区和不同时期采收的“申福2号”叶状体进行验证, 结果均出现了与丝状体相同的特异性条带。该特异性条带的DNA测序结果证实, 9^#引物产生的SSR标记反映了微卫星DNA重复序列的变化。通过SSR Hunter软件搜索到了设计引物时的核心序列, 所得产物大小在预期长度范围内, 是特异性扩增。通过BLAST比对得知, 该序列在核酸数据库中没有同源序列, 是一个新序列。通过DNAMAN软件分析得知, “申福2号”、“申福1号”之间序列差异较小, 与坛紫菜霞浦野生种差异较大。这证实该标记反映的是种内品系间的差异, 可以用于种内品系鉴定。上述结果表明, 由9^#引物扩增出的这一特异性条带可以认为是“申福2号”丝状体和叶状体的特异性标记, 可用于该品系的种质鉴定。

     

坛紫菜新品种“申福二号”养殖技术

秀屿区是海洋的大区、渔业的大区、又是坛紫菜养殖大区。全区坛紫菜养殖面积达2万亩以上,是沿海千家万户群众的一种主要养殖品种。然而当地长期以来自育自养的方式造成坛紫菜种质严重退化,藻体变厚变老,失去弹性和光泽,叶状体生长期明显缩短,病害增加,质量降低,产量和经济效益出现不同程度的下降。这些问题严重威胁着坛紫菜养殖业的生存和发展。申福二号为我国人工选育出来的优良品系,自引进我区以来,养殖效益显著。     

坛紫菜“申福2号”

<正>培育单位:上海海洋大学,福建省大成水产良种繁育试验中心品种简介:该品种是以2001年从福建平潭岛采集的野生坛紫菜的叶状体为基础种质,采用γ射线诱变、酶解处理,结合高温胁迫处理等技术,以壳孢子放散多、耐高温、生长速度和成熟晚为选育指标,获得的单倍体经单性生殖培养而成的二倍体纯系。在相同栽培条件下,30天~50天生长期的绝对生长率是坛紫菜传统养殖种的1.5倍;日龄120天的叶状体才开始出现性细胞,比传统养殖种晚熟90天,菜质下降速度慢,生长期长;产     

坛紫菜不同色素突变体的初步研究

初步探讨了坛紫菜Porphyra haitanensis褐色、褐绿色、翠绿色、红棕色、棕褐色、桔红色和紫色7种色素突变体的子一代叶状体形态特征、生长及4种主要色素含量的变化.3～4cm长的不同色泽幼苗经20d培养后的结果显示:(1)各色素突变体从长度、宽度、鲜重量和细胞厚度方面较野生坛紫菜均具有显著优势;在培养时间内,各色素突变体的长度日增长量均显著高于野生型坛紫菜;褐绿色、棕褐色和红棕色突变体在鲜重日增重率上表现出明显的优势,在第11～15天所有色素突变体的平均日增重率均高于野生型;(2)红棕色、棕褐色和紫色突变体的总藻胆蛋白含量明显高于野生型.紫色突变体的藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白含量均为最高,其中藻红蛋白、别藻蓝蛋白含量为野生型的3倍.叶绿素含量均无明显变化.本研究结果为有效利用坛紫菜的不同色素突变体进行种质改良奠定了良好基础.     

坛紫菜“申福1号”

坛紫菜“申福1号”（审定编号：GS-01—003—2009）是利用现代细胞工程技术,从经过人工诱变处理的野生型坛紫菜体细胞克隆再生群体中选育出来的新品种。     

条斑紫菜耐高温品系的特性分析与海区中试

通过室内培养和海区栽培实验验证条斑紫菜耐高温品系(T-17)优良性状的稳定性和栽培适用性。结果显示,与野生型品系(WT)相比,T-17品系的叶状体,在生长率、最大光化学效率、主要光合色素含量、藻体厚度和产量等方面均存在明显的优势。将在18℃下培养50 d的小苗再在18、22和24℃下培养35 d,T-17的绝对生长率分别为WT的17.71、15.81和33.00倍,特定生长率分别为WT的4.59、4.38和9.15倍,最大光化学效率分别为WT的1.17、1.29和1.58倍。WT的小苗在22、24和25℃下再分别培养25、15和10 d,叶片的颜色就转深变黑,藻体卷曲变硬,出现腐烂;而T-17的小苗在相同培养条件下培养相同的天数仍表现出良好的生长状态,藻体不变硬,无腐烂,说明T-17具有较强的耐高温性。此外,在日龄65 d的叶状体中,T-17的Chl.a和总藻胆蛋白(PE+PC)的含量分别是WT的1.45和1.54倍;T-17的平均厚度比WT减少26.4%。T-17的壳孢子放散量与WT相比差别不显著。在海区栽培试验中,T-17品系前4次收割的鲜菜总重量比当地栽培野生种(Wt)增加了16.3%,1~4次收割的鲜菜的最大光化学效率分别为Wt的1.06、1.12、1.17和1.27倍,而Chl.a含量分别是Wt的1.41、1.49、1.52和1.91倍,总藻胆蛋白含量分别是Wt的1.94、2.04、2.03和2.34倍。研究表明,与野生型品系相比,T-17品系在产量、品质和耐高温性等方面均明显提高,且性状稳定,生产适用性好,有望在生产上规模化栽培。     

坛紫菜叶状体蛋白质双向电泳样品制备方法的比较

蛋白质样品的制备是双向电泳分析的关键。为探索适用于坛紫菜叶状体蛋白质双向电泳样品的制备方法,实验对3种常用植物蛋白质分离方法进行了优化和改进,并分别同3种蛋白质裂解液联用,比较了9种方法的总蛋白质得率及双向电泳图谱效果。结果发现,采用三氯乙酸/丙酮沉淀法与裂解液C(7 mol/L 尿素,2 mol/L 硫脲,2%CHAPS,2%TritonX-100,2% IPG Buffer pH 3~10,65 mmol/L DTT)联用的方法,坛紫菜叶状体的蛋白质得率最高,且双向电泳图谱显示此法获得的蛋白质点数最多,蛋白点形状规则,水平和垂直拖尾情况较轻,图像清晰。实验结果还发现,在进行双向电泳分析时,采用pH 4~7的胶条可以使坛紫菜叶状体蛋白质得到更为有效的分离。     

坛紫菜种质材料DNA指纹图谱的构建

采用20对简单重复序列(SSR)引物对福建省坛紫菜种质资源库中保存的44个坛紫菜种质材料进行了遗传分析,共检测到了81个多态性位点,每对引物检测到的等位基因介于2~6个之间,平均为4.05个,引物的PIC值介于0.15~0.79之间,平均为0.57。然后根据3对引物(Phes08,Phes03和PC13)扩增出的16个多态性位点构建了44个坛紫菜种质材料的指纹图谱库,使得每一种质材料均具有其特异的DNA指纹图谱。并根据指纹图谱中各扩增位点条带的有无,将指纹图谱转化成了计算机可以识别的数码指纹,开发了相应的数码指纹识别软件,为坛紫菜种质的自动化鉴定及坛紫菜种质资源库的信息化管理奠定了基础。     

5.8S rDNA-ITS区片段的序列分析在坛紫菜种质鉴定中的应用

为探讨DNA序列标记技术在坛紫菜种质鉴定中的应用,对10个野生坛紫菜种质材料的5.8S rDNA-ITS区进行PCR扩增和序列分析,结果发现扩增的片段长度在1 208~1 219 bp之间,可以分为ITS1区,5.8S区和ITS2区3个部分,其中5.8S区片段的长度完全一致,均为160 bp;ITS1区和ITS2区片段的长度也非常接近,只有几个碱基的差异。多重序列比对发现10个种质材料的ITS区（包括ITS1和ITS2）序列都存在一定差异,序列同源性在95.82％~99.73％之间,而5.8S区序列则完全一致,但与其它种紫菜的5.8S区序列有很大差异,序列同源性在79.7％~95.0％之间。由此认为5.8S rDNA-ITS区这种高度保守区和高变区交替排列的形式可以成为坛紫菜种质鉴定及系统进化分析的强有力工具。     

高温胁迫下坛紫菜叶状体的生理响应

以坛紫菜耐高温品系Z-61 F₄代叶状体为试验材料、野生型坛紫菜叶状体为对照,研究了高温胁迫(30 ℃、26 ℃)与正常培养温度(21 ℃)下,处理不同天数(0、2、4、6、8、10 d)后坛紫菜叶状体中自由基含量、过氧化氢(H₂O₂)含量、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性和游离脯氨酸(Pro)含量的动态变化过程。结果发现耐高温型坛紫菜对高温胁迫的生理响应过程:高温胁迫→活性氧含量上升→细胞膜氧化受损,产生过量膜脂过氧化物→细胞感受到过量的活性氧信号→抗氧化系统和渗透压调节系统共同响应,清除活性氧→自由基含量下降。同时比较两种紫菜对高温胁迫的生理响应过程,发现耐高温型坛紫菜在高温胁迫下能同时启动抗氧化系统和渗透压调节系统,而野生型坛紫菜则只能启动渗透压调节系统,并且两种紫菜抗氧化系统的本底含量也存在着显著差别。由此说明不同品系坛紫菜耐高温性状差异的可能原因是细胞内抗氧化系统的应激性和本底含量存在差异。     

低氮、磷胁迫对坛紫菜叶状体生理生化特征的影响

以坛紫菜耐低氮(N)、磷(P)品系9号Ⅳ叶状体为材料,研究了低N、P胁迫不同时间水平对坛紫菜品质及自由基含量、过氧化氢(H₂O₂)含量、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性和游离脯氨酸(Pro)含量等生理指标的影响。结果表明,在低N、P胁迫条件下,作为坛紫菜品质重要指标的光合色素、粗蛋白和游离氨基酸含量均显著下降,而其余各项生理指标均随胁迫时间增加表现为动态变化的过程,由此推测耐低N、P型坛紫菜叶状体应答低N、P胁迫的生理过程为:低N、P胁迫→活性氧含量上升→细胞膜氧化受损,产生大量膜脂过氧化物→细胞感受到过量的活性氧信号→抗氧化系统和渗透压调节系统共同响应,清除活性氧→自由基含量下降。该实验结果为全面了解坛紫菜应答低N、P胁迫的生理机制奠定了基础,同时也为后续坛紫菜抗逆新品种的选育提供了理论指导。     

坛紫菜核糖体蛋白S7基因的克隆与表达分析

为了研究坛紫菜在高温胁迫条件下的分子应答机制,应用引物退火控制(ACP)技术对耐高温型纯系(Z-61)叶状体在高温胁迫条件下的差异表达基因进行筛选时,获得了一条核糖体蛋白S7基因的全长序列,命名为Phrps7(GenBank登录号:JF719273).该基因序列全长702 bp,包含一个585 bp的开放阅读框,其编码195个氨基酸的核糖体S7蛋白( PhRPS7),蛋白分子式为C984H1604N294O283S2,由5条α螺旋,6个片层及6个环状连接组成,与多个物种的RPS7蛋白具有较高的序列一致性(＞55％).系统进化树分析表明,PhRPS7蛋白与真菌的亲缘关系较近,而与其它物种的亲缘关系较远.实时荧光定量PCR分析结果表明,Phrps7基因的表达水平与高温胁迫密切相关,在高温胁迫刚开始时(0 ～6d),Phrps7基因的表达水平极显著上调,而随着胁迫的继续(＞6 d),表达量又有所下调,但仍显著高于胁迫开始前.     

印度产紫菜Pyropia chauhanii优良品系的选育与特性分析

为培育出藻体薄且适合在我国南方高水温海区栽培的紫菜新品种,利用~(60)Co-γ射线辐照和高温胁迫处理印度产紫菜Pyropia chauhanii野生型品系(PC-WT)的叶状体,分离出优良品系PC-M,随后通过研究2个品系在耐高温性、生长、主要光合色素含量、单孢子和壳孢子放散量等方面的差异后发现,在18和23°C温度组中,2个品系的壳孢子存活率、分裂率和假根发生率均无显著性差异,但在27和29°C温度组中,PC-M品系的壳孢子存活率比PC-WT品系分别提高了250.7%和305.4%,分裂率分别提高了42.4%和67.1%,假根发生率分别提高了86.6%和175.3%;将在23°C下培养30 d的叶状体分别置于18、23、27和29°C下培养10 d,在18、23和27°C组中,PC-M品系的叶状体绝对生长率分别是PC-WT品系的5.1、5.3和7.5倍,特定生长率分别是PC-WT品系的1.3、1.3和1.8倍;在27°C下培养15 d或在29°C下培养10 d,PC-WT品系的叶状体均放散了大量的单孢子,藻体流失严重,仅剩下基部,而PC-M品系的叶状体均没有放散单孢子、藻体形态完整、光泽好、生长速率快,培养至30 d后才发生轻微的卷曲。与PC-WT品系相比,常温组(23°C)的PC-M品系的3种主要光合色素(chl.a、藻红蛋白和藻蓝蛋白)含量以及壳孢子放散量分别提高了39.4%、209.8%、94.8%和36.7%,但藻体的平均厚度反而减少了31.6%。上述结果证实,与PC-WT品系相比,PC-M品系具有藻体薄、色素含量高、生长快、耐高温、壳孢子放散量大、单孢子不放散等优点,有望被培育成适宜栽培的新品种。     

坛紫菜自由丝状体响应琼胶寡糖的激发

为了研究琼胶寡糖对坛紫菜自由丝状体藻丝生长和壳孢子囊枝形成的激发的影响,实验采用琼胶寡糖激发坛紫菜自由丝状体,以液相氧电极检测坛紫菜丝状体净光合放氧速率的变化;以对羟基苯乙酸(POHPAA)化学发光法检测坛紫菜丝状体的H_2O_2释放量;利用LC-MS检测红藻糖苷含量变化;利用实时定量PCR技术检测坛紫菜丝状体H_2O_2产生相关基因(Phrboh、Ph SOD)和红藻糖苷合成相关基因(Phnho1、Phgpdh、Phtps)的表达情况;并利用显微镜观察法检测壳孢子囊枝数量的变化。结果发现,琼胶寡糖能够激发坛紫菜自由丝状体的系列响应,表现在净光合放氧速率以及光合同化产物红藻糖苷的含量和生物合成出现增加;H_2O_2释放量持续增加,与产生H_2O_2相关的2个酶基因Phrboh和Ph SOD的表达增强。此外,琼胶寡糖也能够促进在坛紫菜自由丝状体的发育,在培养第30天时,琼胶寡糖处理组的壳孢子囊枝形成率达到59%,显著高于对照组46%。综上所述,琼胶寡糖能够增加坛紫菜自由丝状体的光合速率和光合同化产物,并通过形成H_2O_2的酶的表达来诱导活性氧的释放;琼胶寡糖还能促进坛紫菜自由丝状体的繁殖发育。