A single recombinant plasmid expressing two major outer surface proteins of the Lyme disease spirochete

A gene bank of DNA from the Lyme disease spirochete was constructed in the plasmid pBR322. Plasmid pTRH32, a recombinant that in Escherichia coli expresses the two major outer surface proteins of the Lyme disease spirochete, was identified. One of the recombinant products, designated OspA, represents a surface protein that appears to be common to all Lyme disease spirochetes, whereas the other recombinant product, designated OspB, represents a more variable surface protein. This recombinant plasmid provides a foundation for future studies on the epidemiology and pathogenesis of Lyme disease as well as on the genetic organization of the etiologic agent.     

Lack of a role for iron in the Lyme disease pathogen

A fundamental tenet of microbial pathogenesis is that bacterial pathogens must overcome host iron limitation to establish a successful infection. Surprisingly, the Lyme disease pathogen Borrelia burgdorferi has bypassed this host defense by eliminating the need for iron. B. burgdorferi grew normally and did not alter gene expression in the presence of iron chelators. Furthermore, typical bacterial iron-containing proteins were not detected in cell lysates, nor were the genes encoding such proteins identified in the genome sequence. The intracellular concentration of iron in B. burgdorferi was estimated to be less than 10 atoms per cell, well below a physiologically relevant concentration.     

Detection of Borrelia burgdorferi DNA in museum specimens of Ixodes dammini ticks

In order to investigate the potential for Borrelia burgdorferi infection before the recognition of Lyme disease as a clinical entity, the polymerase chain reaction (PCR) was used to examine museum specimens of Ixodes dammini (deer ticks) for the presence of spirochete-specific DNA sequences. One hundred and thirty-six archival tick specimens were obtained representing various continental U.S. locations; DNA sequences characteristic of modern day isolates of B. burgdorferi were detected in 13 1940s specimens from Montauk Point and Hither Hills, Long Island, New York. Five archival specimens of Dermacentor variabilis (dog tick) from the same collection and 118 Ixodes specimens from other endemic and nonendemic sites were negative. These data suggest that the appearance of the Lyme disease spirochete in suitable arthropod vectors preceded, by at least a generation, the formal recognition of this disease as a clinical entity in the United States.     

Linear plasmids of the bacterium Borrelia burgdorferi have covalently closed ends

The genetics of spirochetes, a division of eubacteria, has been little studied. Double-stranded linear plasmids were found in Borrelia burgdorferi, the agent of Lyme disease. A 49-kilobase linear plasmid contained the ospA and ospB genes, which encode the major outer membrane proteins of strain B31. Molecules of the 49-kilobase plasmid rapidly reannealed after alkaline denaturation; rapid renaturation was prevented if the 49-kilobase plasmids were first treated with S1 nuclease. When denatured plasmid molecules were examined directly, single-stranded circles of approximately 100-kilobase circumference were seen. These studies provide direct visual evidence that the linear plasmids have covalently closed ends. This form of DNA occurs in some animal viruses, but it has not heretofore been described in prokaryotic organisms.     

高山红景天UGT72B14-2基因克隆及其原核表达

[目的]旨在构建UGT72B14-2的原核表达体系,为进一步研究其功能与应用奠定基础.[方法]利用RT-PCR技术从高山红景天茎叶中分离获取UGT72B14-2基因,在大肠杆菌中表达后,经Ni2+亲和柱纯化、PD-10柱脱盐处理,利用SDS-PAGE检测目标蛋白.[结果]测序结果表明UGT72B14-2基因长度为1 422 bp,预测其编码473个氨基酸,蛋白质相对分子量(Mr)为51.49 kDa,等电点(pI)为6.30;SDS-PAGE检测结果表明当初始菌液OD600约0.6时,诱导4h后目标蛋白即可大量表达,纯化、脱盐和浓缩处理后可获得较高纯度的重组蛋白.[结论]UGT72B14-2属于UDP-葡萄糖基转移酶家族的一员,能够在大肠杆菌中表达.     

大豆24 kDa油体蛋白基因在大肠杆菌中的表达

 分别构建了含全长大豆24 kDa油体蛋白基因、与大肠杆菌热敏毒素B亚基和定居因子CS6 B亚基基因以串联方式融合的全长大豆24 kDa油体蛋白基因、缺失N端74个氨基酸编码序列的油体蛋白基因及缺失C端152个氨基酸编码序列油体蛋白基因等4个大肠杆菌表达载体。除N端缺失的油体蛋白基因外,其它3个载体的IPTG诱导表达产物对E.coli生长表现出明显的抑制作用,菌液浓度与对照菌株相比,至少降低了3倍;而N端缺失了222个编码核苷酸的油体蛋白基因则对宿主细菌细胞的生长繁殖不再表现有任何毒性。进一步通过SDS-PAGE和Western印迹反应检测各表达载体的IPTG诱导表达产物时发现,仅有N端缺失的24 kDa油体蛋白基因片段在宿主细胞BL21(DE3)和Rosseta(DE3)中有重组油体蛋白积累。     

家蚕组织蛋白酶L(BmCathepsin L)基因鉴定、表达及其功能分析

【目的】鉴定克隆家蚕组织蛋白酶L基因BmCathepsin L(BmCat L),分析其序列和表达特征。分析家蚕组织蛋白酶L在大肠杆菌诱导下m RNA表达量的变化趋势,为进一步研究家蚕组织蛋白酶L的功能打下基础。【方法】基于家蚕基因组数据库(Silk DB)中序列BGIBMGA006893设计引物,利用RACE技术克隆家蚕组织蛋白酶L基因的cDNA全长序列,通过在线工具对基因结构和蛋白质分子量及等电点进行预测;在NCBI数据库下载其他物种组织蛋白酶L同源序列,利用Clustalx(1.83)和MEGA 6.0软件进行同源比对并构建进化树。运用RT-PCR和qRT-PCR对其时空表达特征进行分析。选取该基因的特异性片段,经PCR扩增,测序验证后将其连接至pET-28载体,转化至Rosseta感受态表达菌株,经IPTG在适宜温度条件下诱导,获得组织蛋白酶L重组蛋白。然后再利用镍离子亲和层析法对该蛋白进行纯化,获得纯度较高的重组蛋白。最后利用大肠杆菌对家蚕血液系统进行攻毒,检测家蚕组织蛋白酶L基因的表达水平。【结果】通过查询家蚕基因组数据库和生物信息学分析得出,家蚕组织蛋白酶L基因定位于家蚕第10号染色体上,基因编号为BGIBMGA006893,nscaf2860。基因开放阅读框全长687 bp,编码228个氨基酸,含有保守的Pept_C1结构域。通过在线网站预测,得出该蛋白酶的分子量为26.132 k D,等电点为4.57。进化分析表明该基因与同为鳞翅目昆虫的草地贪夜蛾和黑脉金斑蝶亲缘关系最为接近。RT-PCR显示该基因集中表达于血细胞,在血液不同龄期也较高表达。用His抗体检测经纯化后的蛋白,最终成功孵育出纯化后的蛋白条带;大肠杆菌个体攻毒免疫试验检测显示,其mRNA表达水平随攻毒时间呈现抛物线式的显著性变化规律,从而揭示出BmCat L与家蚕免疫系统的关联性。【结论】克隆获得家蚕组织蛋白酶L基因的cDNA序列,发现其特异性高表达于血细胞。通过原核表达和蛋白纯化成功获得了该基因的重组蛋白。大肠杆菌的刺激能够显著上调其表达,推测组织蛋白酶L可能参与家蚕免疫反应。     

短小芽胞杆菌抑菌蛋白TasA基因克隆及功能分析

为了研究短小芽胞杆菌Bacillus pumilus DX01菌株的抑菌相关基因的功能,采用PCR方法从DX01基因组DNA中扩增出编码TasA基因的全长DNA序列,并构建原核表达载体pET2-TasA,在大肠杆菌Escherichia coli BL21中表达获得TasA基因的融合表达蛋白,分别利用悬滴法和平板打饼法检测融合蛋白对玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)分生孢子萌发和对玉米小斑病菌及水稻稻瘟病菌菌丝体生长的抑制活性,结果表明TasA融合蛋白对这2种植物病原真菌的生长有着显著的抑制作用。TasA基因包含1个780bp的完整开放阅读框(GenBank:KC692521),编码259个氨基酸残基;该序列与B.subtilis菌株PEBS2501(GenBank::FJ713581)、B.amyloliquefaciens HF-01(GenBank:JF781312)和B.subtilis菌株BWST7003(GenBank:AP012496)同源抑菌蛋白基因序列相似性达99%。原核表达产物经SDS-PAGE分析检测到约32.3kDa的融合蛋白;经Ni-NTA柱纯化后的融合蛋白对供试病原菌均有显著的抑制作用。经测定发酵液的TasA融合蛋白产率为28μg/mL,短小芽胞杆菌抑菌蛋白TasA基因具有良好的抑菌效果。     

原核表达番鸭呼肠孤病毒σC与σB蛋白对雏番鸭的免疫保护

【目的】探讨原核表达的番鸭呼肠孤病毒（DRV）外壳蛋白σC与σB对于雏番鸭的免疫保护作用,为研制有效的DRV亚单位疫苗提供理论基础。【方法】对pET-30a-S3/BL21重组菌与pET-30a-S4 ORF2/BL21重组菌进行稳定性检验,表达的重组蛋白进行纯化和复性后,进行油乳剂制备,50只1日龄雏番鸭随机平均分为5组,即DRV σB蛋白免疫组、DRV σC蛋白免疫组、DRV σB + σC蛋白免疫组及PBS对照组和攻毒对照组,免疫组皮下接种剂量为500 μg/只,7日龄时进行二次免疫,14日龄时进行攻毒试验,ELISA和琼扩（AGP）检测抗体水平并计算保护指数。【结果】重组菌具有良好的稳定性,各免疫组的雏番鸭均在第2次免疫后7 d产生了一定效价的抗体,其中DRV σB + σC蛋白免疫组和DRV σC蛋白免疫组的雏番鸭血清抗体ELISA效价均为1﹕200,高于DRV σB蛋白免疫组的1﹕100。攻毒保护试验结果表明,联合免疫的保护指数最高,可达70,重组DRV σC保护指数次之,为60,重组DRV σB蛋白保护指数最低,仅为40。【结论】使用原核表达的DRV外壳蛋白σC与σB制备油乳剂,联合免疫可诱导雏番鸭快速产生一定效价的抗体,并提供良好的免疫保护力。     

海栖热袍菌极端耐热木聚糖酶B的提纯

克隆并在大肠杆菌中表达的海栖热袍菌的 xyn B基因 ,其表达产物木聚糖酶 B的 C 末端带有 6×His标签 ,研究了这种基因重组酶的提纯方法。通过对粗酶提取液的热变性处理 ,Ni NTA亲和柱层析和离子柱层析 ,最终得到了电泳纯的木聚糖酶 B,提纯倍数 4 4.4 ,得率 11。SDS PAGE法测定木聚糖酶 B的相对分子质量为 4 2 ku,与理论推算值 4 2 333u相吻合     

犬细小病毒VP2基因原核表达条件优化与蛋白纯化

为了提高犬细小病毒VP2基因在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中的表达量,通过改变诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等条件对表达量产生影响,以SDS-PAGE电泳分析证明VP2基因蛋白表达的最佳条件,并通过Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱法纯化目的蛋白。结果表明,重组质粒E.coliBL21（DE3）在35℃,1.0 mmol/mL IPTG诱导6 h时条件下蛋白表达量最高。SDS-PAGE电泳检测的纯化目的蛋白约为90 kDa,与预计大小一致。VP2基因融合蛋白的优化表达和纯化为研究犬细小病毒亚单位疫苗奠定了基础。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因的原核表达

大肠杆菌(Escherichia coli)不耐热肠毒素B亚单位(LTB)不仅是重要的黏膜免疫原,而且作为佐剂在黏膜免疫中起着重要的作用.试验采用PCR方法扩增了肠毒素性大肠杆菌的LTB基因,并将其克隆到pGEX-KG原核表达栽体上,构建了重组质粒pKG-LTB,经酶切和测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western-blot分析表明,克隆的LTB基因与谷胱甘肽转移酶(GST)基因获得了高效融合表达,表达的融合蛋白GST-LTB分子量约为35kDa,并具有免疫反应活性.这为进一步研究LTB蛋白黏膜免疫原性和黏膜佐剂的作用奠定了基础.     

猪伪狂犬病毒gB和gC蛋白B细胞表位编码序列的融合表达及活性测定

依据猪伪狂犬病毒g B和g C蛋白的B细胞表位编码序列,分别设计g B和g C蛋白B细胞表位编码序列的融合扩增引物,利用融合PCR技术,将g B和g C蛋白B细胞表位编码序列有机地融合为g B-C表位编码序列。将融合基因片段插入到原核表达载体p ET28a,并转化大肠杆菌BL21(DE3),1.0 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白。SDS-PAGE结果显示,融合蛋白g B-C能够高效表达,重组蛋白的分子质量约为38 ku;经Western blot鉴定分析,小鼠抗His标签单克隆抗体和PRV阳性血清均能识别表达的重组蛋白。表明成功表达了融合蛋白g B-C,且表达的重组蛋白具有较好的免疫学活性。     

重金属胁迫培养对微生物蛋白质含量的影响

[目的]研究重金属胁迫培养对微生物蛋白质含量的影响。[方法]选择4种典型微生物（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、啤酒酵母、链霉菌）为试验材料,采用传统微生物培养方法,在不同浓度的Hg2＋、Cd2＋、Cr6＋和Pb2＋重金属离子下进行胁迫培养,通过测定4种典型微生物的蛋白质含量,探讨重金属胁迫对4种微生物蛋白质合成的影响。[结果]低浓度的重金属对4种微生物蛋白质的合成有一定的促进作用,随着重金属浓度的增加,微生物蛋白质的合成均受到不同程度的抑制。枯草芽孢杆菌对这4种重金属的耐受性比其他3种微生物要强,4种重金属离子在比较大的质量浓度范围内（5～50 mg/L）对枯草芽孢杆菌蛋白质的合成有促进作用。低浓度Cr6＋对大肠杆菌蛋白质的合成有较强的促进作用;Pb2＋对大肠杆菌蛋白质合成有明显的抑制作用,对其他3种微生物蛋白质合成在一定浓度范围内有促进作用;低浓度的Cd2＋对4种微生物蛋白质的合成都有促进作用。[结论]该研究为探讨微生物对重金属胁迫的生理响应提供了理论依据。     

Asymmetry in the structure of the ABC transporter-binding protein complex BtuCD-BtuF

BtuCD is an adenosine triphosphate-binding cassette (ABC) transporter that translocates vitamin B12 from the periplasmic binding protein BtuF into the cytoplasm of Escherichia coli. The 2.6 angstrom crystal structure of a complex BtuCD-F reveals substantial conformational changes as compared with the previously reported structures of BtuCD and BtuF. The lobes of BtuF are spread apart, and B12 is displaced from the binding pocket. The transmembrane BtuC subunits reveal two distinct conformations, and the translocation pathway is closed to both sides of the membrane. Electron paramagnetic resonance spectra of spin-labeled cysteine mutants reconstituted in proteoliposomes are consistent with the conformation of BtuCD-F that was observed in the crystal structure. A comparison with BtuCD and the homologous HI1470/71 protein suggests that the structure of BtuCD-F may reflect a posttranslocation intermediate.     

鸭致病性大肠埃希菌的分离鉴定与毒力基因检测及菌蜕制备

从江苏省某水禽场的疑似感染致病性大肠埃希菌的病鸭中分离获得鸭致病性大肠埃希菌野毒株;通过玻板凝集和试管凝集试验确定其血清型,采用PCR进行分群分析和毒力基因检测;扩增φX_(174)噬菌体裂解蛋白E的基因序列,构建温控型表达质粒pBV221–E,并将其电击转化入分离毒株,升温诱导E蛋白表达制备菌蜕;通过测量菌液A600 nm值和在透射电镜下观察细菌形态,评估菌蜕构建效果;用该菌蜕进行灭活处理和无菌检测后,对雏鸭进行免疫,用间接ELISA法检测血清IgG水平。结果表明:该大肠埃希菌的血清型为O24,属于B1群,具有毒力基因fimC、csgA和iroN;获得的鸭致病性大肠埃希菌菌蜕裂解率为99.96%;经透射电镜观察发现,制备获得的菌蜕表面有明显孔道,细胞质从孔道溢出,细胞膜皱缩变形;抗体水平检测结果显示,二免后菌蜕免疫组雏鸭血清IgG水平显著提高。可见,通过将pBV221–E重组质粒转化至鸭致病性大肠埃希菌分离株,调节细菌培养温度诱导E蛋白表达,能制备鸭致病性大肠埃希菌B1群O24型野毒株菌蜕。该菌蜕可诱发机体产生体液免疫。     

甘蓝型油菜乙酰辅酶A羧化酶3个亚基基因的克隆及其表达

[目的]为构建乙酰辅酶A羧化酶的叶绿体表达载体奠定基础。[方法]以从甘蓝型油菜叶片中提取的叶绿体基因组DNA为模板进行PCR扩增,克隆羧基转移酶β亚基基因。以从开花20~29 d后油菜幼胚中提取的总RNA为模板进行RT-PCR扩增,克隆生物素羧化酶和生物素羧基载体蛋白的cDNA序列。最后,乙酰辅酶A羧化酶的3个亚基基因被克隆到大肠杆菌表达载体中。[结果]SDS-PAGE分析结果表明乙酰辅酶A羧化酶的3个亚基基因分别被克隆到大肠杆菌表达载体中。乙酰辅酶A羧化酶的3个亚基基因在大肠杆菌中的表达产物分别为76.6、44.0和81.5 kD,其融合蛋白分别占总菌体蛋白的12%、10%和6%。[结论]不同品种的甘蓝型油菜生物素羧基载体蛋白cDNA序列存在较大差异。     

GST-Dot4融合蛋白的表达·纯化及鉴定

[目的]为了提高Dotg蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达并获得较高纯度的蛋白。[方法]以pGEX—KG—Dot4重组质粒转化EcoliBL21后,用IPTG诱导重组菌表达GST—Dot4融合蛋白,采用SDS—PAGE及WesternBlot法鉴定表达产物,用GlutathioneSepharose4B亲和层析柱分离纯化。[结果]pGEX—KG—Dot4重组表达载体在大肠杆菌中获得高效表达;经GlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯化获得了高纯度的Dot4融合蛋白;WesternBlot表明,该蛋白可与GST标签抗体反应,表明获得了目的蛋白。[结论]在大肠杆菌中表达纯化后得到较高纯度的GST—Dot4融合蛋白,为Dot4蛋白的结构、功能及作用机制研究奠定了基础。     

鸡p15INK4B基因的克隆表达及纯化

为研究鸡p15INK4B蛋白的功能及为制备此蛋白的单克隆抗体提供材料,应用引物搭桥法合成p15INK4B基因,应用基因工程的手段构建p15INK4B基因的原核表达载体,在E.coliRosetta(DE3)菌进行融合表达,并对表达产物进行亲和层析纯化。结果成功地构建了p15INK4B基因原核表达载体,经亲和层析制备了较高纯度的目的表达产物。     

广谱拮抗菌B96-II启动子的克隆研究

[目的]构建拮抗菌B96-Ⅱ的启动子文库,为B96-Ⅱ的绿色荧光蛋白标记提供试验基础。[方法]提取拮抗菌B96-Ⅱ的基因组DNA,以绿色荧光蛋白基因（gfp）为报告基因,以启动子探针pNW33N-gfp为载体,通过鸟枪法在E.coliDH5α中构建B96-Ⅱ的启动子文库。[结果]通过筛选获得了21个阳性克隆,编号为P1~P21,这些阳性克隆在荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光。研究表明,在热激时间为90 s、用4μl酶连产物原液进行转化时,所得转化子数量最多,平均每平皿可得到167个转化子。[结论]表达绿色荧光蛋白的B96-Ⅱ启动子文库的成功构建为拮抗菌B96-Ⅱ的绿色荧光蛋白标记和环境行为研究奠定了良好的基础。