不同藻类与混养比例对刺参与马粪海胆生长、体成分和消化酶活性的影响

为研究不同藻类、刺参Apostichopus japonicus与马粪海胆Hemicentrotus pulcherrimus混养比例对刺参与马粪海胆生长、体成分和消化酶活性的影响,在水温9.5～16.5℃下,将体质量为(0.38±0.15) g的马粪海胆与体质量为(1.24±0.17) g的刺参混养于幼参育苗车间白色塑料箱(30 cm×40 cm×50 cm)中,各组刺参的初始放养质量为20 g,再按照胆参质量比3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3投放马粪海胆,各组分别投喂新鲜黏膜藻Leathesia difformis(H组,H1～H5)或孔石莼Ulva pertusa(L组,L1～L5)各20 g,对照组(D组)仅投喂配合饲料20 g。结果表明:藻类种类和胆参混养比例对刺参增重率(WGR)及特定生长率(SGR)有显著性影响(P<0.05),黏膜藻组在胆参比为3∶1时,刺参特定生长率最高(0.94%/d);孔石莼组在胆参比为2∶1时,刺参SGR最高(1.36%/d);不同藻类和胆参混养比例对海胆生长有显著性影响(P<0.05),海胆的SGR均随胆参混养比例的减小而递增,在同一混养比例下,L组海胆SGR显著高于H组(P<0.05);刺参肠道的胰蛋白酶(TRY)、淀粉酶(AMS)活性随胆参混养比例的降低呈递减趋势,其中,L1和L2组两组间无显著性差异(P>0.05),但均显著高于其他各组(P<0.05);相同混养比例下,L组胰蛋白酶和淀粉酶活性高于H组(P<0.05);而脂肪酶(LPS)活性仅受胆参混养比例的影响,且随胆参混养比例的降低而递减;胆参混养比例对H组、L组刺参体壁水分、粗脂肪含量均无显著性影响(P>0.05),粗蛋白质含量随胆参混养比例的减小呈先增加后降低趋势,其中L3组最高(39.10%),且显著高于其他各试验组(P<0.05)。研究表明,以孔石莼为饵料时,胆参适宜混养比例为2∶1,而以黏膜藻为饵料时,则为3∶1,研究结果可为构建综合养殖模式及防控刺参池塘大型藻类暴发性增殖提供数据支持。     

虾夷马粪海胆筏式人工养殖研究

报道了由日本北海道引种的虾夷马粪海胆大连海区进行筏式人工养殖的试验情况，结果表明：（１）采用扇贝笼、鲍鱼笼放塑料筐在大连近海水域进行筏式效果良好，虾夷马粪海胆在该海区可正常生长、并达性成熟；（２）饵料以海带，裙带菜等为主，间或投喂马尾藻、石莼等；（３）海区水温在－１．０－２５．２℃范围内，该海胆均可正常生活；（４）在大连海胆的生长速度比原分布区快一倍左右；（５）养殖１．５－２．０年壳径可达５．０di     

虾夷马粪海胆反季节繁育技术的研究

对虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius的反季节繁育技术以及繁育过程中亲胆的生殖调控、夏季高温对策等进行了研究.结果表明:当积温达到880℃·d时,亲胆性腺部分成熟;当积温达到1 950℃·d时,亲胆性腺成熟并可自然排放精、卵.利用反季节繁育技术可以使海胆繁殖期提早5个月,且受精卵孵化率≥98%,幼虫平均附着变态率为15.1%.对海水采用多次过滤加药物处理的新方法防除桡足类,效率可提高35%,采用海藻诱导法剥离稚胆,成活率可提高14%.     

虾夷马粪海胆筏式人工养殖研究

报道了由日本北海道引进的虾夷马粪海胆在大连海区进行筏式人工养殖的试验情况。结果表明：①采用扇贝笼、鲍鱼笼和塑料筐在大连近海水域进行筏式养殖效果良好,虾夷马粪海胆在该海区可正常生长、并达性成熟;②饵料以海带、裙带菜等为主,间或投喂马尾藻、石莼等;③海区水温在－１．０～２５．２℃范围内,该海胆均可正常生活;④在大连海区虾夷马粪海胆的生长速度比原分布区快一倍左右;⑤养殖１．５～２．０年壳径可达５．０ｃｍ以上并收获;⑥不同养殖器材的养殖密度和效果不同     

刺参密度对鲍参混养效果的影响

沿用水泥池笼养成鲍模式进行鲍参混养生产试验。固定幼鲍放养密度,分设5个刺参Apostichopus japonicus Selenk混养密度组。起始幼鲍放养密度为每层40粒,各组每层分别混养刺参0（对照）、1、3、5和7头。度夏后疏苗续养,幼鲍放养密度为25粒·层-1。各组刺参数量顺其自然存活数不变。经度夏历时510d出池检数。经统计分析,鲍参混养度夏阶段,鲍和刺参的成活率、规格与混养刺参密度之间的相关性都不显著（双侧,P＞0.05）。本次鲍参混养生产试验结果表明混养刺参密度每层2～3头为宜。     

虾夷马粪海胆不同肠道中菌群组成及其PCR-DGGE图谱分析

利用细菌16S rDNA PCR-DGGE指纹图谱技术,对虾夷马粪海胆不同肠道的微生物菌群组成进行分析,结果表明:海胆小肠与大肠样品分别得到14条与13条条带,其中,共有条带为10条,优势条带分别为7条与5条,特异性条带分别为4条与3条;经后续条带比较分析和DGGE图谱割胶测序后发现,小肠与大肠样品中微生物主要来源于外界海水环境,其菌群构成存在差异与虾夷马粪海胆消化巨藻存在不同有关。     

虾夷马粪海胆致病菌强壮弧菌的PCR检测方法

强壮弧菌Vibrio fortis是虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius的一种致病菌.为建立强壮弧菌的PCR检测方法,根据强壮弧菌gyrB基因的高度变异区序列设计引物,筛选出特异性强的3对引物VF-6、VF-7及VF-8,分别对强壮弧菌S0907及20株参比菌株进行PCR扩增,结果显示,3对引物均对强壮弧菌扩增出与预期大小一致的目的基因片段且参考菌株无扩增条带.以不同稀释度的菌悬液制备的DNA模板进行PCR扩增,结果显示,3对引物VF-6、VF-7及VF-8可检测的最低细菌浓度分别为4.1×104、4.1×103、4.1 ×102cfu/mL;对不同稀释度的细菌DNA模板进行PCR扩增,结果显示,3对引物VF-6、VF-7及VF-8可检测的最低DNA含量分别为1.4、0.14、0.014 pg/μL.试验结果表明:3对引物的特异性均较好,但灵敏度存在差异,其中以VF-8为引物的PCR检测方法最佳;使用以VF-8为引物的PCR检测方法对实验室养殖海胆及其生境样品进行初步检测,健康海胆、养殖海水及投喂的海带均为阴性,而自然海域海水中带有一定量的强壮弧菌.     

虾夷马粪海胆致病菌强壮弧菌的PCR检测方法

强壮弧菌Vibrio fortis是虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius的一种致病菌。为建立强壮弧菌的PCR检测方法,根据强壮弧菌gyrB基因的高度变异区序列设计引物,筛选出特异性强的3对引物VF-6、VF-7及VF-8,分别对强壮弧菌S0907及20株参比菌株进行PCR扩增,结果显示,3对引物均对强壮弧菌扩增出与预期大小一致的目的基因片段且参考菌株无扩增条带。以不同稀释度的菌悬液制备的DNA模板进行PCR扩增,结果显示,3对引物VF-6、VF-7及VF-8可检测的最低细菌浓度分别为4.1×104、4.1×103、4.1×102 cfu/mL;对不同稀释度的细菌DNA模板进行PCR扩增,结果显示,3对引物VF-6、VF-7及VF-8可检测的最低DNA含量分别为1.4、0.14、0.014 pg/μL。试验结果表明:3对引物的特异性均较好,但灵敏度存在差异,其中以VF-8为引物的PCR检测方法最佳;使用以VF-8为引物的PCR检测方法对实验室养殖海胆及其生境样品进行初步检测,健康海胆、养殖海水及投喂的海带均为阴性,而自然海域海水中带有一定量的强壮弧菌。     

虾夷马粪海胆TLR基因cDNA克隆及表达分析

采用同源克隆和cDNA末端快速扩增（ RACE）技术克隆获得一条虾夷马粪海胆Strongylocentrotus in-termedius TLR基因的全长cDNA序列SiTLR-1（GenBank： HQ259110）,并采用实时定量PCR技术分析了其在组织中的分布以及在致病弧菌Vibrio fortis、β-D葡聚糖和dsRNA刺激后的表达情况。结果表明： SiTLR-1全长序列为3637 bp,形成16个α螺旋、33个β折叠; SiTLR-1蛋白有两个跨膜区段,在725-750位有跨膜区,发现1个信号肽（1-32aa）、1个亮氨酸重复富集区（LRR）; SiTLR-1在检测的各组织中均有表达,在体腔液中表达量显著高于围口膜、管足和齿间肌（ P〈0.05）;经V. fortis、β-D-葡聚糖刺激后,体腔液中的SiTLR-1表达量显著上升,刺激后12 h达到最高值;经dsRNA刺激后,体腔液中的SiTLR-1表达变化较小,仅在3 h 时略有升高。研究表明, TLR 基因参与虾夷马粪海胆的免疫应答,克隆获得的SiTLR-1可特异性识别细菌和β-D-葡聚糖。     

虾夷马粪海胆TLR基因cDNA克隆及表达分析

采用同源克隆和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得一条虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius TLR基因的全长cDNA序列SiTLR-1(GenBank:HQ259110),并采用实时定量PCR技术分析了其在组织中的分布以及在致病弧菌Vibrio fortis、β-D葡聚糖和dsRNA刺激后的表达情况。结果表明:SiTLR-1全长序列为3637 bp,形成16个α螺旋、33个β折叠;SiTLR-1蛋白有两个跨膜区段,在725⁷50位有跨膜区,发现1个信号肽(1750位有跨膜区,发现1个信号肽(1³2aa)、1个亮氨酸重复富集区(LRR);SiTLR-1在检测的各组织中均有表达,在体腔液中表达量显著高于围口膜、管足和齿间肌(P<0.05);经V.fortis、β-D-葡聚糖刺激后,体腔液中的SiTLR-1表达量显著上升,刺激后12 h达到最高值;经dsRNA刺激后,体腔液中的SiTLR-1表达变化较小,仅在3 h时略有升高。研究表明,TLR基因参与虾夷马粪海胆的免疫应答,克隆获得的SiTLR-1可特异性识别细菌和β-D-葡聚糖。     

中间球海胆性别性状的微卫星分析

针对中间球海胆Strongylocentrotus interm edius育苗生产中很难进行活体性别鉴定这一特点,采用组织切片法和微卫星标记分析法对海胆进行观察分析。试验用样品由大连太平洋海珍品有限公司提供,共31只。采用组织切片法鉴别雌、雄个体,发现17只个体为雌性,14只个体为雄性。同时,将31只个体分为雌、雄两个群体,提取性腺组织基因组DNA,利用已经筛选好的11对引物对雌、雄两个群体进行微卫星分析。结果表明,两个群体的遗传多样性没有显著差异;发现INST09-A,INST10-A,INST10-B三个等位基因的频率在两个群体间存在极显著差异(P<0.01),位点INST10在雌、雄两个群体中的基因型频率存在极显著差异(P<0.01)。初步说明这些位点及相应等位基因可能与性别决定位点存在一定的连锁关系。     

中间球海胆雌核发育单倍体胚胎的初步研究

采用不同剂量(30～330mJ／cm^2)的紫外线对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius精子进行照射失活,获得了雌核发育的单倍体胚胎。测定了照射组与对照组的受精率、单倍体诱导率、2～4细胞期的畸形率和破膜囊胚成活率,探明了精子灭活的紫外线适宜剂量为270mJ／cm^2;并进行了早期胚胎地衣红压片观察和早期囊胚染色体数分析,观察到照射组早期胚胎的精核具有DCB小体,对照组早期囊胚的染色体数为2n=42,照射组雌核发育单倍体胚胎的染色体数为n=21。     

大连地区刺参幼参溃烂病细菌性病原的初步研究

2003年以来,大连地区养殖的刺参Apostichopus japonicus幼参出现溃烂病,其症状是刺参表皮某部位先出现白色斑点,继而开始溃烂,严重时全身溃烂、自溶。解剖观察发现,呼吸树水肿严重,有的甚至糜烂。从患病刺参的表皮溃烂组织和呼吸树中分离出优势菌,经人工感染试验证实,其中菌株HXS31、HXS32、HXS34、HXS22和BP12是引起刺参溃烂病的病原菌。对5株病原菌进行16SrRNA基因序列同源性分析的结果表明,菌株HXS31、HXS32、HXS34、HXS22属于弧菌属Vibriosp.。用常规细菌学方法对菌株BP12的鉴定结果表明,菌株BP12为假单胞菌属。5株病原菌均为革兰氏阴性菌,经常规负染方法染色后用电镜观察,菌株HXS31、HXS32、HXS22呈卵圆形;菌株HXS34和BP12分别为圆形和弯杆状,且都具有单极生鞭毛。药物敏感试验结果表明,呋喃妥因对5株菌有较强的抑菌作用。     

镉对中间球海胆精子发生的影响

研究了不同浓度镉离子(0.005、0.1、0.5、1.0 mg/L)对中间球海胆Strongylocentrotus interm edius精子发生的影响。结果显示:在光镜下观察,染毒第6、18 d后,各浓度组中间球海胆滤泡结构完好,生殖细胞发育情况同对照组基本一样;染毒第42 d后,0.5、1.0 mg/L Cd2 浓度组生精细胞排列混乱,滤泡膜破损;染毒第54 d后,各浓度组海胆性腺均出现滤泡解体现象。对染Cd2 54 d的0.5、1.0 mg/L组海胆精巢进行超薄切片观察,可见各级生精细胞亚显微结构变化明显,主要表现为核染色质异常凝集,核膜结构损伤,线粒体空泡化,精子形态畸形等。说明镉能影响中间球海胆的精子发生,导致精子质量下降。     

中间球海胆精子超低温冷冻损伤的研究

应用透射电镜技术研究了超低温冷冻保存对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius精子超微结构的影响。结果表明：不加抗冻剂的情况下,精子线粒体和顶体结构不完整,质膜、鞭毛破损。加入保护剂后,多数精子结构完好,部分精子细胞器受损,表现为质膜褶皱或膨胀举起,与核膜的间隙明显增大;顶体肿胀、破裂或脱落;线粒体嵴间隙增大,内部出现空泡,甚至线粒体内膜破损,内嵴减少,呈弥散状;鞭毛被膜肿胀,呈波浪状,＂9＋2＂型结构模糊;细胞核结构没有明显变化。应用单细胞凝胶电泳技术研究了精子冷冻保存前后DNA的损伤。结果表明,不加抗冻剂的冷冻组及添加抗冻剂的试验组精子DNA损伤情况与鲜精相比均无显著差异（P〉0.05）,冷冻对精子结构的损伤是造成精子活力及受精率下降的主要原因。     

中间球海胆精子超低温冷冻保存方法的研究

对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius精子的超低温保存技术进行了研究。以煮沸消毒海水为基础液,添加体积分数为10%的DMSO、体积分数为6%的甘油以及25 mmol/L海藻糖配制成冷冻保护液,与鲜精液按体积比以1∶1混合,在4℃下平衡15 min,于液氮面上方15、3 cm处分别停留3 min和5 min,然后浸入液氮保存。结果表明：用此方法保存的精子解冻后其存活率可达58.2%,受精率达24.7%;解冻后精子受精时,在受精海水中分别添加0、28、56、112、280 mmol/L的葡萄糖,56 mmol/L组的受精率高于其他组,受精率达26%;精子解冻后受精时,在受精海水中添加适量葡萄糖有助于提高受精率。本试验表明,冷冻过程中降温方式、冷冻保护液、平衡时间对精子的冷冻保存效果均有较大影响,各个因素通过优化组合可以大大提高解冻后精子的存活率和受精率。     

仿刺参幼参阶段4个生长性状遗传力的估计

以仿刺参Apostichopus japonicus为亲本,采用不平衡巢式设计方法和人工授精技术,建立了仿刺参12个父系半同胞家系和24个母系半同胞家系。分别在其3、4月龄时,从每个全同胞家系中随机选择30个后代个体,测定其体长、体重、肉刺数目及肉刺长度,并根据所测数据计算表型变量的原因方差组分,估算仿刺参幼参阶段体长、体重、肉刺数目和肉刺长度的遗传力。结果表明：仿刺参幼参阶段（0.002～1.95g）,其体长、体重、肉刺数目和肉刺长度4个性状的遗传力估计值分别为0.304～0.419、0.138～0.24、0.191～0.404、0.131～0.378,均属于中度遗传力范围,说明4个生长性状均处于加性效应控制下,对仿刺参的选择育种具有较大潜力。     

仿刺参耳状幼体和稚参阶段的体长遗传力估计

采用不平衡巢式设计方法和人工授精技术,为每个雄性仿刺参配3个雌性仿刺参,每个雌性个体产生若干幼体,建立了仿刺参Apostichopus japonicus9个半同胞家系和27个全同胞家系。对仿刺参中耳幼体的27个全同胞和稚参阶段的23个全同胞幼仿刺参的体长分别进行了测量,中耳幼体阶段共测量810个个体,稚参阶段共测量640个个体,并用MTDFREML软件中的混合动物模型对其进行分析,估计仿刺参早期生长发育的遗传力。结果表明,仿刺参中耳幼体阶段的体长生长性状遗传力为0．29,稚参阶段的体长遗传力为0．49。在仿刺参的不同发育阶段其体长生长性状的遗传力属于中度遗传力范围,说明仿刺参的体长生长性状是在加性效应控制下,对仿刺参进行选择育种具有较大的遗传改良潜力,可以获得较好的选择效果。     

中间球海胆幼体及稚海胆生长性状的遗传参数估计

为估计中间球海胆Strongylocentrotus intermedius幼体及稚海胆生长性状的遗传参数,采用巢式不平衡设计方法建立了44个中间球海胆全同胞家系,并测量了各家系海胆四腕幼体、六腕幼体和八腕幼体等各期浮游幼体的体长以及受精后30 d的稚海胆壳径,采用动物模型和约束性最大似然法(REML)估计了中间球海胆幼体和稚海胆生长性状的遗传参数。结果表明:中间球海胆四腕幼体和八腕幼体体长的遗传力分别为0.705±0.373和0.538±0.444,为高度遗传力,六腕幼体体长和稚海胆壳径的遗传力均接近于0,为低度遗传力;各阶段幼体体长和稚海胆壳径的共同环境效应为0.048~0.352;各阶段幼体体长间遗传相关为正相关(0.300~0.518),各阶段幼体体长与稚海胆壳径间的遗传相关为负相关(-0.152~-0.435)。本研究结果可为制定中间球海胆的早期选择和间接选择选育方案提供参考依据。