PCR扩增妊娠奶牛牙釉蛋白基因进行胚胎性别鉴定的研究

牙釉蛋白（amelogenin,简写为AML）基因是牙齿发育过程中丰富表达的多拷贝基因,AML基因的同源基因分别定位在XY染色体上。本试验利用x—Y同源的牙釉蛋白基因序列设计一对特异性引物（牛AML基因序列的扩增片段长度：雌性为只有467bp的特异性扩增片段：雄性为同时具有341bp和467bp的两条特异性扩增片段）,应用PCR技术同时扩增X和Y染色体上的特异性片段,扩增产物用PAGE电泳分离技术,经硝酸银溶液染色及扫描分析进行妊娠奶牛早期胚胎的性别鉴定。结果显示,从X染色体上扩增出467bp的片段．从Y染色体上扩增出341bp的特异性片段。由此可知,PCR扩增妊娠奶牛牙釉蛋白基因可以进行胚胎的性别鉴定。     

Sry基因和Y染色体重复序列在牛早期胚胎性别鉴定中应用效果的比较

本试验以牛Sty基因和Y染色体重复序列作为雄性特异性基因,分别设计引物,建立多重巢式PCR体系,比较二者在牛早期胚胎性别鉴定中的应用效果。试验结果表明,当扩增体系中的模板量为一个胚胎细胞的DNA量时,以Y染色体重复序列构建的扩增体系比Sry基因具有更高的灵敏度和稳定性,更适合用于牛早期胚胎性别鉴定。     

应用AML基因进行牛性别鉴定的研究

本文以染色体牙釉蛋白基因(AML)对牛肌肉基因组进行性别鉴定，为应用此基因进行胚胎鉴定提供理论依据。本研究应用奶牛染色体牙釉蛋白基因的DNA序列，设计了牛染色体特异性引物P1和P2，并通过聚合酶链反应(PCR)扩增牛肌肉组织中的X和Y染色体上的牙釉蛋白基因内第五内含子。最后依据其分子量的差异对电泳后的性染色体所呈现的不同区带进行区分，从而达到性别鉴定的目的，具有很高的应用价值。     

常规PCR和巢式PCR法鉴定牛早期胚胎性别体系的建立和优化

试验利用牛Y染色体重复序列作为雄性特异性引物,_以肿蔼坏死因子(TNFα)为内标引物建立多重PCR和多重巢式PCR体系,进行牛早期胚胎性别鉴定.共设计4对引物-Y染色体重复序列外引物和内引物,其扩增片段大小分别为534 bp和480bp,肿瘤坏死因子外引物和内引物,扩增片段大小分别为357 bp和272 bp.结果表明,4对引物均有很高的特异性和稳定性;多重PCR体系灵敏度为50 pg(约8个细胞),多重巢式PCR体系灵敏度为10 pg(约2个细胞),故多重巢式PCR体系更适合于牛胚胎性别鉴定.     

PCR在牛早期胚胎性别鉴定中的应用

早期胚胎性别鉴定的方法有很多种,大致可分为两大类：一是前期主要采用的非生物学方法,如组织方法,免疫学方法[~[p16]〔1〕],X-相关酶法[~[p16]〔2〕]等,这些方法都缺少准确性和速度;二是80年代末,随着DNA体 外重组技术而发展起来的分子生物学方法,如DNA探针法〔3〕,聚合酶链反应法（PCR）。其中PCR法以灵敏、特异、准确和快速等特点,而成为胚? 胎性别鉴定中最有研究价值的技术方法。自Herr等（1990）[~[p16]〔4〕]报道了用PCR进行奶牛胚胎性别鉴定技术之后,国内外许多学者从事了这方面的研究 ,使准确率接近或达到了[=]100%,同时操作过程也简化了许多,并且可以在几个小时内完成,为PCR法进行早期胚胎性别鉴定应用于生产提供了基础。     

利用牛Y染色体重复序列进行早期胚胎性别鉴定的研究

本试验利用Y染色体重复序列作为雄性特异性引物,以肿瘤坏死因子（TNF-α）为内标引物建立多重PCR体系,进行牛早期胚胎性别鉴定。共设计四对引物—Y染色体重复序列外引物和内引物,其大小分别为534bp和480bp;肿瘤坏死因子外引物和内引物大小分别为357bp和272bp。试验结果表明,优化后的多重PCR体系的灵敏度分别达到3个胚胎细胞,准确率100%,可以满足早期胚胎性别鉴定的需要。     

牛早期胚胎性别鉴定PCR反应体系的优化研究

根据牛SRY基因序列设计合成2对巢式PCR引物作为性别鉴定引物，根据牛酪蛋白基因序列设计了一对引物作为内标引物建立了牛胚胎性别鉴定的PCR反应体系。同时对常规PCR和巢式PCR在牛早期胚胎性别鉴定中的实用性进行比较。15头公牛、13头母牛的DNA样品检测结果表明：使用巢式PCR公牛可以扩增出205bp的SRY基因片段和403bp的酪蛋白基因片段，母牛只能扩增出403bp的酪蛋白基因片段；而使用常规PCR时公牛扩增出255bp的SRY基因片段和403bp的酪蛋白基因片段，母牛只能扩增出403bp的酪蛋白基因片段，其性别鉴定结果和实际完全一致。由于巢式PCR只需10个细胞就可以在紫外透射分析仪下看到扩增结果，而常规PCR则需要20～30个细胞，所以胚胎性别鉴定时使用巢式PCR效果更好。试验采用巢式PCR鉴定了10个奶牛胚胎的性别，同时还对血清是否会对试验结果产生影响进行了研究。     

应用PCR技术鉴定牛早期胚胎性别的研究

应用ＰＣＲ技术鉴定牛早期胚胎性别的研究吕碧文俞颂东金水仙（浙江省农科院畜牧兽医所,杭州,３１００２１）家畜胚胎的早期性别鉴定技术,是家畜胚胎移植技术的一项重要内容,其实质就是Ｙ染色体或存在于Ｙ染色体上的性别决定基因（即ＳＲＹ基因）的检测技术。ＰＣＲ...     

基因扩增技术在牛早期胚胎性别鉴定中的应用

家畜早期胚胎性别鉴定是近年来胚胎工程领域研究的重点，而基因扩增技术在胚胎性别鉴定的应用为实现家畜性别的人为控制带来了新的希望。目前用于牛胚胎性别鉴定的基因扩增方法主要有PCR法和LAMP法等。文章对SRY基因、动物性别决定的生物学机理和用于牛早期胚胎性别鉴定的基因扩增技术作一简要综述。     

非电泳法PCR牛早期胚胎性别鉴定研究

为选出更高效、实用的牛胚胎性别鉴定方法，分别用成年牛血样提取的基因组DNA和冷冻的牛早期胚胎细胞DNA为样本，以电泳法和非电泳法用相应的性染色体DNA引物做胚胎PCR性别鉴定实验，以相对比。血液模板DNA结果与胚胎样本结果都表明，使用DYZ-1引物的非电泳法在比使用SE引物的电泳节约1h以上时间的同时，具有比SE更高的灵敏度。这次研究在我国首次成功地把非电泳PCR法应用到牛胚胎性别鉴定之中，减少了胚胎性别鉴定的操作步骤，并大大缩短了性别鉴定所需要的时间，从而使胚胎移植现场性别鉴定更加可行。     

牛Y染色体特异DNA序列的体外扩增

本试验建立了用聚合酶链反应（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）体外扩增牛Ｙ染色体特异ＤＮＡ序列的方法。在牛、山羊和绵羊Ｙ染色体特异ＤＮＡ同源序列高度保守区设计一对引物，两条引物均为２０ＮＴ，对公牛Ｙ染色体特异的３０７ｂｐ序列进行体外扩增。从屠宰的成年公牛、母牛肝提取ＤＮＡ，用作ＰＣＲ扩增的模板。ＰＣＲ反应总体积为５０μＬ，各成分含量为：２５ｍｍｏ１／ＬＴｒｉｓ－ＨＣＩ（ｐＨ８．２），２５ｍｍｏｌ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍＬｇｅｌａｔｉｎ、５％Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ｌμｇ模板、引物各为２５ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各为２００μｍｏｌ／Ｌ、ＤＮＡ聚合酶２ＩＵ。反应在微机控制ＰＣＲ仪上进行，采用９２．５℃变性，５５℃退火，７２℃延伸，共３５个循环。扩增产物在２％琼脂糖凝胶上电泳，用ｐＧＥＭ－７ｚｆ（＋）Ｈａｅ　Ⅲ作分子量标准。电泳结果，公牛个体样品显示清晰可见的特异ＤＮＡ扩增带，而母牛个体样品无扩增片段出现。扩增产物用ＰｓｔⅠ酶解后出现３条区带，与预期结果一致。     

PCR技术及其在牛早期胚胎性别鉴定中的应用

本文对PCR(聚合酶链式反应)的基本原理、优点、方法及其在牛胚胎性别鉴定中的应用情况进行了扼要综述。     

用PCR对牛早期胚胎进行性别鉴定的研究进展

PCR技术能十分有效地鉴定出移植前牛胚胎的性别,而且能适用于生产实践。可以帮助养殖者充分有效的利用奶牛资源,获得更高的经济效益。本文就PCR技术、性别鉴定的发展概况和需要解决的问题进行综述。     

牛早期胚胎性别鉴定PCR反应体系优化的研究

根据牛SRY基因序列设计合成2对巢式PCR引物作为性别鉴定引物,根据牛-珠蛋白基因序列设计了一对引物作为内标引物建立了牛胚胎性别鉴定的PCR反应体系。公牛可以扩增出187bp的SRY基因片段和255 bp的-珠蛋白基因片段,母牛只能扩增出255 bp的-珠蛋白基因片段。由于巢式PCR只需3～8个细胞就可以在紫外灯下看到扩增结果,而常规PCR则需要较多的细胞,所以胚胎性别鉴定时使用巢式PCR效果更好。     

PCR方法鉴定牛早期胚胎性别研究进展

对用于早期胚胎性别鉴定的多重PCR、巢式PCR、引物一扩展预扩增PCR、非电泳PCR和LAMP法等扩增技术进行了综述,并针对早期胚胎性别鉴定技术在养牛业生产中的应用现状和存在问题进行分析与讨论,展望了PCR性别鉴定技术在养牛业中广阔的商业应用前景。     

建立全套式PCR对牛胚胎性别鉴定的方法

选择公牛Y染色体上的特异DNA序列和公母牛共有的DNA序列片段设计并合成引物,通过全套式PCR反应对公、母牛静脉血及牛胚胎进行特异性条带鉴定。结果表明,公牛出现322bp的性控条带和584bp的质控条带,而母牛仅出现584bp的质控条带。静脉血样与实际性别相符率为100％,显微切割下的5～8个胚胎细胞亦出现与静脉血样相同的特异性条带。这表明该种全套式PCR的鉴定方法准确、严谨、简便,具有很高的灵敏性和稳定性。     

用PCR鉴别牛胚胎性别的研究

本试验建立了用聚合酶链反体外扩增牛Ｙ染色体特异ＤＮＡ序列鉴别牛胚胎性别的方法。选择３头成年健康西门塔尔母牛为供体,在其自然发性后第９～１４ｄ,用ＦＳＨ超排处理,人工授精,发情后的第７ｄ（发情日为０ｄ）,用非手术法采集胚胎,共获得１１枚Ａ．Ｂ级胚胎。在立体显微镜下分别对胚胎进行分割,各获得２个半胚。一个法胚在２０μＬ含１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（ｐＨ８．３）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ,２ｍｏ     

应用PCR技术鉴定牛早期胚胎性别方法优化的研究

研究的目的是优化胚胎PCR性别鉴定方法的条件,建立实用的鉴定方法。试验设计获得了牛种属和公牛特异的引物,利用聚合酶链反应（PCR）对模板DNA进行扩增,通过常规双重PCR法和巢式PCR法的比较研究,结果表明巢式PCR法大大提高了鉴定牛早期胚胎性别的灵敏度。对组织DNA样品、血样、颗粒细胞和公牛冷冻精子进行检测,结果全部与实际性别一致;对于胚胎样品,判定结果与产犊性别一致。通过批量胚胎现场的检测,证明建立的胚胎性别鉴定方法可用于生产。     

利用TSPY基因鉴定奶牛早期胚胎性别的研究

TSPY（testis—specific protein）是Y染色体上特异的基因。公牛Y染色体上的TSPY基因的拷贝数达200个。本研究主要探讨利用TPSY基因鉴定胚胎性别的可能性。利用TSPY特异引物,通过PCR技术扩增牛血样DNA的结果为公牛血样均为阳性,母牛为阴性。结果表明,TSPY基因是一个很好的雄性特异标记。PCR扩增TSPY特异序列鉴定牛性别的灵敏度试验表明,DNA的最低需要量为20pg/μL,提示,TSPY特异基因具有鉴定牛早期胚胎性别的可能。