牙釉质基因巢式扩增鉴定牛早期胚胎性别的研究

根据牙釉质基因在牛X染色体和Y染色体上存在的差异设计巢式引物,对牛静脉血基因组DNA样本以及10枚牛早期胚胎DNA样本进行巢式扩增和电泳分析,以鉴定性别。结果表明:利用此方法能够对牛10 pg量血液基因组DNA进行扩增鉴定性别,雌性产生1条片段长度为311 bp的源于X染色体的条带,雄性产生1条源于X染色体的条带(311 bp)和1条片段长度为251 bp的源于Y染色体的条带,对10枚胚胎进行鉴定,6枚为雄性,4枚为雌性。说明牙釉质基因巢式PCR扩增鉴定牛早期胚胎性别方法可靠,准确性和敏感性较高。     

PCR扩增妊娠奶牛牙釉蛋白基因进行胚胎性别鉴定的研究

牙釉蛋白（amelogenin,简写为AML）基因是牙齿发育过程中丰富表达的多拷贝基因,AML基因的同源基因分别定位在XY染色体上。本试验利用x—Y同源的牙釉蛋白基因序列设计一对特异性引物（牛AML基因序列的扩增片段长度：雌性为只有467bp的特异性扩增片段：雄性为同时具有341bp和467bp的两条特异性扩增片段）,应用PCR技术同时扩增X和Y染色体上的特异性片段,扩增产物用PAGE电泳分离技术,经硝酸银溶液染色及扫描分析进行妊娠奶牛早期胚胎的性别鉴定。结果显示,从X染色体上扩增出467bp的片段．从Y染色体上扩增出341bp的特异性片段。由此可知,PCR扩增妊娠奶牛牙釉蛋白基因可以进行胚胎的性别鉴定。     

牛早期胚胎的性别鉴定PCR技术的研究

根据牛SRY(Y-染色体性别决定基因)基因序列自行设计合成3对常规PCR引物作为牛性别鉴定特异性引物,对15头公牛、20头母牛的样品进行检测.结果表明,第2对引物可清晰扩增出公牛基因组DNA750 bp左右条带,而母牛基因组DNA无此扩增条带,证明这条引物可以应用于牛的早期胚胎性别鉴定研究与应用.     

应用PCR技术鉴定牛早期胚胎性别方法优化的研究

研究的目的是优化胚胎PCR性别鉴定方法的条件，建立实用的鉴定方法。试验设计获得了牛种属和公牛特异的引物，利用聚合酶链反应（PCR）对模板DNA进行扩增，通过常规双重PCR法和巢式PCR法的比较研究，结果表明巢式PCR法大大提高了鉴定牛早期胚胎性别的灵敏度。对组织DNA样品、血样、颗粒细胞和公牛冷冻精子进行检测，结果全部与实际性别一致；对于胚胎样品，判定结果与产犊性别一致。通过批量胚胎现场的检测，证明建立的胚胎性别鉴定方法可用于生产。     

超微量DNA模板扩增鉴定绵羊早期胚胎性别体系优化

本实验旨在运用超微量胚胎DNA模板扩增SRY基因鉴定绵羊早期胚胎性别PCR体系和方法优化.根据绵羊Y染色体性别决定SRY基因的723 bp的保守序列设计引物,析因法建立巢式PCR体系,联合扩增SRY和GAPDH基因,经绵羊静脉血液和胚胎超微量DNA样本调整测试灵敏度后,切割40枚绵羊桑椹胚的少量胚细胞进行性别鉴定,并对...     

兔早期胚胎PCR性别鉴定体系的建立

根据兔SRY基因序列设计两对引物作为兔雄性特异性引物,根据兔APP基因序列设计1对引物作为内标引物,分别建立了兔早期胚胎性别鉴定的双重PCR和巢式PCR反应体系,在不同浓度的基因组DNA和兔早期胚胎上进行性别鉴定应用,同时,对兔SRY巢式PCR引物特异性进行了分析。结果表明,多重PCR扩增兔基因组DNA可以准确判定其性别,扩增灵敏度为100pg基因组DNA;多重PCR鉴定24枚兔32细胞桑椹胚性别,只能对整胚成功鉴定。巢式PCR,公兔基因组DNA扩增出282bp的SRY基因片段,母兔没有扩增产物,扩增灵敏度为10pg;对24枚兔32细胞桑椹胚性别鉴定结果表明,巢式PCR可以对少至4个胚胎细胞进行准确鉴定,同一胚胎结果符合率为100%(24/24)。SRY引物只对兔雄性基因组DNA特异,而其他动物(人、牛、绵羊、小鼠)雄性DNA及兔的冲卵液,均无PCR产物。     

萨能奶山羊早期胚胎性别鉴定体系的建立

根据GenBank中山羊的SRY(sex determining region of the Y)基因序列设计跨度为437 bp和346bp的两对嵌套式雄性特异性引物,同时根据GenBank中山羊的β-珠蛋白基因序列设计跨度为304 bp和174 bp的两对嵌套式常染色体引物作为内标引物,对提纯的萨能奶山羊血液DNA样品和胚胎细胞DNA样品进行PCR(polymerase chain reaction)以准确鉴定早期胚胎性别.扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析表明:通过10μL、20μL体系,56℃退火条件下,雄性胚胎具有346 bp SRY基因序列扩增带及304bp和174 bp常染色基因扩增带;而雌性胚胎只有304 bp和174 bp常染色基因扩增带.     

利用多重PCR技术鉴别牛早期胚胎性别研究

本研究利用一对根据牛Y-染色体特异重复序列设计的牛Y-染色体特异性引物和一对根据牛微卫星DNA设计的牛常染色体内标引物,通过对PCR反应体系中Mg^2＋浓度和PCR反应条件中退火温度的优化,建立了牛早期胚胎性别鉴定的多重PCR反应体系。     

牛早期胚胎性别鉴定PCR反应体系的优化研究

根据牛SRY基因序列设计合成2对巢式PCR引物作为性别鉴定引物，根据牛酪蛋白基因序列设计了一对引物作为内标引物建立了牛胚胎性别鉴定的PCR反应体系。同时对常规PCR和巢式PCR在牛早期胚胎性别鉴定中的实用性进行比较。15头公牛、13头母牛的DNA样品检测结果表明：使用巢式PCR公牛可以扩增出205bp的SRY基因片段和403bp的酪蛋白基因片段，母牛只能扩增出403bp的酪蛋白基因片段；而使用常规PCR时公牛扩增出255bp的SRY基因片段和403bp的酪蛋白基因片段，母牛只能扩增出403bp的酪蛋白基因片段，其性别鉴定结果和实际完全一致。由于巢式PCR只需10个细胞就可以在紫外透射分析仪下看到扩增结果，而常规PCR则需要20～30个细胞，所以胚胎性别鉴定时使用巢式PCR效果更好。试验采用巢式PCR鉴定了10个奶牛胚胎的性别，同时还对血清是否会对试验结果产生影响进行了研究。     

利用多重PCR技术快速鉴定牛性别的研究

为了建立一套简单、快速鉴定性别的方法,试验根据牛的Beta基因及SRY基因,设计2对引物(β-1,2和SRY-1,2),对牛96个牛肉DNA样本进行PCR性别鉴定。结果表明:雄性样品扩增出了300 bp和429 bp 2条片段,而雌性样品只能扩增出300 bp 1条片段。40个牛血液DNA样本鉴定结果与实际性别对比,雄性、雌性准确率均为100%。     

常规PCR和巢式PCR法鉴定牛早期胚胎性别体系的建立和优化

试验利用牛Y染色体重复序列作为雄性特异性引物,_以肿蔼坏死因子(TNFα)为内标引物建立多重PCR和多重巢式PCR体系,进行牛早期胚胎性别鉴定.共设计4对引物-Y染色体重复序列外引物和内引物,其扩增片段大小分别为534 bp和480bp,肿瘤坏死因子外引物和内引物,扩增片段大小分别为357 bp和272 bp.结果表明,4对引物均有很高的特异性和稳定性;多重PCR体系灵敏度为50 pg(约8个细胞),多重巢式PCR体系灵敏度为10 pg(约2个细胞),故多重巢式PCR体系更适合于牛胚胎性别鉴定.     

鸡与鹌鹑属间杂交早期胚胎性别鉴定体系的建立与优化

研究参考鹌鹑Wpkci和β-actin基因设计引物,采用RT-PCR技术,旨在建立鉴定鸡(♂)与鹌鹑(♀)杂交后代早期胚胎性别的方法。Wpkci引物扩增已知性别鹌鹑及未知性别杂交种胚胎的cDNA,从母禽胚胎获得402bp和296bp两条特异性条带,而公禽没有得到条带。为进一步验证该鉴定体系的可靠性和稳定性,采用了多重PCR从母禽胚胎获得490bp、402bp、296bp三条特异性条带,而公禽只有490bp的内标条带。在对试验关键因素进行优化的基础上,建立了简单、快速、可靠、稳定的鉴定杂交种早期胚胎性别的方法。     

Sry基因和Y染色体重复序列在牛早期胚胎性别鉴定中应用效果的比较

本试验以牛Sty基因和Y染色体重复序列作为雄性特异性基因,分别设计引物,建立多重巢式PCR体系,比较二者在牛早期胚胎性别鉴定中的应用效果。试验结果表明,当扩增体系中的模板量为一个胚胎细胞的DNA量时,以Y染色体重复序列构建的扩增体系比Sry基因具有更高的灵敏度和稳定性,更适合用于牛早期胚胎性别鉴定。     

利用性别决定基因(SRY)进行牛早期胚胎性别鉴定的研究

利用牛性别决定基因(SRY)和酪蛋白αs1基因(CSN1S1)分别设计雄性特异性引物和内标引物,两对引物均各设计一对嵌套式引物进行多重PCR和多重巢式PCR,用于牛早期胚胎性别鉴定。SRY基因和CSN1S1基因外、内引物扩增片断长度分别为357bp、232bp、528bp和367bp。实验结果表明,这两个引物组合建立的多重PCR扩增体系均有较高的扩增稳定性和准确率,但在常规PCR体系中,它们的灵敏度均不高(约50pg,相当于16个细胞的DNA量),这在一定程度上限制了其在胚胎性别鉴定中的应用。而由二者建立的巢式PCR灵敏度可达到5pg,故可以很好地满足胚胎性别鉴定的需要。     

利用TSPY基因鉴定奶牛早期胚胎性别的研究

TSPY（testis—specific protein）是Y染色体上特异的基因。公牛Y染色体上的TSPY基因的拷贝数达200个。本研究主要探讨利用TPSY基因鉴定胚胎性别的可能性。利用TSPY特异引物,通过PCR技术扩增牛血样DNA的结果为公牛血样均为阳性,母牛为阴性。结果表明,TSPY基因是一个很好的雄性特异标记。PCR扩增TSPY特异序列鉴定牛性别的灵敏度试验表明,DNA的最低需要量为20pg/μL,提示,TSPY特异基因具有鉴定牛早期胚胎性别的可能。     

利用TSPY基因鉴定奶牛早期胚胎性别的研究

TSPY(testis-specific protein)是Y染色体上特异的基因。公牛Y染色体上的TSPY基因的拷贝数达200个。本研究主要探讨利用TPSY基因鉴定胚胎性别的可能性。利用TSPY特异引物,通过PCR技术扩增牛血样DNA的结果为公牛血样均为阳性,母牛为阴性。结果表明,TSPY基因是一个很好的雄性特异标记。PCR扩增TSPY特异序列鉴定牛性别的灵敏度试验表明,DNA的最低需要量为20 pg/μL,提示,TSPY特异基因具有鉴定牛早期胚胎性别的可能。     

利用聚合酶链反应对体外受精牛胚胎进行活组织检测和性别鉴定

在16～32细胞阶段的胚胎上取下单个分裂球,利用聚合酶链反应(PCR)进行早期半胚胎性别鉴定。胚胎由体外受精获得,在体外受精后第5天进行活组织检测。活组织检测过的胚胎在单层卵丘细胞上培养直到移植。利用一对牛的特异引物和一对Y-染色体特异引物进行PCR。根据PCR扩增产物得到的信号表明,从植入前牛胚胎上分离的单个分裂球利用PCR足可以进行性别鉴定,准确率为95.4%。把19个经活组     

利用牛Y染色体重复序列进行早期胚胎性别鉴定的研究

本试验利用Y染色体重复序列作为雄性特异性引物,以肿瘤坏死因子（TNF-α）为内标引物建立多重PCR体系,进行牛早期胚胎性别鉴定。共设计四对引物—Y染色体重复序列外引物和内引物,其大小分别为534bp和480bp;肿瘤坏死因子外引物和内引物大小分别为357bp和272bp。试验结果表明,优化后的多重PCR体系的灵敏度分别达到3个胚胎细胞,准确率100%,可以满足早期胚胎性别鉴定的需要。     

不同PCR法对牛性别鉴定的影响研究

为建立一种有效的牛早期胚胎PCR性别鉴定方法,试验以12头已知性别的牛全血为试验材料,提取基因组DNA,分别运用常规PCR法、多重PCR法和巢式PCR法进行牛性别鉴定研究,用2对SRY(Y染色体性别决定区)引物和1对牛特异性引物扩增牛核基因组DNA进行牛性别鉴定,建立3种牛性别鉴定的PCR反应体系。结果表明,3种方法准确率均为100%,其中巢式PCR法检测灵敏度可达13pg,多重PCR法整个鉴定过程约需3h。     

牛胎儿成纤维细胞的培养及性别鉴定

为了探索和建立牛胎儿成纤维细胞体外分离培养及性别鉴定的技术方法,试验取自怀孕40 d的奶牛胎儿耳组织用组织块贴附法进行原代培养和传代培养,用倒置相差显微镜观察成纤维细胞形态;根据牛Y染色体上的性别决定区域(SRY)基因序列设计合成1对PCR引物作为性别鉴定引物, 同时根据牛403 bp的β-珠蛋白基因序列设计1对引物作为内参照引物,建立PCR 反应体系进行性别鉴定.结果表明:分离的成纤维细胞可在体外快速贴壁生长、增殖;阳性对照和第1牛胎儿成纤维细胞系PCR鉴定扩增得到255 bp的片段和403 bp的β-珠蛋白基因片段,第2,3牛胎儿成纤维细胞系和母牛血液PCR扩增只得到403 bp的β-珠蛋白基因片段,通过电泳证明PCR产物255 bp的片段为SRY基因片段,说明有255 bp扩增带的细胞系为雄性;无255 bp扩增带的细胞系为雌性.结果说明该方法所获得的牛胎儿成纤维细胞可在体外稳定培养,利用PCR鉴定牛胎儿性别具有简单、快速、准确的特点,可应用于基因克隆动物研究中体细胞系的早期性别鉴定.