柑橘凤蝶非滞育蛹、滞育蛹与滞育蛹羽化成虫蛋白质含量比较

为了进一步了解柑橘凤蝶滞育机理,利用比色法,测定了非滞育蛹、滞育蛹和滞育蛹羽化成虫不同发育阶段蛋白质含量。结果表明,非滞育蛹蛋白质含量在138．7350-176．7757mg／g,在整个非滞育蛹期间呈上升趋势,蛋白质含量变化较大,差异明显。在整个越冬期间,蛋白质含量在147．9750-196．9973mg／g,呈现一定规律波动;12月下旬至翌年1月下旬,含量有较大幅度上升,上升达49．0223mg／g,可能与气温下降抗冻蛋白产生有关。滞育解除后羽化成虫蛋白质含量为313．247mg／g,羽化成虫初期的高蛋白质含量可能与生殖系统的发育有关。蛋白质代谢在柑橘凤蝶不同发育过程中有着不同的代谢特征。     

家蚕BmHsp19.5基因的鉴定及在滞育卵中的表达分析

基于前期转录组学研究结果,从家蚕滞育卵和发育蚕卵中筛选出差异表达基因家蚕BmHsp19.5.为了进一步了解该基因的序列信息、表达特征以及在家蚕卵滞育过程中的功能,本文采用基因克隆、生物信息学方法以及qPCR检测等技术手段对该基因进行分析.结果表明:家蚕BmHsp19.5基因的ORF(open reading frame)框全长504 bp,共编码167个氨基酸,其蛋白的理论相对分子质量为1.95×10⁴.该蛋白65-157位氨基酸为Hsp20功能结构域,符合小热激蛋白家族结构特征.该基因在滞育卵和非滞育卵中表达量存在显著差异,在滞育卵中呈上调表达,且在第3 d达到最大值,推测该基因与滞育过程有关,可能在家蚕滞育进入时发挥了重要作用.     

烟蚜茧蜂Aphidius gifuensis滞育诱导研究

研究了不同温度、光周期以及温光组合条件对烟蚜茧蜂滞育诱导的效果。结果表明,僵蚜形成前,各种温度、光周期及温光组合条件均著的作用。僵蚜形成后,低温可大量诱导产生滞育,０℃处理３０ｄ,６０％以上个体进入滞育,而光周期的诱导作用仍不明显。作者认为你温是引起烟蚜茧蜂滞育的主要因素,处理的敏感时期为老熟幼虫－预肾期。滞育虫态为肾。     

家蚕抗菌肽的诱导及其抑菌作用研究

家蚕抗菌肽是存在于家蚕及蚕蛹的血淋巴内具有抗菌活性的多肽物质,在家蚕的天然免疫中起到至关重要的作用。采用不同剂量的γ-射线照射家蚕、对家蚕进行饥饿、电击和注射大肠杆菌等诱导处理后,提取家蚕抗菌肽,测定其抑菌效果。结果表明：以上的处理均能有效诱导抗菌物质的产生,其中饥饿法处理的家蚕产生抗菌肽的抑菌活性最强。本试验利用家蚕生产抗菌肽为家蚕的综合利用提供了一种新的途径。     

乳糖诱导家蚕抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达

根据家蚕抗菌肽Cecropin B的氨基酸序列,按大肠杆菌基因偏爱密码子,人工合成改造过的Cecropin B基因。将改造过的Cecropin B基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-41a中,构建了融合蛋白表达载体pET41a-cecB,转化大肠杆菌BL21(DE3),得到表达Cecropin B的大肠杆菌工程菌株。通过SDS-PAGE分析,研究了用乳糖代替IPTG诱导大肠杆菌BL21表达家蚕抗菌肽Cecropin B的诱导条件,得到乳糖的最佳用量为0.25 mmol/L、诱导起始浓度为OD 1.0、诱导时间为5 h。最终Cecropin B的表达量可占细胞总蛋白的17.1%。为乳糖作为诱导剂应用于大肠杆菌生产重组家蚕抗菌肽提供了参考依据。     

枯叶蛱蝶非滞成虫与滞育越冬成虫蛋白质含量比较

为了进一步了解枯叶蛱蝶滞育机理,利用比色法,测定了非滞育成虫和越冬成虫不同发育阶段蛋白质含量。结果表明,非滞育成虫蛋白质含量在277．8097~324．1930mg／g之间,整个非滞育成虫期间,蛋白质含量呈下降趋势,差异明显;越冬期间,成虫的蛋白质含量在144．4290-300．9933mg／g之间,含量从1月下旬至2月下旬有较大幅度上升,其余时期差异不大。蛋白质在枯叶蛱蝶不同发育阶段具有不同的代谢特征。     

昆虫滞育诱导中的温周期效应

温周期是指每日的温度循环,它由夜间温度(或低温期)和白天温度(或温期)组成。在全暗条件下,温周期本身通过低温持续期、温周期反应阈值、温周期幅度决定昆虫的滞育发生。在光周期条件下,温周期与光周期的配合方式、温周期幅度会影响昆虫滞育诱导;在有些昆虫中,温周期诱导的滞育个体比恒温诱导的滞育个体表现出更深的滞育强度。     

棉铃虫不同地理种群滞育诱导的光敏感性的比较

为探明棉铃虫(Helicoverpa armigera)滞育诱导的)光敏感性的地理变异,本文系统调查了棉铃虫江西永修种群、山东泰安种群和辽宁喀佐种群幼虫在20℃,交替接受长光周期(L16:D8)和短光周期(L12:D12)下的滞育诱导的光敏感阶段.当用5d长光周期干扰生长在短光周期(L12:D12)背景条件下的幼虫时,最高光敏感期:永修种群出现在4龄第4天至5龄第3天(77.5％～ 93.7％个体发育),泰安种群出现在3龄第5天至5龄第1天(64.06％～ 89.55％个体发育),喀佐种群出现在第6龄(57.69％～60.78％个体发育).当泰安和喀佐种群幼虫分别饲养在交替的短光周期(L12:D12)和长光周期(L16:D8)时,泰安种群幼虫光敏感龄期主要出现在5龄前,而喀佐种群幼虫光敏感龄期主要出现在4龄后.这些结果揭示了棉铃虫滞育诱导的光敏感性存在地理变异.     

高温诱导对家蚕血淋巴的影响

[目的]了解高温诱导对家蚕血细胞数量和血淋巴谷胱甘肽过氧化物酶（GSH—PX）活性的影响。[方法]用姬姆萨染色法对家蚕血细胞进行分类,38．0℃高温诱导四龄家蚕不同时间,分别用计数板计量家蚕血细胞数量变化并检测家蚕幼虫血淋巴中GSH—PX的活性变化。[结果]对照条件下培养的家蚕幼虫血细胞数量随幼虫体重增加有明显的增长,38．0℃高温诱导下的家蚕幼虫血细胞数量增长几乎为零,但血淋巴中GSH-PX活性显著升高。[结论]高温诱导抑制家蚕血细胞的分化和生长,证明昆虫GSH—PX是抵制高温伤害的重要保护酶系。     

外源昆虫激素诱导家蚕卵蛋白形成、积累的初步研究

在雌蚕化蛹当时制成游离腹部,以外源激素诱导卵巢发育,采用SDS—PAGE技术,连续探讨了蛹血液蚕白组份和卵巢蛋白组份的变化。结果表明:游离腹部血液蚕白组份不因注射外源激素(MH或JHA)而改变,只有经注射MH后,血液蛋白组份才向卵巢中转移、积累,卵巢申形成卵特异蛋白。提示MH对家蚕卵黄蛋白发生的调节作用存在合成调节和摄取调节两个过程。由外源昆虫蜕皮激素诱导形成成熟卵的蛋白组份与正常蛹成熟卵蛋白组份相同。     

shRNA下调家蚕细胞系BmCREB的表达

sh RNA(short hairpin RNA)是一种干扰基因表达、研究基因功能的有效方法。CREB(c AMP response element binding protein)是真核生物重要而又保守的转录调控因子,参与许多生理功能的调节。作者前期的研究发现,家蚕CREB(Bm CREB)的表达与家蚕滞育的诱导密切相关。为进一步阐明BmCREB调控家蚕滞育的分子机制,利用p MD18-T质粒构建BmCREB的干扰质粒p MD18-U6-shRNA,转染家蚕卵巢细胞系(BmN),对其下调BmCREB的表达进行研究。结果表明,在BmN细胞系中转染1μg shRNA,72 h后能有效地下调BmCREB蛋白的表达量,最高干扰效率达63.0%。不同干扰片段shRNA质粒的干扰效果差异很大,其中T-227的干扰效果最好。这些结果为进一步利用shRNA方法在家蚕体内下调基因表达,研究BmCREB基因与家蚕滞育的关系奠定基础。     

家蚕Septin基因家族的全基因组鉴定及分析

Septin基因家族存在于除植物外的所有真核生物中,是具有GTPase活性保守基因家族。Septin蛋白功能多样,能够参与细胞分裂、细胞内物质转运、细胞周期调控及细胞凋亡等生理反应,并与肿瘤发生、神经功能障碍和病原物侵染的过程直接相关。利用果蝇的5个Septin基因家族蛋白序列检索家蚕基因组数据库,发现家蚕基因组中存在4个septin基因,其蛋白序列都具有完整的保守结构域;通过与果蝇、酵母等Septin蛋白进行聚类分析,发现该基因家族具有高度保守性,并对家蚕4个septin进行命名为BmPnut、BmSeptin1、BmSeptin2和BmSeptin4;通过查找基因芯片数据库分析了家蚕septin基因家族在各组织的表达模式,4个septin基因在各组织表达量各不相同,为下一步研究家蚕septin基因功能奠定了基础。     

细胞周期蛋白家族基因在家蚕胚胎期的表达分析

【目的】研究家蚕细胞周期蛋白家族基因(CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE、CyclinL1)在滞育卵与即时浸酸处理的滞育卵发育过程中的转录活性,为家蚕胚胎发育及细胞周期调控机制研究提供参考。【方法】以家蚕品种大造为试材,取产后1~8d的滞育卵及产后20h即时浸酸的非滞育卵,提取其RNA反转录成cDNA,采用实时荧光定量PCR方法分析家蚕Cyclin家族基因在胚胎发育过程中的转录水平。【结果】在即时浸酸处理的家蚕非滞育卵中均能检测到Cyclin家族基因的表达,但不同发育阶段Cyclin家族基因表达量差异很大,在发育开始的1~3d,Cyclin家族基因变化显著,说明此期细胞分裂频繁,正处于组织和器官活跃形成时期。在胚胎发育晚期,除CyclinL1外的其他基因表达量都很低,表明此时幼虫器官发育几近完成,因此细胞分裂迟缓。而滞育卵从蛾体产下经过3d后,细胞分化停滞于G2期,Cyclin家族基因也进入沉默状态。【结论】Cyclin家族基因在家蚕胚胎发育过程中具有重要的调控作用。     

Expression and Activity Analysis of Non-Structural Protein 2 （NS2） of Bombyx mori Densovirus Zhenjiang Strain

The gene of the non-structure protein 2 （NS2） was cloned by PCR from the genome ofBombyx mori densovirus Zhenjiang strain （BmDNV-Z）, inserted into prokaryotic expression vector pET28a to construct recombinant plasmid pET28a-NS2 and then expressed in bacteria Escherichia coli BL21 （DE3）. The expressed recombinant protein was identified by SDS-PAGE and Western blot analysis. Then, the recombinant protein was purified by Ni-NTA column, renatured and tested for enzyme activities. The purified NS2 protein exhibited a helicase activity unwinding double-stranded DNA substrates into single-strand primers, and higher unwinding activity to polarity substrate. Similarly, the purified NS2 protein possessed an ATPase activity and its enzyme activity was 0.276 μmol gg^-1 h^-1 in this study. The results indicated that the non- structure protein which encoded by the gene of BmDNV-Z NS2 possesses the biological activities of helicase and ATPase, and the helicase prefers to polarity substrates. Based on these results, it is speculated that the gene of BmDNV-Z NS2 plays an important role in the viral DNA replication.     

家蚕细胞周期蛋白家族基因在5龄幼虫组织中的表达谱分析

【目的】研究家蚕细胞周期蛋白家族基因(CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE、CyclinL1)在丝腺及其他组织中的表达情况,为探讨细胞周期蛋白家族基因在细胞周期中的作用提供参考。【方法】取家蚕5龄3d幼虫的脑、脂肪体、中肠、丝腺、马氏管、精巢、卵巢及血液等组织,用Trizol提取各组织的总RNA并反转录合成cDNA。以Actin3为内参基因,合成的cDNA为模板,利用每个基因的特异性引物进行实时荧光定量PCR,检测细胞周期蛋白家族基因在转录水平上的表达情况。【结果】在丝腺中,CyclinE基因的表达量最高,CyclinA、CyclinL1基因表达较弱,而CyclinB、CyclinB3基因没有表达;在其他组织中,CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinL1基因均在精巢中高表达,而CyclinE基因在脂肪体中表达较高。【结论】CyclinE基因在家蚕丝腺细胞G1/S期起重要作用,CyclinB、CyclinB3基因在G2/M期起作用;CyclinA基因可能参与丝腺染色体的后期复制;CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinL1基因在家蚕精巢中的精母细胞发育形成精子进行分裂时起着重要作用。     

桑叶叶际和家蚕肠道细菌群落结构及功能分析

家蚕是我国重要的经济昆虫,主要以桑叶为食,了解家蚕肠道及所食桑叶叶际微生物对减少家蚕病害具有重要意义。以5龄第3天的家蚕幼虫和所食桑叶为研究对象,利用高通量测序技术对家蚕肠道和叶际细菌的16S rDNA V3-V4区序列进行测序分析。结果表明：桑叶叶际和家蚕肠道各部位细菌的多样性指数（Shannon指数和Simpson指数）无显著差异（P > 0.05）;NMDS分析显示桑叶叶际细菌与家蚕肠道细菌各自聚类,家蚕肠道各部分的细菌菌群无显著差异。桑叶叶际和家蚕肠道中共注释到的主要分类阶元有29 个门、268 个属：前4个优势门为变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和放线菌门（Actinobacteria）;芽孢杆菌属Bacillus为桑叶叶际细菌的最优势属,泛菌属Pantoea为家蚕前肠细菌的最优势属,鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas为家蚕中肠和后肠细菌的最优势属。通过功能预测可知,消化系统、免疫系统、能量代谢、代谢性疾病和传染性疾病在家蚕的前肠、中肠中占比较高,氨基酸代谢、碳水化合物代谢、神经退行性疾病、免疫系统疾病、脂类代谢、其他氨基酸代谢、心血管疾病和核苷酸代谢在家蚕的后肠中占比较高。家蚕肠道细菌群落与叶际细菌群落前4个优势菌门一致;家蚕肠道的前肠和中肠功能菌群相似,与后肠差异较大。     

辛硫磷对家蚕细胞周期蛋白家族基因转录活性的影响

【目的】探讨经辛硫磷诱导后,家蚕细胞周期蛋白家族基因(CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE)在5龄幼虫各种组织中的转录活性,为进一步研究有机磷农药对家蚕的损伤机制提供参考。【方法】采用实时荧光定量PCR方法,以饲喂清水浸泡过的桑叶为对照,分析家蚕5龄3d幼虫喂食辛硫磷(4μg/mL)浸泡桑叶24h后,脑、脂肪体、中肠、丝腺、马氏管、精巢及卵巢等7种组织中4种细胞周期蛋白家族基因的转录水平。【结果】与对照组相比,辛硫磷诱导24h后,CyclinA、CyclinB、CyclinB3在各组织中均表达上调,CyclinE在中肠及脂肪体中表达显著下调,在精巢与马氏管中无明显变化,在其他组织中则表达上调。【结论】辛硫磷诱导24h后,家蚕组织中CyclinA、CyclinB及CyclinB3基因表达上调,这可能是家蚕对磷胁迫的响应;CyclinE在中肠及脂肪体中表达显著下调,这与这2种器官是家蚕重要的解毒代谢器官有关。     

辛基酚对家蚕（Bombyx mori L.）生长发育的影响

为探讨辛基酚对鳞翅目模式昆虫家蚕生长发育的影响,使用添加0.01～0.08 g·kg~(-1)辛基酚(4-tert-octylphenol,4-t-OP)的人工饲料饲养家蚕(Bombyx mori L.),研究了4-t-OP对家蚕幼虫和蛹的生长发育速度、生长量、发育整齐度和生命力等影响。结果表明:连续取食0.01 g·kg~(-1)以上浓度4-t-OP的饲料,家蚕幼虫和蛹的生长发育速度(幼虫期和蛹期发育经过时间)、生长量(幼虫期体质量和蛹期茧层量)、生命力(3龄起蚕绝食生命时数、4龄起蚕结茧率、蚕茧的死笼率和羽化率)等都明显下降,抑制眠蚕体质量。4-t-OP对家蚕幼虫生长发育后期、化蛹及羽化等发育变态期的影响更加明显,其在家蚕体内可能有累积效应。添食0.08 g·kg~(-1)4-t-OP的家蚕不能完成生活史。研究表明,4-t-OP对家蚕生长发育毒性影响有显著的浓度效应和时间效应。     

近红外漫透射光谱快速无损鉴别家蚕种茧茧壳内蚕蛹雌雄

【目的】利用近红外漫透射光谱快速无损鉴别家蚕Bombyx mori种茧茧壳内蚕蛹的雌雄,以提高育种效率、降低人工成本。【方法】以芙9、9芙、湘7和7湘4个蚕品种为研究对象,采集比较了样本在可见和近红外区间的漫透射光谱,建立比较了各品种偏最小二乘判别分析(PLSDA)、后向传播神经网络(BPNN)以及支持向量机分类(SVM)判别模型,通过分类器特性(ROC)曲线研究了各模型的鲁棒性,采用差值法和遗传算法提取了特征波长。【结果】芙9、9芙、湘7和7湘品种利用450~900 nm光谱建模的雌雄鉴别准确率分别为95.20%、95.65%、88.80%和87.50%,利用900~1 700 nm光谱建模的准确率分别为100%、96.00%、92.22%和94.21%;采用PLSDA、BPNN和SVM模型都能够对蚕蛹雌雄做出较好的无损鉴别,3种模型真雌性率分别为95.96%、95.83%和100%,真雄性率分别为98.98%、96.04%和82.18%,准确率分别为97.46%、95.94%和90.86%,进一步通过ROC曲线分析,PLSDA模型效果最优,BPNN模型次之;手动提取20个波段建立PLSDA模型,鉴别真雌性率为93.75%,真雄性率为95.45%,准确率为94.57%。【结论】近红外波段900~1 700 nm的漫透射光谱比可见–近红外波段450~950 nm含有更丰富的蚕蛹雌雄分类信息;3种鉴别模型中,PLSDA模型效果最优;提取特征波段后,准确率能达到生产需要。     

僵蚕乙醇提取物对HearNPV的增效作用研究

【目的】利用僵蚕乙醇提取物作为棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV)的生物增效剂,研究其对棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV)毒力的增效作用与内在机制。【方法】以棉铃虫3龄幼虫为标靶试虫,在HearNPV中添加0~80μg/mL僵蚕乙醇提取物,研究其对HearNPV的增效作用,并通过僵蚕乙醇提取物对试虫ALP活性的影响探讨其增效作用机理。【结果】僵蚕乙醇提取物对HearNPV具有显著的增效作用,能够显著提高病毒的毒力,40μg/mL的剂量水平就能够使病毒感染的3龄棉铃虫在第6天达到90%的死亡率、第7天达到100%的死亡率。剂量80μg/mL的僵蚕乙醇提取物能够显著缩短棉铃虫3龄试虫的LT50和LT90值,其LT50和LT90分别较对照缩短23.2%和27.8%。同时,在HearNPV中添加僵蚕乙醇提取物可以显著降低试虫中肠的ALP活性,僵蚕乙醇提取物的使用剂量达到40μg/mL以上时,试虫中肠ALP活性较对照显著下降,且差异随感染时间的延长进一步增大。【结论】僵蚕可以作为病毒增效剂新材料,其在克服传统杆状病毒制剂杀虫速度慢的缺陷方面具有极好的发展前景。