高浓度氧处理法阻断蚕卵滞育

【目的】比较高浓度氧处理法(高氧法)与传统HCl处理法(HCl法)阻断蚕卵滞育效果的差异,探讨高氧法阻断滞育在家蚕Bombyx mori转基因技术体系上的应用。【方法】采用高氧法和HCl法在产后20 h处理二化性蚕品种‘大造’,比较孵化率、孵化时间,调查高氧法的最佳处理条件;将高氧法应用于一化性蚕品种‘土耳其’和转基因二化性蚕品种‘大造’,调查其对一化性蚕品种蚕卵阻断滞育效果及转基因二化性蚕品种显微注射后蚕卵阻断滞育效果。【结果】高氧法对二化性蚕卵在孵化率、孵化时间上都与HCl法有相近的阻断滞育的效果,其最佳条件为产卵后20 h用体积分数为70%的O2处理40 h;该方法也能成功阻断一化性蚕品种,孵化率达(71±20)%;高氧法处理的显微注射转基因家蚕卵孵化率达到了(49±9)%,而对照组的孵化率为0。【结论】高氧法为今后生产上替代HCl法,采用安全环保的蚕卵阻断滞育技术,解决转基因蚕卵阻断滞育和提高转基因家蚕育种进度的关键问题提供了可行的新方法。     

家蚕己糖激酶基因进化分析及其多转录本在胚胎早期发育过程中的表达特性

【目的】明确家蚕（Bombyx mori）二化性品系胚胎早期发育过程中己糖激酶基因（BmHK）不同转录本的表达特性,为深入探究BmHK基因各转录本的生物学功能及揭示其在家蚕胚胎早期发育中的作用机制提供理论依据。【方法】从NCBI检索并下载家蚕等12种昆虫的HK氨基酸序列,采用MEGA 7.0的邻接法（NJ）构建基于HK氨基酸序列相似性的系统发育进化树。以家蚕二化性品系秋丰活化越年蚕卵（丙2胚胎）为材料,分别制备非滞育命运卵（ND）、滞育命运卵（DD）和即时浸酸卵（IA）,采用实时荧光定量PCR检测BmHK基因各转录本在家蚕二化性品系胚胎早期发育过程中的表达特性。【结果】BmHK基因属于HSP70-actin家族,存在4个不同的转录本,其长度分别为4610、4608、2818和1520 bp,依次命名为BmHK-a、BmHK-b、BmHK-c和BmHK-d。BmHK-a在3种蚕卵胚胎早期发育过程中整体上呈先升高后降低的变化趋势,且各时间点均表现为IA蚕卵>ND蚕卵>DD蚕卵,IA蚕卵中的BmHK-a相对表达量于发育2 h达峰值,在ND蚕卵和DD蚕卵中于发育48 h达峰值,此后其表达快速下调,至发育96 h均处于较低水平;BmHK-b在3种蚕卵中的表达水平整体上表现为IA蚕卵>ND蚕卵>DD蚕卵,3种蚕卵中的BmHK-b相对表达量变化趋势基本一致,均随发育时间推移呈逐渐上升趋势;BmHK-c在3种蚕卵中的表达差异明显,初产蚕卵中已有较高的表达水平,受精后迅速升高,至发育72 h后BmHK-c在3种蚕卵中的相对表达量再次升高;BmHK-d在3种蚕卵中的相对表达量整体上呈先升高后降低的变化趋势,且各时间点均表现为ND蚕卵>IA蚕卵>DD蚕卵,但IA蚕卵中BmHK-d表达峰值出现的时间早于DD蚕卵和ND蚕卵。【结论】BmHK-a和BmHK-d主要在家蚕胚胎早期发育（产卵或浸酸后3 d）过程中发挥重要作用;BmHK-b虽然也参与家蚕胚胎早期发育过程,但不是主要的糖代谢相关酶;BmHK-c与家蚕胚胎早期发育关系密切,通过糖酵解为胚胎发育提供能量。     

用于家蚕转基因的二化性品种蚕卵的预处理研究

从二化性品种获得优质的非滞育蚕卵作为显微注射受体,一直是家蚕转基因技术中亟待解决的问题之一. 目前家蚕转基因技术中非滞育蚕卵主要是通过完全低温暗催青、早浸酸2种方法得到,但这2种方法分别存在催青 时间长、浸酸时间难以把握的局限.对完全低温暗催青技术进行了改进,即在家蚕胚胎发育至温度敏感的缩短期 (戊3 期)后再对蚕卵低温黑暗处理直至孵化,结果表明:后期低暗组能有效地获得非滞育蚕卵并且较完全低暗组催 青时间缩短3~4天.并进一步分析了后期低暗组、完全低暗组以及早浸酸组3种处理得到的非滞育卵的健康性, 结果表明后期低暗组和完全低暗组健康性差异不大,均明显优于早浸酸组;后期低温暗催青在蚕卵孵化所需时间 上具有明显的优势,且获得的非滞育卵健康性亦可得到保证,有望成为人们获得非滞育卵的一条有效途径.     

家蚕浸酸活化滞育卵早期胚胎发育的难溶性蛋白质差异表达分析

【目的】用盐酸刺激活化家蚕滞育卵的孵化,是蚕种生产长期沿用的一项人工孵化技术,但盐酸能活化滞育卵的机制却有许多未明之处,为此,从蛋白质组学的角度探讨盐酸对蚕卵滞育解除的作用关系。【方法】用双向电泳技术和电喷雾串联质谱技术,比较分析冷藏45 d的滞育卵浸酸前后的难溶性卵蛋白的差异表达。【结果】根据双向电泳图谱分析,在浸酸前的图谱中共检测到296个蛋白点,浸酸后的检测到302个蛋白点,两者相匹配的蛋白斑点有265个,匹配率为88.6％。特异性的蛋白点,浸酸前有31个,浸酸后有37个。对浸酸前存在、经浸酸处理后消失的2个特异性差异的高丰度蛋白点用电喷雾串联质谱技术作分析,NO.1蛋白序列与浆膜蛋白（chorion protein [Bombyx mori]）有55个氨基酸的肽段相匹配,NO.2蛋白序列与热激蛋白（heat shock protein hsp 19.9 [Bombyx mori]）只有15个氨基酸的肽段相匹配,推测是一种未知蛋白。【结论】滞育性蚕卵经浸酸后,难溶性卵蛋白有差异表达,浸酸前后的一些蛋白种类或分子量发生了变化。     

HCl和DMSO阻断滞育条件下桑蚕卵壳电镜观察

【目的】探讨桑蚕Bombyx mori滞育阻断机理,比较HCl、二甲基亚砜(DMSO)法阻断蚕卵滞育后卵壳表面发生的一系列变化。【方法】用HCl和DMSO分别在产后20和12 h处理蚕卵,利用扫描电镜观察卵壳表面及气孔在处理后不同时间点的变化。【结果】HCl和DMSO处理均能成功地阻断蚕卵滞育的发生,蚕卵平均孵化率分别为93.37%和87.81%。扫描电镜观察HCl和DMSO处理的卵壳表面蚀刻效果明显,均出现了“脂质”脱落物;并且处理后蚕卵的气孔有逐步增大的趋势,与DMSO处理相比较,HCl处理获得的现象更为明显。【结论】卵壳表面变化可能与桑蚕滞育的阻断有关。     

细胞周期蛋白家族基因在家蚕胚胎期的表达分析

【目的】研究家蚕细胞周期蛋白家族基因(CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE、CyclinL1)在滞育卵与即时浸酸处理的滞育卵发育过程中的转录活性,为家蚕胚胎发育及细胞周期调控机制研究提供参考。【方法】以家蚕品种大造为试材,取产后1~8d的滞育卵及产后20h即时浸酸的非滞育卵,提取其RNA反转录成cDNA,采用实时荧光定量PCR方法分析家蚕Cyclin家族基因在胚胎发育过程中的转录水平。【结果】在即时浸酸处理的家蚕非滞育卵中均能检测到Cyclin家族基因的表达,但不同发育阶段Cyclin家族基因表达量差异很大,在发育开始的1~3d,Cyclin家族基因变化显著,说明此期细胞分裂频繁,正处于组织和器官活跃形成时期。在胚胎发育晚期,除CyclinL1外的其他基因表达量都很低,表明此时幼虫器官发育几近完成,因此细胞分裂迟缓。而滞育卵从蛾体产下经过3d后,细胞分化停滞于G2期,Cyclin家族基因也进入沉默状态。【结论】Cyclin家族基因在家蚕胚胎发育过程中具有重要的调控作用。     

家蚕bHLH转录因子Bmdimm与Bmchip的相互作用

【目的】bHLH转录因子Bmdimm是家蚕（Bombyx mori）5龄后期调控蚕丝蛋白丝素重链基因表达的重要转录因子。分析发现Bmdimm蛋白中包含有可能发生泛素化修饰的赖氨酸残基K43,因此推测Bmdimm可能发生泛素化修饰而被降解。Bmchip属于家蚕泛素连接酶E3家族中的U-box亚家族,在家蚕5龄期后部丝腺中有表达。论文旨在明确Bmdimm与Bmchip之间的相互作用,以便于更好地理解Bmdimm在家蚕体内的泛素化修饰及其对丝素重链基因转录调控的生物学意义。【方法】利用家蚕各组织基因芯片表达谱分析Bmdimm和Bmchip在后部丝腺中的表达情况;分别通过PCR和基因合成获得Bmdimm和Bmchip的CDS序列,将其构建到不同的原核表达载体并转化大肠杆菌表达目的蛋白,筛选最优的表达条件;利用镍柱亲和层析纯化融合蛋白,加入蛋白酶酶切,并再次通过镍柱亲和层析去除融合标签,纯化Bmdimm和Bmchip蛋白;利用凝胶过滤层析分析Bmdimm和Bmchip在溶液中的聚集状态;利用圆二色光谱研究Bmdimm和Bmchip蛋白的二级结构;利用Far-western blotting和Pull-down研究Bmdimm和Bmchip在体外的相互作用;利用微量热泳动研究Bmdimm和Bmchip结合的亲和力。【结果】基因芯片表达谱揭示Bmdimm和Bmchip在家蚕5龄期后部丝腺中都有表达。构建了Bmdimm和Bmchip多种表达载体,发现ppSUMO-Bmdimm和pET-32M·3C-Bmchip表达载体在16℃,0.3 mmol·L^-1 IPTG诱导下表达最好,并以此为基础表达纯化了Bmdimm和Bmchip蛋白;凝胶过滤分析表明Bmdimm和Bmchip蛋白在溶液中主要以二聚体的形式存在;圆二色光谱显示Bmdimm和Bmchip蛋白都含有α-螺旋结构; Far-western blotting和Pull-down结果表明Bmdimm和Bmchip可以在体外结合;利用微量热泳动实验计算出Bmdimm和Bmchip结合的平衡解离常数为(750±28.6)μmol·L^-1。【结论】家蚕bHLH转录因子Bmdimm和泛素连接酶Bmchip在家蚕5龄期后部丝腺中均有表达,二者可以在体外发生瞬时相互作用,暗示了Bmdimm可能通过Bmchip介导发生泛素化修饰从而下调丝素重链基因的转录。     

温度对家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）孢子体外发芽的影响

【目的】调查温度对家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）孢子体外发芽的影响,为家蚕微粒子病的防治及其他微孢子虫的基础研究提供参考依据。【方法】以K2CO3-KHCO3法诱导孢子体外发芽,在孢子发芽过程中利用不同温度（5、15、25和35℃）在不同时期处理家蚕微孢子虫孢子,观察不同处理的孢子发芽率。【结果】在前期4个温度处理的家蚕微孢子虫孢子发芽率分别为3.88%、15.66%、31.91%和58.75%,孢子发芽率随着温度的升高而增大;在刺激期4个温度处理的孢子发芽率依次为53.33%、38.17%、25.07%和6.08%,孢子发芽率随着温度的升高而减小;在培育期4个温度处理的孢子发芽率分别是44.63%、41.29%、43.53%和48.82%,无显著差异。【结论】温度对家蚕微孢子虫孢子体外发芽具有一定的影响,在家蚕微孢子虫孢子体外发芽过程中,前期低温和刺激期高温能抑制孢子发芽,而前期高温和刺激期低温能促进孢子发芽。     

温度对家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）

【目的】调查温度对家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）孢子体外发芽的影响,为家蚕微粒子病的防治及其他微孢子虫的基础研究提供参考依据。【方法】以K2CO3-KHCO3法诱导孢子体外发芽,在孢子发芽过程中利用不同温度（5、15、25和35℃）在不同时期处理家蚕微孢子虫孢子,观察不同处理的孢子发芽率。【结果】在前期4个温度处理的家蚕微孢子虫孢子发芽率分别为3.88%、15.66%、31.91%和58.75%,孢子发芽率随着温度的升高而增大;在刺激期4个温度处理的孢子发芽率依次为53.33%、38.17%、25.07%和6.08%,孢子发芽率随着温度的升高而减小;在培育期4个温度处理的孢子发芽率分别是44.63%、41.29%、43.53%和48.82%,无显著差异。【结论】温度对家蚕微孢子虫孢子体外发芽具有一定的影响,在家蚕微孢子虫孢子体外发芽过程中,前期低温和刺激期高温能抑制孢子发芽,而前期高温和刺激期低温能促进孢子发芽。     

用荧光定量RT-PCR方法分析B型和ZHJ-1型烟粉虱热休克基因hsp70和hsp90的表达

【目的】比较温度胁迫对两种生物型烟粉虱体内hsps诱导表达的差异。【方法】根据烟粉虱hsp70基因、hsp90基因和18S rRNA序列,设计并合成引物用于实时定量RT-PCR,扩增产物连接到质粒pMD18-T载体上,重组质粒经筛选、签定和10×梯度稀释后作为模板,用于标准曲线的制作和样品检测,检测温度胁迫对B型和ZHJ-1型烟粉虱hsp70和hsp90 mRNA转录水平的诱导情况。【结果】在受到34℃、37℃、40℃和43℃的高温胁迫时,两者hsps的诱导水平无显著差异(P＞0.05);在受到4℃、7℃、10℃和13℃的低温胁迫时,B型烟粉虱体内hsps的诱导表达水平显著超过了ZHJ-1型烟粉虱(P＜0.05)。【结论】经检验所建立的荧光定量RT-PCR体系特异性好,灵敏度高,符合检测烟粉虱hsps mRNA转录水平的要求。低温胁迫下B型烟粉虱体内hsps的高表达可能是其较强的耐受低温能力的主要机制之一。     

青稞转录因子HvnANT1基因的克隆与表达分析

为探究HvnANT1基因在青稞粒色形成过程中的基因表达模式,以紫粒青稞‘涅如姆扎’和白粒青稞‘昆仑10号’为试材,利用简化基因组GBS(Genotyping-by-Sequencing)对青稞紫粒进行基因定位,克隆到HvnANT1基因,对其进行生物信息学分析。结果表明：1）在7H染色体的84.30—86.00cM获得1个MYB类转录因子,命名为HvnANT1。2）该基因长1 033bp,其完整开放阅读框为762bp,编码253个氨基酸。HvnANT1蛋白分子量为27.14kU,是亲水性的不稳定碱性蛋白且不存在跨膜结构,无信号肽。该蛋白的二级结构主要是由无规卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成,具有2个SANT结构域（分别位于第13—第63个;第66—第114个氨基酸）。3）同源比对与系统进化分析表明：青稞HvnANT1蛋白与大麦、乌拉尔图小麦、高梁、玉米、二型花、小米、水稻、土瓶草、车轴草和杨梅10种植物的ANT1蛋白序列相似性分别为100.00%、88.85%、54.64%、60.95%、60.82%、58.46%、57.61%、37.76%、36.05%和36.33%;这些序列都具...     

乌梅等20种中药对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性研究

【目的】观察乌梅Fructus mume等20种中药的体外抗胸膜肺炎放线杆菌Actinobacillus pleuropneumoniae活性.【方法】通过乙醇回流、水煎煮和超声波等方法对20种中药进行提取,采用二倍稀释法测定其对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性;并研究抗菌活性较强的几味中药的体外联合抑菌活性.【结果和结论】乌梅、黄连Rhizoma coptidis、诃子Terminalia chebula、秦皮Cortex fraxini、地榆Sanguisorbae officinalis、虎杖Polygonum cuspidatum 6种中药提取物对胸膜肺炎放线杆菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC)范围是6.25~50.00 mg/mL;大青叶Isatis indigotica、茵陈Artemisia capillaris、甘草Glycyrrhiza uralensis和白鲜皮Dictamnus dasycarpus 4种中药提取物的MIC范围是50.00~100.00 mg/mL;黄柏Phellodendron amurense、杜仲Eucommia ulmoides、金银花Lonicera japonica、柴胡Bupleurum chinense、蒲公英Taraxacum mongolicum、板蓝根Baphicacanthus cusia、栀子Gardenia jasminoides和黄芪Astragalus membranaceus等10种中药提取物的MIC100.00 mg/mL.联合抑菌试验结果表明,乌梅、黄连、诃子和虎杖两两联合抑菌指数(FICI)≤1,乌梅、虎杖分别与秦皮的FICI2.乌梅、黄连、诃子、虎杖、秦皮、地榆对胸膜肺炎放线杆菌均具有较好的体外抗菌活性;乌梅、黄连、诃子和虎杖两两联合为相加、协同作用;秦皮分别与乌梅、虎杖为拮抗作用.     

4种蝴蝶雄性生殖系统形态学研究

【目的】明确4种蝴蝶雄性生殖系统的形态学结构。【方法】将新鲜标本剪下腹部,在Motic SMZ168-BL型显微镜下观察解剖,用Q Imaging Retiga 2000R(CCD)显微成像系统照相,采用Montage图像叠加软件进行图像处理。【结果】描述了4种蝴蝶的雄性生殖系统,其中外生殖器的差异主要表现在囊形突、钩突、背兜、阳基轭片等上,而内生殖器的主要差异表现在精巢、复射精管、单射精管及附腺上。【结论】4种蝴蝶雄性生殖系统的各部分结构特征存在较大差异。     

岚皋魔芋软腐病病原细菌生物多样性研究

【目的】研究岚皋魔芋软腐病病原细菌生物多样性。【方法】采用组织分离法分离纯化魔芋软腐病球茎及叶柄中的致病菌,通过魔芋球茎、胡萝卜及马铃薯块的侵染试验初步确定其致病性,再利用魔芋球茎侵染致病及盆栽致病性试验确认其致病性;经菌落与细胞形态、生理生化特性及16SrRNA序列测定确定病原菌的类型。【结果】从魔芋软腐病球茎及叶柄中共分离获得16株细菌,侵染试验表明,其中CDS1-B1、CDS1-B2、CDS2-B1、CDS2-B2、CZS-B4和CZS-B6共6株细菌可使魔芋球茎表现软腐症状,并导致盆栽魔芋发病;6株细菌的菌落与细胞形态均存在差异;在魔芋、胡萝卜及马铃薯块上的侵染能力不同;16SrRNA序列分析表明,菌株CDS1-B1、CDS1-B2、CDS2-B1及CDS2-B2均与菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)亲缘关系最近,菌株CZS-B4与菊欧文氏菌(Dickeya dadantii)亲缘关系最近,相似度为98.8%,菌株CZS-B6与菊果胶杆菌(Pectobacterium chrysanthemi)的相似度达99.9%。【结论】导致岚皋县魔芋软腐病的致病细菌存在生物多样性,其致病性也存在差异,其中新发现的魔芋软腐病原菌菊果胶杆菌(Pecto-bacterium chrysanthemi)致病性最强,菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)和菊欧文氏菌(Dickeya dadantii)致病性较弱。     

摘除眼柄与注射眼柄粗提物对凡纳滨对虾性腺发育相关基因表达的影响

利用荧光定量PCR技术,检测了眼柄粗提物对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)性腺发育相关基因(DMC1、VASA和VTG)表达的影响,探讨性腺抑制激素(GIH)在性腺发育过程中的调控机制,结果表明:DMC1和VASA只在凡纳滨对虾精巢和卵巢中表达;摘除眼柄后,精巢和卵巢中DMC1表达量均显著性降低(P0.05),而注射眼柄粗提物后精巢和卵巢中DMC1表达显著增高(P0.05);相反,摘除眼柄后,精巢和卵巢中VASA以及卵巢中VTG基因表达量显著增高,但注射眼柄粗提物后性腺中的VASA和卵巢中的VTG表达量显著降低。结果表明眼柄粗提物通过影响生殖相关基因的表达影响凡纳滨对虾的性腺发育。     

细粒棘球蚴重组St-Eg 95-Eg.ferritin疫苗构建及生物学特性检测

构建表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白的重组口服减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株并评价其生物学特性。将细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合基因插入到表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-Eg95-Eg.ferritin,将重组质粒分别电转入减毒鼠伤寒沙门菌X3770和X4550,获得重组疫苗菌株St-Eg95-Eg.ferritin,对重组菌的稳定性、生长状态及安全性进行分析。结果表明,经PCR和酶切鉴定成功构建重组质粒pYA3341-Eg95-Eg.ferritin,Western blot检测Eg95-Eg.ferritin蛋白在重组菌中获得表达;生物学特性研究结果表明,重组质粒可稳定存在,且不影响重组菌的生长状态,小鼠口服试验证实,重组菌安全无毒性。成功构建能稳定表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株,将为研究包虫病口服基因工程疫苗奠定基础。     

四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1与ESBLs基因共转移分析

为了解四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1耐药基因流行情况,及其与超广谱β-内酰胺酶基因(ESBLs)共存和共转移的特征,采用微量肉汤稀释法检测菌株对不同抗菌药物的敏感性;采用PCR检测菌株mcr-1,以及mcr-1阳性菌株中ESBLs基因类型;采用质粒接合转移试验分析了mcr-1与ESBLs基因共转移的耐药机制。结果显示:190株大肠杆菌的mcr-1检出率为36.84%,75.71% mcr-1阳性菌株中同时检出ESBLs基因,主要以blaTEM-1、blaCTX-M-55和blaCTX-M-14为优势基因;mcr-1阳性菌对氨曲南(ATM)、头孢噻肟(CTX)和多黏菌素E(COL)耐药率极显著高于mcr-1阴性菌(P<0.01);质粒转移率为47.14%,其中获得mcr-1和ESBLs基因共转移的接合子表现出与供体菌相同的耐药表型及耐药基因。综上,在四川省食品动物源大肠杆菌中,mcr-1与ESBLs基因共存现象广泛存在,且耐药基因易发生水平传播,对菌株多重耐药性的产生具有重要意义。     

绣线菊内生真菌的分离及对植物病原菌的抑制作用

采用组织分离法,以PDA培养基为分离培养基,从绣线菊的根、茎和叶中分离获得39株内生真菌。平板对峙结果表明, 21株活性菌株对6种植物病原菌（辣椒疫霉病原菌、番茄枯萎病原菌、苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、葡萄灰霉病原菌、小麦赤霉病原菌）有不同程度的抑制作用,其中菌株XXT10对苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、番茄枯萎病原菌、小麦赤霉病原菌的抑制率分别达到73.2%、72.5%、39.5%和42.7%。通过测得的ITS rDNA 序列与GenBank数据库中已知序列比对后该菌为链格孢属菌。生物学特性试验表明,该菌株在28～32℃时,选择PDA培养基,分别以乳糖和蛋白胨作为碳、氮源,酸碱度中性的条件下,菌落的生长状况最佳。     

扩展莫尼茨绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin部分片段克隆及不同体节mRNA转录水平分析

旨在初步了解丝氨酸蛋白酶抑制剂基因在扩展莫尼茨绦虫生长发育中的作用。采用分子克隆获得扩展莫尼茨绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin基因部分片段,应用MEGA软件对其进行进化分析。同时以beta-Tubulin基因作为内参基因,采用SYBR Green real-time RT-PCR技术检测该基因在扩展莫尼茨绦虫4个不同发育阶段即头节、幼节、成节、孕节中的表达差异,最终克隆获得749bp的serpin基因片段。进化分析表明,扩展莫尼茨绦虫serpin基因与多方棘球蚴serpin基因有较近的亲缘关系。标准曲线分析显示,serpin和beta-Tubulin基因的Ct值与阳性质粒的浓度均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.99,熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,具有较高的特异性。同时试验结果显示,serpin基因在虫体各发育阶段中的表达丰度存在差异,从高到低依次为孕节、头节、成节、幼节。由此初步推测,此基因可能在扩展莫尼茨绦虫虫卵发育为六钩蚴的过程中发挥一定作用。     

小立碗藓PpLBD20基因敲除载体的构建及功能研究

LBD(Lateral organ boundaries domain)是植物中特有的基因家族.前期研究发现灰霉菌处理小立碗藓导致配子体中的PpLBD20上调表达,但PpLBD20的功能尚不明确.因此提取小立碗藓DNA,PCR扩增PpLBD20基因的上下游片段,依次插入PTN182载体,利用同源重组原理构建敲除表达载体,酶切和测序验证插入序列的正确性.通过工作浓度为20％的PGE 6000介导小立碗藓原生质体转化,筛选鉴定得到敲除PpLBD20后的突变体植株,观察到敲除后小立碗藓不形成茎叶体结构且配子体成丝状.结果为深入探究PpLBD20在小立碗藓的形态建成调控病原菌侵染的抗性作用奠定基础.