RT-PCR检测Taura综合症病毒方法改进及应用

Taura综合征病毒是世界动物卫生组织（OZE）目录规定的水生动物二类疫病痛原体。在对上海口岸进境的鲜活虾产品TSV疫情监测过程中．通过改进样品RNA抽提方法及设计新的PCR引物，提高了TSV的阳性检出率。     

鸭黄病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

根据鸭黄病毒E蛋白基因序列设计了1对特异性引物和TaqMan探针,建立了实时荧光定量RT-PCR检测鸭黄病毒的方法.根据舍鸭黄病毒目的扩增片段的质粒拷贝数与定量反应Ct值的关系,绘制了标准曲线(y=-3.39 X+43.18,r=0.973).该方法具有特异性,对鸭病毒性肝炎病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、腺病毒、鸭瘟病毒、猪乙脑病毒的核酸都没有扩增反应.敏感性试验显示,建立的此方法最低可检出1.9个TCID50病毒核酸.该方法对5只健康雏鸭人工感染86 h后的组织器官样品(盲肠扁桃体除外)的检测结果均为阳性,与病毒分离鉴定的阳性符合率为100％.结果表明,该方法真实可靠,而且从核酸提取到报告检测结果耗时不超过3h,为鸭黄病毒病提供了一种敏感特异的定量检测方法.     

塞内卡病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立塞内卡病毒(SVA)荧光定量RT-PCR(FQ-PCR)检测方法,本研究根据GenBank中SVA 3D基因保守区域序列设计了一对特异性引物和一条特异性探针,以SVA cDNA为模板,经优化反应条件,建立了SVA FQ-PCR检测方法,并对其进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法对28份临床疑似SVA感染样品进行了检测,并与本实验室建立的SVA RT-PCR方法检测结果及测序结果比较分析。结果显示,该方法仅对SVA出现阳性扩增信号,对BHK-21正常细胞对照和口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒Ⅱ型、猪伪狂犬病毒等5种病原均未出现扩增,特异性较强;该方法最低检测限为10.4拷贝/μL质粒标准品,比常规RT-PCR敏感性高10倍,敏感性较高;该方法批内及批间变异系数均小于4%,重复性好。利用该方法对28份疑似SVA感染样品检测显示,检出9份阳性样品,与测序结果一致,而常规RT-PCR仅检出6份阳性样品,其敏感性高于常规RT-PCR方法,两种方法的符合率为89.3%。本研究为SVA的早期检测提供了特异、敏感、快速的方法。     

禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为满足禽流感病毒高通量快速检测的需要,建立了一种能够检测各亚型禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性和灵敏度进行评估,使用该方法与农业行业标准NY/T772—2013中的禽流感病毒RT-PCR方法同时进行临床样品检测。结果显示,该方法检测耗时短、特异性好,检测下限达10-4 ng/μL,与传统的RT-PCR方法阳性符合率为100%。结果表明,本方法能实现对禽流感病毒的安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量检测,从而弥补了现有传统检测技术的不足。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Taq Man-MGB荧光定量RT-PCR方法的建立和应用

本研究设计针对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF7基因的特异性引物和TaqMan荧光探针，建立了一种检测PRRSV的快速、敏感、特异和重复性好的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。该方法在检测10^1拷贝／μL～10^7拷贝／μL模板范围内具有良好的线性关系，比常规RT—PCR更敏感，可分别检测最少为10拷贝的阳性标准品和1TCID。病毒。用建立的方法检测高致病性变异株HuN4第5代和第65代体外传代细胞毒人工感染6周龄～7周龄仔猪后的0h、3h、5h、7h、10h、14h、21h血清样品，以及HuN4第5代病毒攻击仔猪21d后迫杀的猪的脑、心、肝、脾、肺、肾和淋巴结等组织样品病毒含量，结果发现HuN4第5代病毒感染仔猪3d后在血液中迅速复制，并在感染后7d血清病毒含量达到最高峰，接近10^10拷贝／mL。攻毒21d后，上述内脏组织中肺脏含毒量最多，接近10^9拷贝／g。HuN4第65代病毒在人工感染猪后21d的血清病毒含量最高，达到10^6拷贝／mL血清。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

本研究根据PRRSV GL膜蛋白基因和CSFV多聚蛋白基因,分别设计2对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果表明,该方法只对猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒特异性良好,不与非洲猪瘟、猪圆环病毒Ⅱ型、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒等常发猪病存在交叉反应;PRRSV和CSFV的检出下限分别为1.41拷贝/μL和1.6拷贝/μL;组内和组间Ct值变异系数都小于1.3%。对175份临床采集的样品检测,PRRSV单一阳性样品27份,CSFV单一阳性样品16份,检测双阳性样品24份。本方法敏感高、特异强,可以用于猪场的快速检测与诊断。     

荧光定量RT-PCR检测禽白血病病毒方法的建立及应用

gag基因是禽白血病病毒(ALV)的群特异性基因,根据GenBank中登录的gag基因的保守序列(E46390),设计合成了1对引物,建立了基于SYBR GreenI模式的检测禽白血病病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。该方法只对目的基因有扩增,对其它无关病毒核酸无特异性扩增;扩增效率为94.6%;在8.2×102～8.2×107拷贝的范围内有很好的线性关系(Y=3.46X+31.8,r=0.9995);最低可检测82个拷贝的病毒核酸,与普通PCR方法相比,灵敏度高出1000倍。组内CV为0.28%～1.45%;组间CV为2.13%～3.84%;对151例临床疑似样本的检出率为54.9%(83/151)。随机选择15份阳性样本PCR产物克隆测序,结果证明扩增片断为ALV的特异序列,与ALVgag基因核苷酸同源性为97.8～98.9%;对重庆14个县的14个健康商品蛋鸡群的134份粪便棉拭子进行检测,ALV的检出率为38.1%,鸡群的阳性率为14/14。同时用实时RT-PCR方法和ELISA方法对从种鸡场随机采集的30份100日龄蛋鸡的血清进行检测,实时RT-PCR检测率为5/30,ELISA方法检测率为4/30。本方法的建立为禽白血病的快速诊断、大规模检疫、监测、流行病学调查以及药物筛选等提供了新的检测方法。     

猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立和初步应用

根据GenBank公布的猪瘟病毒基因组5′非编码区基因序列进行同源性比较分析,选择保守序列区作为扩增区域,设计1对特异性扩增引物,通过优化反应条件,建立了一个用于猪瘟病毒快速定量检测的SYBR Green Ⅰ 荧光定量RT-PCR方法。试验结果表明该方法重复性好,反应批内循环阈值差异不显著。与猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型等猪源病毒无交叉反应,具有高度的特异性,而且灵敏度高,最小检出量为2×102病毒基因组拷贝数。利用此方法对15例临床样本进行检测,其结果与兔体交叉免疫试验一致,表明此方法可作为猪瘟实验室快速诊断和疫情监测的一种快速、准确、简便的检测工具。     

鸭坦布苏病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank已发表的鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV）基因组（登录号：JX273153）保守基因序列,设计了1对特异性引物及TaqMan探针,以DTMUV重组质粒为阳性标准品模板,建立了快速、准确检测DTMUV的荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法特异性好,仅能在DTMUV样本中检出荧光信号,与其他病原不发生交叉反应;敏感性高,最低检测限可达25 copies/μL;不同梯度定量模板的拷贝数的对数值与CT值之间的线性关系表达式为Ct=–3.323×Lg（conc）+43.70,相关系数R2＝0.997,扩增效率E＝100%,DNA在2.5×101～2.5×107个拷贝数内检测曲线有良好的线性关系。对来源于江苏省和安徽省的29份疑似鸭坦布苏病毒感染的病鸭组织进行荧光定量RT-PCR检测,结果有27份呈现阳性,阳性检出率为93.10%,比常规RT-PCR的敏感性高。研究结果表明,该方法快速、灵敏、特异、重复性好且能实时定量检测,可用于DTMUV的临床检测和分子流行病学调查。     

犬瘟热病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

根据犬瘟热病毒的核衣壳蛋白(N)基因保守序列,设计特异性引物,建立犬瘟热病毒荧光定量RT-PCR检测方法。试验结果表明,该方法敏感性比普通RT-PCR高出100倍,重复性良好,变异系数在1.01%以下,对犬的常见病原核酸提取物检测均为阴性,证明特异性良好。对32份临床样本进行检测,27份为阳性,高于普通RT-PCR方法。试验结果表明该方法可用于犬瘟热感染情况的检测。     

抗体快速金标检测卡结合RT-PCR技术诊断猪繁殖与呼吸综合征

采用猪蓝耳病抗体快速金标检测卡对贵州省不同发病猪场进行血清学检测,其弱阳性检出率为54%。在此基础上参考GenBank登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)LV和PRRSV VR-2332毒株核苷酸序列,设计一对特异性引物,用提取上述检测的某猪场猪繁殖与呼吸综合征疑似病料(包括血液、肝、肺、肾、淋巴结、心、脾组织)总RNA为模版,应用RT-PCR方法扩增出目的条带,大小为739 bp,与预期的结果相同。分析表明:该核苷酸序列与已报道的Hunan-3株的同源性为100%,与国内最早PRRSV分离株CH-1 a同源性为95%,与北美代表株VR-2332和欧洲代表株LV的同源性分别为89.2%和29.2%。说明采用猪蓝耳病抗体快速金标检测卡结合RT-PCR方法作为猪繁殖与呼吸综合征的诊断方法是准确、可行的。     

应用RT-PCR检测猪粪便中PRRSV

通过逆转录一聚合酶链反应（RT-PCR），设计特异性引物检测猪粪便中猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因片段。结果发现，所检测的8份猪粪便样本中有6份扩增出了目的条带，判定为阳性。     

应用RT-PCR检测猪粪便中PRRSV

通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),设计特异性引物检测猪粪便中猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因片段.结果发现,所检测的8份猪粪便样本中有6份扩增出了目的条带,判定为阳性.     

实时荧光定量RT-PCR方法检测禽流感病毒

根据禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)M基因上的保守序列,合成引物和荧光标记探针,以阳性AIVM基因质粒为标准品做标准曲线,建立了荧光定量逆转录聚合酶链反应(RRT-PCR)检测方法。结果表明,本试验建立的标准曲线循环阈值(Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.999,灵敏度约为5拷贝/μL,相当于5个AIV颗粒,对新城疫病毒和其他禽病病毒无交叉反应,特异性好、重复性佳,为AIV检测提供了一种特异、敏感、快速的定量检测方法。对500份临床泄殖腔棉拭样品的检测,其结果阳性?阴性数与经典病毒分离方法符合率分别为91.2%?99.4%。在AIV临床样品筛检、流行病学监测等方面显示良好的应用前景。     

狂犬病病毒快速荧光RT-PCR检测方法研究与应用

采用TaqMan方法,根据古典狂犬病病毒非编码区及N基因编码区序列,设计合成多对引物和多条探针,通过对引物、探针的筛选,反应条件的选择和优化,建立了古典狂犬病病毒荧光RT-PCR检测技术。与病毒分离鉴定、常规RT-PCR试验比较表明,建立的荧光PCR检测技术快速、敏感,检测时限3 h以内。特异性试验表明本方法与犬瘟热病毒,犬细小病毒,犬Ⅰ型腺病毒不发生交叉反应。初步动物感染试验及定量检测研究及表明,本方法可用于感染动物不同组织样品中病毒的相对定量。对132份临床样品和4种商品化疫苗进行检测研究表明,本方法适用于样品中狂犬病病毒的直接检测以及疫苗中活病毒或灭活病毒的检测。     

用RT-PCR技术检测盐渍猪肠衣中猪瘟病毒的研究

参考GenBank中发表的猪瘟病毒（CSFV）序列，设计一对CSFV特异性PCR引物；从CSFV感染猪盐渍小肠中提取总RNA，经逆转录后进行PCR扩增，在盐渍小肠中成功扩增出与预期大小（168bp）一致的特异性条带，而正常猪和感染猪伪狂犬病病毒的猪小肠扩增结果均为阴性。用本方法对20例不同稀释浓度的盐渍猪肠衣样本进行检测，结果显示比经典抗原检测方法（抗原捕获ELISA法）具有更高的敏感性。实验表明，本RT—PCR技术能应用于盐渍猪肠衣的CSFV检测，为快速、准确检测盐渍猪肠衣中CSFV提供了一条新途径。     

猪流感病毒RT-PCR快速检测方法的建立

根据猪流感病毒M基因序列设计了一对扩增M基因684 bp片段的特异性引物,建立了RT-PCR快速诊断猪流感的方法,采用该方法检测出H1、H3、H5和H9 4个亚型猪流感病毒标准参考株为阳性,猪副黏病毒、圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果呈阴性.RT-PCR最少可检测到1 000EID50的病毒量核酸,可直接从猪流感病毒感染小鼠的组织样品中检测到病毒.     

检测猪流行性腹泻病毒的R-PCR方法的建立

根据猪流行性腹泻病毒 (PEDV)的N基因自行设计和合成了一对可扩增长度为 641bp目的片段的引物 ,成功地建立了检测的猪流行性腹泻病毒的RT PCR方法。对猪轮状病毒 (PRV)、猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)的RT PCR检测结果均呈阴性。对PEDV JS株的RT PCR产物的序列分析表明 ,与CV777株的同源性为 97 3 %。     

用荧光定量RT-PCR方法检测猪瘟病毒

为了建立能特异检测不同基因型猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV),同时又能区分其他瘟病毒的基因检测方法,本实验针对CSFV基因组5′端非编码区设计并合成了简并引物和TaqMan探针,在优化反应条件的基础上,成功地建立了特异检测CSFV的荧光定量RT-PCR检测方法。再以已知滴度的CSFV石门株血毒总RNA反转录产物建立标准品,该标准品可以用于定量临床样品中的CSFV滴度,所建立的荧光定量PCR方法可以灵敏地检测出10~(-0.82)个TCID_(50)病毒含量。最后用建立的方法对108份临床样品进行检测并同时进行病毒分离,荧光定量PCR方法检测出73份阳性样品且与病毒分离的符合率为100%,而常规RT-PCR只检测出54份阳性样品,表明本荧光定量RT-PCR法在检测猪瘟病料上具有潜在的应用价值。     

实时荧光定量RT-PCR检测禽白血病病毒J亚群

将禽白血病病毒J亚群(ALV-J)NX0101毒株接种1日龄和7日龄SPF雏鸡并设阴性对照组,采用实时荧光定量RT-PCR方法,定期检测病毒在体内的复制情况。根据GenBank发表的ALV-Jenv基因保守序列(AY897227)设计1对特异性引物扩增目的基因;根据鸡的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因序列(K01458),在保守区内设计1对引物扩增内参照基因,分别克隆入质粒作为标准品制作标准曲线,采用SYBR GreenⅠ染料建立荧光定量PCR法,并对方法的特异性、敏感性和重复性进行评价。结果显示,标准曲线的Ct值与标准品浓度的对数值之间存在线性关系;最低每个反应可检测到60个拷贝的病毒数,比常规PCR灵敏度高1 000倍。检测结果分别采用绝对定量法和相对定量法进行分析,都达到了良好的效果。通过对病毒含量变化的检测发现,在雏鸡4周龄时,2个接毒组ALV-J病毒突然呈对数式增长。据此分析ALV-J病毒在体内经过3~4周潜伏后,突然呈暴发式增长,这种情况可能和临床表现的免疫抑制直接相关。结果表明,本试验建立了一种特异性强、敏感性高、可定量分析ALV-J病毒增殖的方法,为进一步相关研究奠定了基础。