堆型艾美耳球虫早熟减毒株裂殖子的细胞培养

以收集于雏鸡十二指肠的堆型艾美耳球虫早熟减毒株裂殖子接种于鸡胚成纤维细胞、鸡胚肝细胞、鸡胚小肠上皮细胞和雏鸡肾细胞,４１℃培养１２０小时,其在鸡胚成纤维细胞和鸡胚肝细胞中不能继续发育,在鸡胚小肠上皮细胞和雏鸡肾细胞中可发育到卵囊阶段。     

柔嫩艾美耳球虫裂殖生殖阶段超微结构的研究

利用透射电镜对柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella)裂殖生殖阶段的超微结构进行了观察描述。其第二次裂殖生殖方式为外裂殖生殖，裂殖子侵入宿主细胞后，裂殖子逐渐变圆形成裂殖体，此过程中裂殖子的棒状体首先消失，引后锥体和极环消失、最后微浅、淀粉颗粒和折光体消失。裂殖体长大后，细胞膜下陷，将裂殖体分成几个部分，随后裂殖体进行核分裂成多核裂殖体，此后在靠近细胞核处细胞膜加厚外突，临近部位的细胞膜凹陷，同时近突起部位内膜复合体加厚形成极环，随着时间的推移逐渐形成幼稚裂殖子，幼稚裂殖子后部与残体相连，此过程中裂殖子的锥、极环、微线、棒状体、淀粉颗粒、折光体依次逐渐形成。裂殖子成熟的标志为从残体脱离，裂殖子的膜下微管24根纵向贯穿裂殖子直达顶端和极环相连，裂殖子内部由锥体、锥体前环1、锥体前环2、极环、微线、线粒体、折光体和3－多个棒状体等组成。     

斯氏艾美耳球虫裂殖生殖的多态现象

迄今描述的艾美耳科和住肉孢子虫科球虫的裂殖生殖为单态，作者发现斯氏艾美耳球虫的裂殖生殖具多态性，其方式有：子孢子型裂殖体以内单多生殖方式产生下代裂殖子；双或多核的裂殖子型裂殖体或以内二多生殖方式或以外单多生殖方式产生下代裂殖子；单核裂殖子型裂殖体以外多生生列殖方式下代裂殖子；经典型裂殖体以内单多和外单多混生方式产生下代裂殖子。这种裂殖体以多态的方式产生下代裂殖子的现象称为裂殖生殖的多态现象。依据前     

柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子的分离纯化

本文报道了柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子的分离纯化方法。依次通过酶消化、离心洗涤、红细胞裂解、Percoll密度梯度离心等手段对鸡柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子进行了分离纯化,结果表明,该法效果好,回收率高,操作程序较简单,所获得的裂殖子杂质极少,其纯度适用于进行分子生物学方面的研究。     

柔嫩艾美耳球虫毒害艾美耳球虫变位艾美耳球虫交叉免疫试验

柔嫩艾美耳球虫毒害艾美耳球虫变位艾美耳球虫交叉免疫试验黄兵，赵其平，何林华，吴薛忠，陈兆国，史天卫（中国农科院上海家畜寄生虫病研究所，２００２３２）鸡感染球虫后会产生一种抵抗再次感染的免疫反应，这种免疫反应具有种的特异性，即感染某种球虫不能保护抵抗另...     

柔嫩艾美耳球虫裂殖子全长cDNA文库的构建及应用

为克隆柔嫩艾美耳球虫裂殖子阶段的功能基因的全长序列,利用SMART技术,采用Clontech公司的Creator TMSMARTTMcDNA Library Construction Kit构建了鸡球虫裂殖子的全长cDNA文库。用试剂盒提取mRNA后,以cDNA合成试剂盒合成cDNA。连接至pDNR-LIB载体,用电转化法将重组质粒转化到E.coli DH10B内得到原始文库,扩增后保存于-80℃冰箱内;最后以文库为模板,分别以研究室已成功克隆序列(EtSAG2、EtMIC-2、EtMCAT)及Sanger的部分EST序列(Contig1218)设计引物,进行PCR扩增并测序检验文库的实用性。经测定,构建的初级cDNA文库约含有8.72×107个重组子,插入的片段多在1kb～3kb之间,平均插入片段长度约1.8kb,扩增后文库保存的滴度为2.4×104 cfu/mL;通过文库的PCR扩增,不仅可以成功扩增出研究室已成功克隆的序列(EtSAG2、EtMIC-2),并成功获得EtMCAT和EST序列(Contig1218)的全长cDNA序列,经比对分析Contig1218所编码的蛋白为组织蛋白酶B样半胱氨酸蛋白酶(Cathepsin B)。结果表明,已成功构建了柔嫩艾美耳球虫裂殖子高质量的全长cDNA文库,从而为筛选鸡球虫的功能基因全长序列奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫裂殖子对侵入细胞凋亡抑制通路的研究

为了研究柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenlla)裂殖子入侵宿主细胞后对凋亡诱导的抑制通路,将纯化的裂殖子与牛肾传代细胞(MDBK细胞)共培养1.5 h。用含6%乙醇的完全培养基诱导细胞凋亡2.5 h,通过流式细胞术检测细胞凋亡率。采用标准试剂盒测定Cyto C,Caspase8,Caspase9,Caspase3的活性。流式细胞术结果显示,入侵裂殖子的细胞在诱导凋亡后其凋亡率为4.57%,而未感染的细胞其凋亡率达到23.69%,二者差异显著(P0.05),诱导凋亡的MDBK细胞早期凋亡率为19.50%,晚期凋亡率为4.19%,而感染裂殖子后诱导凋亡的MDBK细胞其早期凋亡率为3.53%,晚期凋亡率为1.04%,差异显著(P0.05)。结果表明,裂殖子的入侵不但可以抑制细胞凋亡,还可以延缓细胞进入早期凋亡的时间。试剂盒结果表明,裂殖子使Cyto C,Caspase8,Caspase9的活性下降,而Caspase3没有变化。根据上述结果初步判断,E tenlla裂殖子抑制MDBK细胞的凋亡是通过线粒体通路。     

柔嫩艾美耳球虫的抗原分析

本文采用十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳，免疫印渍技术，用抗柔嫩艾美耳球虫抗体分析了第二代型殖子、子孢子和未孢子化卵囊的蛋白质。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳银染表明第二代裂殖子主要蛋白质为：１７．６ＫＤ，２９．９ＫＤ，３８．９ＫＤ和５３．７ＫＤ，但用抗Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ抗体免疫印渍法检测出的主要抗原为：７８．０ＫＤ，８３．２ＫＤ和９５．５ＫＤ，这说明并不是含量高的蛋白质就是产生抗体的抗原；子孢子蛋白质含     

柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子中的Etmic-2基因克隆及测序

作者根据子孢子微线基因 (Etmic- 2 )的 c DNA序列 ,利用计算机设计出 1对引物 ,从柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子中用 RT- PCR技术扩增出 1个片段 (m ic2 - m z)。把这个片段克隆到 p GEM- T- Easy Vector中后 ,我们得到 1个阳性克隆 pmic2 - mz,酶切分析证明 pm ic2 - m z含有 m ic2 - m z,并且外源片段以反方向插入 T载体中。核苷酸序列测定结果表明 m ic2 - m z与 Etmic- 2基因的编码区序列一样长 ,分子量都为 112 7bp,并且两序列之间也只有 3个碱基不同 ,也没有造成氨基酸编码错位 ,这说明球虫从子孢子到第二代裂殖子的二次无性生殖过程中 ,微线基因Etm ic- 2 c NDA序列没有发生太大的变化。     

堆型艾美耳球虫裂殖子外分泌蛋白对细胞凋亡的抑制作用

为了研究堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)裂殖子的外分泌蛋白对马-达氏牛肾(MDBK)细胞凋亡的抑制作用,本试验建立Transwell小室间接共培养体系,即将E.acervulina裂殖子与MDBK细胞共培养,采用流式细胞术分别检测共培养1.5、3和6 h MDBK细胞的凋亡情况,利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)对共培养6 h后的细胞上清液中的成分进行鉴定。结果显示,1.5、3和6 h共培养组MDBK细胞的总细胞凋亡率分别为(5.92±0.19)%、(8.13±0.32)%和(11.57±0.37)%,与对照组相比,总细胞凋亡率均极显著降低(P<0.01)。LC-MS/MS分析共鉴定到65个E.acervulina的外分泌蛋白,包括热休克蛋白、微线蛋白、能量代谢酶分子、蛋白磷酸酶分子和未知功能蛋白等。结果表明,E.acervulina裂殖子外分泌蛋白可抑制MDBK细胞凋亡,具体哪种蛋白在抑制细胞凋亡中发挥作用有待后续进一步研究。     

堆型艾美耳球虫保定株裂殖子3-1E基因的克隆与序列分析

依据GenBank中收录的堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina,E.acervulina)关国株(US)3-1E基因序列,设计特异性引物,以堆型艾美耳球虫保定株裂殖子基因组RNA为模板,利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增获得3-1E基因序列部分片段,将此片段克隆至pGM-T Easy载体中,经PCR、限制性内切酶鉴定和克隆片段的序列测定、比较,结果表明该克隆片段扩增准确、可靠.序列比较发现,此片段与E.acervulina美国株(US)株、E.acervulina QH株cDNA的核苷酸同源性分别为99.4%和99.6%.     

柔嫩艾美耳球虫马杜拉霉素抗药株与敏感株的mRNA差异显示

利用柔嫩艾美耳球虫马杜霉素敏感虫株裂殖子和抗药虫株裂殖子为材料,对马杜霉素敏感虫株和抗药虫株进行差异显示PCR,共回收34条电泳差异片段,反向Northern点杂交鉴定4个片段为真正差异片段,并对4个片段进行测序、B1ast同源性比较.来自于马杜霉素抗药虫株裂殖子的ACD3-2序列与柔嫩艾美耳球虫微线-5同源性99%,说明AcD3-2序列是该基因的部分序列,微线-5蛋白与虫体融解宿主细胞膜、入侵、运动和溢出有关,在第二代裂殖子时期,抗药性虫株该序列发生转录,而在敏感虫株中沉默;HCD1序列来自马杜霉素敏感虫株,与柔嫩艾美耳球虫表面抗原16和17序列同源性分别为83%和86%,说明与这2个基因同源.AGD5片段来自抗药虫株,HAD8-2序列来自敏感虫株,通过比较这2条序列可能为新序列.     

柔嫩艾美球虫抗药株第二代裂殖子的双向电泳图谱比较

对实验室诱导的柔嫩艾美球虫马杜拉霉素、地克珠利抗药株及其同母源敏感株第二代裂殖子的蛋白质进行双向电泳，构建了稳定的双向电泳图谱。经Imagemaster 2D Elite软件分析，敏感株和抗药株平均可分离900个点；以敏感株平均胶作为参考胶，抗药株平均胶与之比较，得到差异蛋白质斑点，其中地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株各有4个表达差异点。这些差异表达的蛋白质可能参与了球虫抗药性产生的过程。     

强效艾美耳鸡球虫苗使用效果观察

多年来,鸡球虫病一直是困饶我市养鸡业发展的一大难题,是影响鸡存活率和生产水平的主要疾病之一。许多养鸡场和养鸡专业户试图用高效药物和环境卫生控制彻底消除鸡体内和养鸡场地中的球虫卵囊而达到控制球虫病的目的,非但效果不理想,而且往往造成球虫病暴发。作者也曾试图通过控制环境中卵囊含量,利用少量的自然界野毒卵囊实现机体的自身免疫,但效果也不满意,因为感染量、用药量以及时间很难掌握。目前我市大部分养鸡场、户还是依赖药物防制球虫病,但因耐药性问题的严重,常常出现药物控制下仍有球虫病暴发的事件。因此鸡球虫苗的研…     

鸡艾美耳球虫分子生物学研究进展

鸡艾美耳球虫分子生物学研究进展杨林，陈利，王芳（云南省农业生物技术重点实验室）家禽球虫病是由艾美耳球虫引起的一种严重危害家禽生长发育的疾病。家鸡艾美耳球虫现知共有９种，其中柔嫩艾美耳球虫（Ｅｉｍｅｒｉａｔｅｎｅｌｌａ）和毒害艾美耳球虫（Ｅ．ｎｅｃａｔ...     

柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子表面抗原基因(λMZ5-7)的克隆及序列分析

本文选择E.tenella第2代裂殖子表面抗原基因（λMZ5－7）为侯选抗原基因，利用RT－PCR方法从E.tenella第2代裂殖子中扩增出了λMZ5－7基因，反这一片段克隆到PGEM－T－easy克隆载体上，得到的阳性克隆经PCR鉴定及酶切分析。结果表明，重组子（PGEM－T－λMZ）中含有λMZ5－7基因，且是正向插入的。核苷酸序列分析结果表明，该序列全长984bp，有一个开放阅读（933bp），与国外报道的λMZ5－7基因比较，同源性为98．8％，只是在335～347bp处缺少12bp，基余部分相同，缺少的12bp没有造成氨基酸编码的错位，缺少的4个氨基酸为Thr、Ser、Gln、Gln。克隆出的λMZ5－7基因可用于将来重组疫苗的研究。