稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞系的建立

为建立能稳定表达T7RNA聚合酶(T7RNAP)的BHK-21细胞系以研究RNA重组疫苗,本研究从BL21(DE3)大肠杆菌中扩增T7 RNAP基因,定向克隆于质粒pcDNA3.1(+)中,经双酶切及测序鉴定,获得阳性重组质粒pcDNA3.1-T7 RNAP。用该质粒转染BHK-21细胞,经G418筛选14d后获得阳性细胞株。RT-PCR和western blot检测结果表明,建立了稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞系,并且在不同代次的阳性细胞中能稳定表达目的基因和蛋白,该研究为RNA病毒感染性质粒在细胞内转录及病毒拯救技术平台的建立奠定了基础。     

用乙基环丙沙星重建受大肠杆菌污染的BHK-21细胞

为重建受大肠杆菌污染的BHK-21细胞,本研究采用药物乙基环丙沙星,先测出该药对大肠杆菌的最低抑制浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),再测出该药对BHK-21细胞的MIC,从而确定10 mg/L为乙基环丙沙星不影响细胞生长,又能抑制大肠杆菌的安全浓度。然后用含该浓度乙基环丙沙星的MEM生长液,对受污染的BHK-21细胞进行物理、化学相结合的循环处理。经过3次循环处理,再传3代后,确认大肠杆菌污染已经被彻底清除,细胞恢复了健康。此方法为抢救受细菌污染的细胞提供了参考。     

用原位杂交对BHK-21细胞中的FMDV定位和检测

为了明确FMDV在细胞内的增殖部位，建立检测细胞内低拷贝FMDV的方法，对试验接种FMDVO／Akesu／58（10^7TCID50）毒株的BHK-21细胞中2～10h不同时间段的病毒RNA进行检测和定位。选用FMDVRNA非结构蛋白区3D保守序列作为寡核苷酸探针，采用尾段标记法以地高辛-11-d UTP标记，用原位杂交敏感加强型试剂盒检测杂交体。结果显示，从感染FMDV后2～10h内的BHK-21细胞中检测出阳性染色的病毒粒子，这些病毒粒子大多集中在核周围，随感染时间延长阳性染色信号增强。这说明用寡核苷酸探针与敏感加强型试剂盒结合对检测细胞内低拷贝的病毒粒子是可行的，同时也从分子水平上证明FMDV主要在细胞质中进行复制和繁殖。     

山羊痘病毒诱导BHK-21细胞凋亡的检测

为验证山羊痘病毒诱导BHK-21细胞出现凋亡现象的存在,分别采用HE染色、凋亡试剂盒检测、流式细胞仪检测和DNA Ladder检测,对山羊痘病毒感染的BHK[21细胞培养物进行细胞凋亡检测.不同方法检测结果均显示,山羊痘病毒感染BHK-21细胞组相同时间细胞凋亡数明显高于对照组.表明山羊痘病毒可诱导BHK-21细胞发生...     

水泡性口炎病毒诱导BHK-21细胞的凋亡

采用HE、Giemsa染色、透射电镜以及DNA琼脂糖凝胶电泳等研究了水泡性口炎病毒（VSV）诱导BHK-21细胞凋亡的过程。结果显示：VSV感染BHK-21细胞后,光镜下可见细胞圆缩,细胞器固缩、核仁消失、染色质凝聚和核碎裂、凋亡小体出现;电镜下观察到染色质聚集形成典型的新月形,胞浆中充满大量空泡,细胞核因染色质凝聚也发生了空泡化;1％的琼脂糖凝胶电泳出现180-200bp整倍数的DNA梯形条带。结果表明,VSV诱导BHK-21细胞凋亡是其致细胞病变的主要表现形式之一。     

BHK-21细胞无血清悬浮培养生产新城疫病毒

为建立基于无血清悬浮培养细胞生产新城疫病毒(NDV)的工艺,本研究首先筛选了适于NDV增殖的乳仓鼠肾细胞(BHK-21)单克隆细胞株,并将鸡胚适应的NDV在筛选获得的细胞株(BHK-v002)中传代,获得细胞适应的NDV。进一步采用单因素实验法检测病毒感染复数(MOI)、TPCK-胰酶浓度、细胞培养液的稀释比例等工艺参数对病毒效价的影响。结果显示,NDV在无血清培养的BHK-v002细胞中增殖的最适条件为:当细胞生长至约9.0×10^6个/mL时,以培养液.新鲜培养基为2:1的比例补加新鲜培养基,使细胞密度达6.0×10^6个/m L,按MOI为0.005接种NDV LaSota株,TPCK-胰酶终浓度为5μg/mL。接种病毒后96 h收获病毒液的HA效价为8.5 log2HAU/25μL,单细胞产毒量(Svy)达到1 685.9病毒颗粒/细胞,半数组织细胞感染剂量(TCID50)为7.9 log10TCID50/100μL。本研究确定了NDV LaSota株在BHK-21细胞悬浮培养中的增殖条件,建立了基于BHK-21细胞无血清悬浮培养体系中NDV的生产工艺,该工艺操作简便,易于放大,为当前ND疫苗的鸡胚生产工艺提供了候选替代方案。     

水泡性口炎病毒感染BHK-21细胞的超微结构改变

应用起薄切片技术对水泡性口炎病毒（VSV）在BHK-21细胞上的形态发生和早期发育进行了观察。结果表明，VSV能导致BHK-21细胞圆缩．胞浆严重空泡化，线粒体嵴断裂及空泡化；病毒在细胞浆内复制．增殖．在细胞膜上以出芽方式获得囊膜而成热。     

BHK-21细胞不同处理方式对裸鼠致瘤性的影响

为了分析BHK-21细胞对裸鼠致瘤性受何种因素的影响,我们分别用甲醛、二乙烯亚胺(BEI)、β-丙内酯(BPL)进行灭活和在-20℃进行冻融处理的BHK-21细胞接种裸鼠,通过病理组织形态学观察判定其是否存在致肿瘤的特性。结果显示,甲醛、BEI、BPL、冻融2次或3次分别处理的BHK-21细胞接种裸鼠,对裸鼠致瘤率为零。冻融1次的BHK-21细胞和107、105和103个BHK-21细胞分别接种裸鼠,致瘤率为100%。10个BHK-21细胞接种裸鼠,未见成瘤。本次试验表明,裸鼠检测BHK-21细胞致瘤性敏感性为103个细胞;冻融2次、甲醛、BEI、BPL处理,BHK-21细胞均丧失致瘤性;冻融1次不能使BHK-21细胞丧失致瘤性。     

不同浓度葡萄糖和谷氨酰胺对BHK-21细胞凋亡的影响

研究葡萄糖和谷氨酰胺两种重要营养物质对BHK-21细胞凋亡的影响,在BHK-21细胞体外培养过程中,加入不同浓度的葡萄糖和谷氨酰胺,每隔24 h取样细胞计数,活性分析和细胞凋亡率的测定.结果发现,当葡萄糖浓度降至0 mmol/L～4 mmol/L,谷氨酰胺浓度降至0 mmol/L～1 mmol/L时,细胞生长速率降低,...     

三株BHK-21悬浮细胞培养特性比较

为了筛选出适应于口蹄疫疫苗生产的最佳细胞株,用自制的GMEM培养基,以30mL/L血清浓度,在同等条件下比较了3种不同来源的BHK-21悬浮细胞培养特性。结果显示,这3种细胞在形态上无明显的差异,在显微镜下不易区分;在培养过程中,BHK-21-L细胞株在最短时间内可达到最大培养密度,细胞生长速度快,细胞活性较高,DNA合成旺盛;BHK-21C13-2P细胞株最大密度较低,在72h~96h被完全阻止在G0/G1,放大比例较小,为1∶1.5~1∶2;BHK-21-B细胞在72h~96h停止增殖,可放大较大比例,但易出现细胞结团、易贴壁的现象,影响细胞的增殖。可见,BHK-21-L细胞是生产口蹄疫疫苗可供选择的最佳细胞株。     

用乙基环丙沙星重建受猪鼻支原体污染的BHK-21细胞的研究

为重建受猪鼻支原体人为污染的BHK-21细胞,本研究采用含10 mg/L乙基环丙沙星的培养液,对受污染的BHK-21细胞进行物理、化学相结合的循环处理,并用DNA荧光染色法和PCR法对处理进行全程监测。结果发现,4次循环处理并再传3代后,猪鼻支原体污染已被彻底清除,细胞恢复了健康。此方法为抢救受支原体污染的细胞提供了参考。     

伪狂犬病病毒吉林分离株感染BHK-21细胞的超微结构变化

以猪伪狂犬病病毒(PRV)吉林分离株PRV-JL感染体外培养的BHK-21细胞为模型,通过透射电镜对PRV的形态发生学和宿主细胞超微结构的动态变化规律进行研究。结果显示,PRV能导致BHK-21细胞圆缩,并发生细胞融合,形成合胞体;电镜观察到的病毒粒子呈球形或椭圆形,成熟的病毒粒子直径大小为140~210 nm,未成熟病毒粒子直径为90~150 nm,多呈中空状,部分呈致密核芯。病毒吸附于细胞后以膜融合的方式进入细胞,在胞核内复制,装配好的病毒粒子以出芽的方式离开细胞核,获得最初的囊膜,进入胞浆;在胞浆内的病毒粒子又利用高尔基体的膜结构合成第2层囊膜,形成完整的病毒粒子;最后包裹有完整病毒粒子的高尔基囊泡与细胞膜发生融合,将病毒粒子释放到细胞外。感染细胞超微结构变化主要表现为:细胞胞浆空泡增多,内质网扩张,线粒体增生、嵴肿胀、脱落,最后空泡化,整个细胞裂解、破碎。     

稳定表达山羊SLAM受体的BHK-21细胞系的建立及应用

信号淋巴激活分子(SLAM)又称为CD150,是小反刍兽疫病毒(PPRV)和犬瘟热病毒(CDV)等麻疹病毒属病毒感染淋巴细胞的主要受体,在病毒侵入细胞中发挥重要作用。为建立稳定表达山羊SLAM(g SLAM)的真核细胞系,本研究将人工合成的g SLAM基因克隆至真核表达质粒p IRESpuro3中,并在该基因的3'端引入Flag标签序列作为分子标记,构建了重组质粒p IRES3-g SLAM。将该重组质粒转染BHK-21细胞,经嘌呤霉素加压筛选及采用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组PPRV病毒(r PPRV/GFP)感染鉴定后,筛选到稳定表达g SLAM基因的细胞系。r PPRV/GFP感染和western blot鉴定表明,无论是否有嘌呤霉素压力的存在,该细胞系在传代至第20代,仍能稳定表达g SLAM蛋白。由于g SLAM氨基酸序列与犬的同源性较高,以表达GFP重组CDV强毒株(r CDV/GFP)感染该细胞系,病毒可以感染且能形成明显的细胞病变,表明该细胞系可用于CDV强毒分离和致弱机制等相关研究。     

鸡新城疫病毒LaSota株在BHK-21细胞上增殖条件的优化

本研究旨在对鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota株在BHK-21细胞上的增殖条件进行优化,为实现应用细胞系生产NDV提供参考。在确定BHK-21细胞TPCK-胰酶耐受浓度的基础上,在培养基中添加不同浓度的TPCK-胰酶、新生牛血清及调节不同pH,通过对细胞培养液细胞半数感染量(TCID₅₀)的测定,确定最适胰酶浓度、血清浓度及pH;通过固定接毒量而添加不同数量细胞或固定细胞数量而接种不同量的病毒,确定最适细胞量及接毒量;将BHK-21细胞接种NDV LaSota株后,通过测定不同时间细胞上清液TCID₅₀绘制增殖曲线,确定最佳收毒时间;应用转瓶对该病毒进行扩大培养,并进行TCID₅₀、鸡胚半数感染量(EID₅₀)与血清凝集价(HA)的测定。结果显示,NDV LaSota株在BHK-21细胞上增殖的最适TPCK-胰酶浓度为3μg/mL,最适接毒量为10^6.375 EID₅₀,细胞数量为1×10~6个,培养基pH为7.2,且可用无血清培养基进行培养,BHK-21细胞接种NDV LaSota株后最佳收毒时间为34～36 h。应用BHK-21细胞采用转瓶培养的方式对NDV LaSota株进行增殖,结果显示,细胞培养液TCID₅₀值为10^7.0/0.1 mL,EID₅₀为10^7.5/0.1 mL,HA效价为1∶256。因此,应用以上条件增殖培养NDV LaSota株,完全适用于该病毒的规模化生产,且符合现行的兽医生物制品与检验制造规程。     

塞尼卡病毒A在BHK-21细胞中培养条件探索

研究发现,塞尼卡病毒A(Senecavirus A,SVA)是引发猪原发性水疱病(PIVD)的主要原因,感染猪的鼻吻、蹄冠部出现水疱性病变,还可造成新生仔猪死亡.为探索SVA在BHK-21细胞中培养的适宜条件,笔者分别从同步接毒法、单层接毒法、细胞浓度、收毒时间、血清含量等方面设计试验开展研究.本试验结果为制备高效价的...     

双倍盐MEM和传统MEM对BHK-21细胞生长和FMDV增殖的影响

采用双倍盐MEM细胞培养基与传统培养基进行了BHK-21细胞生长和FMDV增殖对比实验,实验结果表明两种培养基无明显差异,双倍盐MEM培养基工艺简单,易于质量控制,是细胞培养基选择的一个方向。     

Asia1型FMDV感染BHK-21细胞差异蛋白质点2-DE分析

为研究Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)感染BHK-21细胞后蛋白质组的变化及差异,将FMDV接种于培养的单层BHK-21细胞,同时设未接毒的BHK-21细胞作对照组.待细胞病变后分别提取2组细胞总蛋白借助2-DE技术及PDQuest8.0软件进行细胞蛋白质组二维电泳图谱差异性分析.结果显示感染组有1 457个可见蛋白质点,而对照组可见的蛋白质点为1 427个.感染组蛋白点的表达量与对照组相比,二者具有统计学差异(P<0.05)的蛋白质点472个,其中表达上调251个点,表达下调221个点,新合成蛋白点30个.结果表明FMDV感染BHK-21细胞后弓l起了细胞蛋白质组表达模式的改变,这种变化是病毒与细胞相互作用的结果.本研究首次利用蛋白质组学技术研究Asia 1型FMDV感染BHK-21细胞后蛋白质组学差异,有助于深入研究Asia 1型FMDV和BHK-21细胞相互作用的分子机制.     

BHK-21细胞规模化培养鸡新城疫病毒工艺的研究和初步应用

为了实现鸡新城疫病毒HN2018株(基因Ⅶ型)在乳仓鼠肾(BHK-21)细胞上的无血清规模化培养,本试验采用悬浮培养技术驯化和筛选了1株能够稳定传代的BHK-21-xh悬浮细胞株;使用该细胞以初始密度为100×10⁴个/mL接种摇瓶进行培养,并对摇瓶培养鸡新城疫病毒HN2018株的接毒细胞密度、培养温度、接毒量、收毒时间等工艺参数进行摸索和优化;利用摇瓶优化的病毒培养工艺,在10和100 L生物反应器中逐级放大培养BHK-21-xh悬浮细胞,接种鸡新城疫病毒;采用生物反应器悬浮培养的鸡新城疫病毒HN2018株细胞毒与鸡胚毒分别制备成灭活疫苗,免疫SPF鸡进行免疫效力的比较。结果显示,在摇瓶中培养72 h细胞密度均不低于800×10⁴个/mL,细胞活率均不低于96%;按照BHK-21-xh细胞密度不低于800×10⁴个/mL,病毒感染复数(MOI)为0.216进行接毒,同时添加终浓度为20μg/mL的胰蛋白酶,于35℃温度条件下培养64～72 h收获病毒液,鸡新城疫悬浮培养细胞毒红细胞凝集(HA)效价最高能够达到10log...     

AsiaⅠ型口蹄疫双效表达载体在BHK-21细胞中的表达

将构建好的双向反义表达载体PQC-AS-P12A3C经脂质体2000转染Ampho-pack293细胞,收获假病毒,在聚凝胺的介导下将其转染到BHK-21细胞,一定时间后进行检测。通过荧光抗体染色、目的基因的整合鉴定和RT-PCR检测等表明,目的基因P12A在细胞中成功表达,且已经整合到细胞染色体基因组中,病毒抑制试验则表明重组反义质粒对FMDV的产生起到一定的抑制作用。