天祝白牦牛αs1-酪蛋白基因和κ-酪蛋白基因的PCR-RFLP研究

利用PCR—RFLP技术熏检测了天祝白牦牛αS1-酪蛋白(αS1-casein,αS1-CN)基因和κ-酪蛋白(κ-casein,κ-CN)基因部分序列的遗传多态性熏结果表明:天祝白牦牛群体αS1-CN基因表现单态,κ-CN基因存在遗传多态性。κ-CN基因PCR-RFLP位点等位基因A和B的基因频率分别为0.0745和0.9255。κ-CN基因PCR-RFLP位点的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定理(P>0.05)。天祝白牦牛群体内平均基因一致度、基因多样度和有效等位基因数分别为0.9311、0.0689和1.0739。     

反相高效液相色谱法同时检测多种乳清蛋白成分

建立一种快速、简便鉴定和定量检测乳清蛋白中牛乳铁蛋白(bLf)、转基因人乳铁蛋白(rLf)、α-乳白蛋白(α-La)和β-乳球蛋白(β-Lg)的方法。对样品进行离心脱脂和酸法去除酪蛋白,水洗乳脂和酪蛋白以提高α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白(Lf)的回收率。乳清通过高效液相色谱检测,采用Proteonavi反相C4色谱柱,以体积分数为0.1%的三氟乙酸水溶液和乙腈水溶液为流动相,梯度洗脱,流速0.5mL/min,柱温35℃,检测波长280nm。结果显示:此方法可以有效分离牛α-乳白蛋白、牛β-乳球蛋白、牛乳铁蛋白和转基因人乳铁蛋白。标准品线性关系良好,平均回收率在正常范围内。     

基于α_s-酪蛋白特异性的牛乳总蛋白质ELISA定量检测方法的建立

本研究旨在建立牛乳中总蛋白质的ELISA定量检测方法,并评价该方法在牛乳掺假辨识中的应用效果。首先用αs-酪蛋白标准品免疫新西兰白兔,制备αs-酪蛋白特异性抗血清,并建立αs-酪蛋白的间接ELISA检测方法,结果显示血清效价为1∶640,αs-酪蛋白检测的线性范围是25~600 ng/ml,R2=0.999 5,回收率是96.6%~105.2%。再应用乳成分分析仪,凯氏定氮法和所建立的ELISA法测定8份来源不同的原料乳中总蛋白和αs-酪蛋白含量,结果显示不同牛乳中总蛋白质含量在0.029 2~0.029 8 g/ml,αs-酪蛋白含量在0.008 4~0.009 2 g/ml,占牛乳总蛋白质的比例恒定,平均为0.3,并用该系数建立牛乳中总蛋白质的定量方法。最后对5份人为兑水稀释、添加尿素、BSA和三聚氰胺的模拟掺杂牛乳样品进行检测,测定结果表明基于αs-酪蛋白的ELISA方法比乳成分分析仪法和凯氏定氮法具有更高的灵敏性和特异性,含氮添加物对测定结果无显著影响(P0.05),更适合于作为原料乳及含乳产品中牛乳蛋白质的定量分析。     

天祝白牦牛三个功能基因部分序列的PCR-RFLP研究

采用PCR—RFLP技术，检测了天祝白牦牛αS1酪蛋白(αS1-casein，αS1-CN)基因、κ-酪蛋白(κ-casein，κ-CN)基因和生长激素(growth hormone，GH)基因部分序列的遗传多态性。结果表明，天祝白牦牛群体中αS1-CN基因PCR—RFLP位点呈单态；κ—CN基因和GH基因两个PCR—RFLP位点均呈多态性。κ—CN基因PCR—RFLP位点等位基因A和B的基因频率分别为0．0745和0．9255，GH基因PCR—RFLP位点等位基因A和B的基因频率分别为0．1277和0．8723；该3个位点平均基因一致度和基因多样度分别为0．8798和0．1202。     

凝胶色谱法测定乳清中主要蛋白的相对分子量及其分布

本研究采用凝胶色谱分析技术,以牛乳乳清为研究对象,建立一种简便、快速的测定α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量的方法。通过一系列的试验,确定最佳凝胶色谱试验条件:采用PBS缓冲液作为流动相,柱温为35℃,检测器为示差折光检测器,流速1 m L/min,进样量为20μL。在该工艺条件下,牛乳乳清中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白被有效地分离纯化,蛋白的回收率在90%以上。本方法具有良好的重复性和稳定性,为短时间内对乳制品中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白进行分离和定量检测提供一种新的方法,满足了科研和生产的需求。     

牛羊鲜乳冷藏过程中蛋白质沉淀率比较及粒度分析

旨在分析牛羊鲜乳冷藏过程中蛋白质沉淀率变化及粒度大小。通过离心沉淀、原子力显微镜、激光粒度分析仪、SDS-PAGE电泳分析牛羊鲜乳冷藏过程中蛋白质沉淀率变化、鲜乳蛋白质粒子形貌、粒径分布范围、酪蛋白组成。结果表明:羊乳蛋白质沉淀率显著高于牛乳;牛乳蛋白质粒子数目(45μL~(-1))、密度(1.8μm~(-2))低于羊乳蛋白粒子数目(437μL~(-1))、密度(17.48μm~(-2));牛乳蛋白粒度大小主要集中在1nm以下,羊乳蛋白粒度只有19.3%在1nm以下,主要分布在1~1 000nm,其中100nm左右最多;牛羊乳酪蛋白主要有β酪蛋白和αs1酪蛋白2种,分子质量分别为34ku和26ku左右。牛乳蛋白质冷藏稳定性显著高于羊乳,羊乳蛋白质颗粒直径大于牛乳,牛羊乳蛋白质粒子数目和大小是影响冷藏稳定性差异的主要因素;原子力显微镜结合激光粒度仪是分析乳蛋白粒度大小的有效手段。     

山羊乳蛋白多态性与产奶性能的关系研究

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析２２５只西农萨能奶山羊乳样，首次对山羊乳中主要蛋白质的多态性与乳成分、产奶量等产奶性能指标的关系进行探讨。结果表明，β－乳球蛋白的基因型对奶山羊产奶量有显著影响，而α－酪蛋白、ｋ－酪蛋白对产奶性能无显著影响作用，β－乳球蛋白ＢＢ型、α－酪蛋白ＢＢ型和ｋ－酪蛋白ＡＡ型山羊个体表现出较好的产奶性能。     

乳清中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分离制备技术研究

本研究采用不同分离方法对牛乳乳清中的主要成分α-乳白蛋白和β-乳球蛋白进行逐级分离纯化。利用两步硫酸铵沉淀法对乳清蛋白进行初级分离,使蛋白含量提高了4倍;响应面法优化PEG1500/硫酸铵双水相萃取系统的最佳工艺参数,萃取后蛋白组分被进一步纯化,蛋白浓度提高到815.6 mg/g,达到浓缩主要蛋白的目的;萃取蛋白经Sephadex G-75和DEAE离子交换层析后,所获得的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白样品纯度达到85%。     

牛羊乳热处理蛋白质变性程度比较及机理分析

【目的】比较牛、羊乳热处理后蛋白质变性程度,探讨牛、羊乳蛋白质热稳定性差异机理。【方法】采用离心沉淀法、全自动色差仪和SDS-PAGE电泳法,以未热处理的常温(18~20℃)牛、羊乳为对照,测定不同温度(95,121℃)处理15min后牛、羊乳蛋白质沉淀率、红值(a*)和酪蛋白的组成;并采用考马斯亮蓝法、菲林试剂法和激光粒度仪测定牛羊鲜乳蛋白质、还原糖质量浓度及蛋白质粒度大小。【结果】羊乳蛋白质沉淀率显著高于牛乳(P0.05),牛乳酪蛋白的红值显著高于羊乳(P0.05),牛、羊乳酪蛋白主要均为β-酪蛋白和αs1-酪蛋白2种,分子质量分别约为34和26ku;羊乳蛋白质质量浓度((37.67±1.67)g/L)显著高于牛乳((20.33±1.20)g/L)(P0.05),还原糖质量浓度((421.77±10.17)mg/L)显著低于牛乳((525.67±14.98)mg/L)(P0.05);牛乳蛋白质粒度大小主要集中在1nm以下,羊乳蛋白质粒度只有少部分在1nm以下,主要分布于1~1 000nm。【结论】牛、羊乳蛋白质粒度和还原糖质量浓度分别是影响其蛋白质沉淀率和羰氨反应程度大小的主要因素。     

SDS－PAGE电泳在鉴别用牛乳掺伪的新疆特种乳中的应用

[目的]采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴别一定比例掺伪的特种乳中所含的牛乳成分及确定最低检测掺伪比例。[方法]按一定的比例(1∶1、1∶4、1∶10、1∶20、1∶100、1∶200和1∶400(V牛乳/V特种乳))掺伪,离心分离乳清蛋白,SDS-PAGE电泳,确定掺伪差异性蛋白并进行灰度分析。[结果]SDS-PAGE可以快速、有效地分离各乳乳清蛋白以及掺伪的牛乳乳清蛋白。[结论]SDS-PAGE鉴别掺伪的最低比例为1∶10(V_(牛乳_/V_(特种乳))。     

不同中药提取物对小鼠乳腺上皮细胞β-酪蛋白表达的影响

为探讨中药对小鼠乳腺上皮细胞泌乳功能的影响,选取5种与泌乳相关的中药(王不留行、甲珠、通草、蒲公英、漏芦)研究其对体外培养的小鼠乳腺上皮细胞β-酪蛋白表达的影响。采用荧光定量RT-PCR及毛细管电泳技术分别对β-酪蛋白的mRNA和蛋白表达水平进行检测,并应用激光共聚焦显微镜技术检测泌乳信号转录因子Stat5的含量变化。结果表明,通草、蒲公英和漏芦能显著促进β-酪蛋白的表达,王不留行和甲珠能极显著促进小鼠乳腺上皮细胞β-酪蛋白的表达。提示王不留行、甲珠和通草可通过影响乳腺上皮细胞乳蛋白基因的表达而促进泌乳,其机理尚待进一步研究。     

双蛋白干酪成熟过程中品质相关指标的变化分析

为了研究发酵剂及豆蛋白添加量对成熟干酪蛋白质分解情况的影响,对干酪成熟过程中相关指标—理化成分、水溶性氮(WSN)、三氯乙酸可溶性氮(TCA-SN)和可溶性磷钨酸氮(PTA-SN)的变化,并使用SDS-PAGE电泳方法检测蛋白质水解情况。结果表明:10%豆乳的添加使干酪的蛋白质含量提高5%,脂肪降低4%,同时对干酪的水分和pH都有影响。随着干酪的成熟WSN、TCA-SN、PTA-SN的质量含量随着时间的增加逐渐升高,成熟6个月后,达到34.25%、17.26%和5.35%;对电泳中αs-CN、β-CN和β-伴球蛋白降解率分析得出筛选发酵剂对豆蛋白及酪蛋白都有很强的降解作用。     

Genetic Polymorphism of Milk Protein and Their Relationships with Milking Performances in Chinese Yak

The milk protein polymorphisms were typed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)from 109 Maiwa and 100 Jiulong yaks, and the relationships among milk protein polymorphisms,milking traits and milk protein compositions were studied. The results showed that β -CN, κ -CN and a -La were monomorphic, a sl-CN and β -Lg were polymorphic, the dominantgenes were α s1-CN D and β -Lg E,respectively. The frequencies of α s1-CN D were 0.8073and 0.6000 and β -Lg E were 0.9770 and 0.9700 in two populations respectively. The meanheterozygosities were 0.1021 and 0.1 867 in two populations. No significant effects onmilking traits and milk protein compositions were observed except for u s1-CN locus onfat percentage in Jiulong yak.     

乳腺特异表达载体缺失片段的鉴定与修复

通过对pBC1中的乳腺特异表达启动子成分进行分析,鉴定了位于β酪蛋白启动子上游两个EcoRⅠ位点(-89~-94和-120~-125)之间的缺失片段,31bp的缺失使得该载体中的一个乳控盒元件(-112~-141)和一个乳腺因子识别序列(-92~-102)遭到破坏,并使得位于TATA框上游的所有启动子成分发生了位置改变。通过与山羊β酪蛋白启动子序列进行比较,设计并合成了缺失片段,经一系列的酶切和连接处理,使得该缺失得到了修复,修复后的载体具有所有乳蛋白表达需要的启动子调控原件。本试验结果为利用修复后的乳腺特异高效表达载体进行乳腺生物反应器的研究奠定了分子生物学基础。     

奶牛乳腺发育与泌乳过程中能量代谢的变化

为确定奶牛乳腺发育与泌乳各时期能量代谢状况及建立生物调控技术,应用试剂盒及高效液相色谱法(HPLC),对奶牛乳腺发育与泌乳过程中能量代谢重要指标进行了测定。结果表明,己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、甘油三酯、葡萄糖、乳糖、β-酪蛋白、ATP酶、能荷值和NADPH等指标在不同时期都存在差异,即青春期14个月时的葡萄糖浓度最高,妊娠4个月时的NADPH含量最高,围产前期时的甘油三酯含量、乳糖含量和能荷值最高,泌乳7 d时异柠檬酸脱氢酶活性和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性最高,泌乳140 d时的Ca2+Mg2+-ATP酶的活性最高,泌乳280 d时的Na+K+-ATP酶活性最高,退化期3 d的β-酪蛋白含量最高,退化期30 d时的己糖激酶活性最高。揭示了奶牛乳腺发育与泌乳过程中能量代谢的变化规律。     

应用表面增强拉曼光谱技术快速检测较大婴幼儿配方奶粉中的香兰素

【目的】香兰素（3-甲氧基-4-羟基苯甲醛）是一种婴幼儿配方食品中常用的食品添加剂,因具有浓郁奶香被广泛使用,但过量使用香兰素会引起婴儿肝肾损伤。目前,国家尚未出台相关检测标准,现场检测手段相对缺乏,建立婴幼儿配方奶粉中香兰素检测方法特别是现场快速检测方法迫在眉睫。本文建立了基于纳米金粒子的表面增强拉曼光谱对较大婴幼儿配方奶粉中香兰素的速测方法,为政府监管提供技术支撑。【方法】本文主要从样品前处理方法优化,增强基底的制备以及上机参数的选择3方面进行研究。比较不同萃取溶剂对香兰素提取效率的影响,确立较佳的样品前处理方法;研究不同粒径的纳米金胶溶液对香兰素的表面增强拉曼光谱信号强度的影响,确定较佳的增强基底;探明pH、离子强度等对上机液的影响,得到较优的检测条件。【结果】确立了较优的前处理方法：首先以饱和醋酸铅溶液作为沉淀剂去除基质中蛋白,之后以二氯甲烷为萃取溶剂对香兰素进行提取,最终使用pH为9的氢氧化钠水溶液对提取液进行纯化;确立了较佳的检测条件：以粒径约58 nm的金胶溶液作为增强基底,同时,在上机液中加入200 μL 1%硝酸溶液、50 μL 1%硝酸钾溶液,此时香兰素特征拉曼信号最强,有利于进行定性定量分析。本文建立的速测方法以1 149、1 497、1 575 cm-1处拉曼位移作为定性依据,以1 531 cm-1峰强度作为归一化标准,绘制1 497 cm-1处峰强度对香兰素浓度的标准曲线,在质量浓度30-300 μg•mL-1内实现定量计算,线性相关系数0.9913,检出限为10 μg•mL-1。在50、100和200 μg•mL-1 3个添加水平下,回收率为80.5%-86.9%,相对标准偏差小于8.6%。【结论】通过实际样品检测并将结果与现有文献报道方法相比较发现,该方法样品前处理简单、分析时间短（单个样品分析时间约5 min）,检测结果可靠,适用于对较大婴幼儿奶粉的现场快速检测,为市场监管提供了新的手段。     

毛细管电泳在蛋白质和核酸分析研究中的应用

综述了毛细管电泳（CE）在蛋白质肽图构建与鉴定。物化常数和结构分析。动力学研究。定性定量与微量缺陷徊的应用以及在核酸的纯度检测，片段置备及PCR产物分析，DNA测序与基因突变检测中的应用。     

毛细管电泳-电化学方法测定干红枣Vc·VP·VE的含量

[目的]建立采用毛细管电泳-电化学法分析干红枣中维生素含量的测定方法。[方法]采用自组装的毛细管电泳电化学检测系统,对干红枣中Vc、VP、VE的含量进行分离检测,对测定时不同的工作电位、分离高压、pH值和有机溶剂进行最佳选择。[结果]在选用pH值为8．0的硼砂-硼酸缓冲液,CTAB为0．5mmol／L、分离高压为20kV、检测电位为0．8V的测定条件下,Vc的线性范围为0．10～5．10mg／L,r=0．9991,检出限为1．37mg／L;VP的线性范围为1．30～17．70mg／L,r=0．9996,检出限为1．23mg／L;VE的线性范围为0．21—9．60mg／L,r=0．9990,检出限为0．27mg／L。测得的干红枣Vc、VP、VE的含量分别为424．64、412．16、312．39mg／100g,平均回收率分别为97．7％、98．1％和96．7％。[结论]毛细管电泳-电化学测定法快速、灵敏度高、选择性强,是适合干红枣维生素含量快速检测的方法。     

黄曲霉毒素B1高灵敏定性定量免疫层析检测方法的建立

  目的  真菌毒素可污染农产品和动物源性食品，其中黄曲霉毒素B₁(AFB₁)毒性强、危害大，建立AFB₁快速、高灵敏和便捷的检测方法对于监测相关产品中AFB₁污染水平，保障人和动物健康均具有重要意义。基于侧向层析技术原理，采用竞争模式，优化建立免疫层析检测方法，以实现AFB₁的快速定性检测和定量分析。  方法  通过比较分析不同粒径金颗粒标记抗体效果，优化确定免疫层析各组分材料类型、相关缓冲液配方及最佳使用质量浓度，建立AFB₁高灵敏定性定量免疫层析检测方法。  结果  优化建立的AFB₁免疫层析检测法在实际样本中的定性和定量检测限分别为2.5和0.5 μg·kg?1，灵敏度高、特异性强，与其他常见真菌毒素无交叉反应，加标回收实验结果显示:该方法准确稳定，且对AFB₁天然污染样本的定量检测结果与商品化试剂盒及LC-MS/MS一致性较好。  结论  本研究制备的免疫层析检测法可用于样本中AFB₁污染的快速定性检测与定量分析，适合缺乏实验条件的基层检验检疫机构和农产品加工企业对大量样本进行快速筛查，样本检测结果疑似阳性再采用仪器法进行确认，可降低检测成本，提升检测效率，同时为建立其他病原微生物免疫层析检测方法提供参考。图9表2参26     

Screen of Bovine Mammary Gland Epithelial Cell Specifcity Promotor

Three lactoproteins (α-Sl-casein, β-lactoglobulin, and β-casein) promotors were cloned, sequenced and compared relative luciferase expression. The results showed that the promotor activity of bovine α-...