甘蔗细胞壁转化酶基因(SoCIN1)克隆及其在转基因烟草中的表达特性分析

[目的]克隆甘蔗细胞壁转化酶基因(SoCIN1)并分析其在转基因烟草植株中的表达特性,为研究CIN1基因功能提供参考.[方法]克隆SoCIN1基因,利用基因重组技术构建植物正义表达载体pBI121-SoCIN1,采用叶盘法经农杆菌EHA105介导将其转化烟草品种K346.经抗性筛选和PCR扩增验证后获得转SoCIN1基因烟草植株,采用半定量PCR检测叶片SoCIN1基因的表达量,并测定叶片可溶性糖含量、CIN活性及株高(以野生型烟草为对照).[结果]克隆获得的SoCIN1基因长度为1731 bp,与GenBank已公布的SoCIN1基因(JQ312298)核苷酸序列同源性达100%,并通过构建其植物正义表达载体转化烟草.PCR扩增鉴定结果表明,SoCIN1基因已整合至烟草基因组DNA.对F0和F1代进行转基因烟草连续筛选,获得4个转SoCIN1基因烟草株系(T-1、T-2、T-3和T-4).在4个株系的叶片中均检测到SoCIN1基因的表达,其中以在T-1株系叶片中SoCIN1基因表达量最高,其次是T-3株系,最低的是T-4株系.4个株系叶片的可溶性糖含量、CIN活性及株高均高于野生型烟草,其中CIN活性显著高于野生型烟草(P<0.05,下同),且T-1株系CIN活性高于其他3株系;T-1、T-2和T-3株系叶片可溶性糖含量分别显著高于野生型烟草39.68%、19.95%和31.15%;T-1、T-2、T-3和T-4株系的株高较野生型烟草分别提高了15.57%、2.90%、5.74%和5.22%,但仅T-1株系与野生型烟草存在极显著差异(P<0.01).[结论]转SoCIN1基因烟草叶片过表达SoCIN1基因,能提高烟草的CIN活性和可溶性糖含量,促进植株生长,由此推测该基因在甘蔗生长发育和蔗糖积累过程发挥作用.     

拟南芥P5CS1基因转化羽衣甘蓝增强耐盐性分析

【目的】分析转拟南芥△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS1)基因羽衣甘蓝的耐盐性,为获得较强的耐盐性羽衣甘蓝品种及其抗逆育种提供理论依据。【方法】将拟南芥P5CS1基因(AtP5CS1)经农杆菌介导转入羽衣甘蓝植物中,在盐胁迫下,分别检测转基因植株与野生型植株的AtP5CS1 mRNA表达量、幼苗脯氨酸含量、株系根系性状、整株干质量和鲜质量、叶片相对水含量、叶片电导率和整株存活率。【结果】在150 mmol/L NaCl胁迫下,转基因植株的P5CS1基因mRNA可正常表达,与对照相比,转基因株系Y1、Y2的主根和最长侧根长度较长,侧根数目较多,整株干质量和鲜质量较重;而且相对水含量显著高于对照植株(P0.05,下同),脯氨酸含量及存活率均极显著高于对照植株(P0.01),叶片相对电导率显著低于对照植株。【结论】转AtP5CS1基因植株的耐盐表型优于对照,即AtP5CS1基因在羽衣甘蓝中的表达明显改善了转基因植株的耐盐性。     

农杆菌介导的转拟南芥AtCHX23基因玉米及其耐盐性

本研究通过农杆菌介导法将拟南芥耐盐基因AtCHX23导入玉米自交系郑58中,用PCR、Southern blot和RT-PCR法对转化玉米进行检测,并在150 mmol/L盐(NaCl)胁迫下对T3代转基因玉米和野生型进行耐盐性分析。结果显示:共获得26株转基因阳性植株;挑选长势较好的2个PCR阳性株系进行Southern blot鉴定,确定AtCHX23基因以单拷贝的形式成功插入到玉米基因组中,且AtCHX23基因在转基因玉米中过量表达。非盐胁迫条件下,野生型和2个转基因株系间生长状态及其可溶性糖、脯氨酸和丙二醛含量无显著差异;在150 mmol/L盐处理下,2个转基因株系的生长状态优于野生型,2个转基因玉米株系的可溶性糖和脯氨酸含量均高于野生型,丙二醛的含量低于野生型。综上所述:AtCHX23基因过量表达可以提高玉米苗期的耐盐性。     

过表达AtNEK6转基因烟草的耐旱耐盐性研究

NEK6基因编码一种丝/苏氨酸蛋白激酶,具有调控植物细胞周期蛋白基因表达和乙烯信号转导的功能,与植物抵抗逆境胁迫相关。将拟南芥AtNEK6基因导入烟草,利用甘露醇和NaCl模拟干旱和盐胁迫环境对T2代转基因烟草进行研究。结果表明,在无胁迫处理条件下,转基因烟草根长、侧根数和鲜重显著高于野生型;在干旱和盐胁迫条件下,转基因烟草根长、侧根数和鲜重均极显著高于野生型,表现出较强的耐旱耐盐性;胁迫处理的转基因烟草叶片叶绿素荧光参数值(Fv/Fm)、SOD和CAT活性以及Pro含量极显著高于野生型,MDA含量极显著低于野生型,进一步证明了AtNEK6基因能够促进烟草的生长和提高转基因烟草对于干旱与盐碱的抵抗能力。     

外源铁蛋白基因NtFer1对粳稻生理影响的研究

[目的]验证铁蛋白基因的功能,提高转基因粳稻的含铁量和转基因粳稻对盐胁迫和生物胁迫的抗性。[方法]利用农杆菌介导法将烟草铁蛋白基因NtFer1导入粳稻基因组。[结果]对T0、T1代卡那霉素抗性植株PCR、Southern杂交、Northern杂交和RT-PCR检测分析表明,外源基因已整合到粳稻基因组中,并能够稳定遗传表达。转基因粳稻超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性和叶绿素相对含量高于对照,丙二醛(MDA)含量低于对照,其根、叶片和糙米中铁含量均高于对照。接种稻瘟病病菌后转基因植株叶瘟指数低于对照。[结论]转入外源铁蛋白基因NtFer1能够提高粳稻的含铁量和转基因粳稻对盐胁迫和生物胁迫的抗性。     

柽柳rd22基因的序列分析及耐盐性研究

【目的】验证从抗逆植物柽柳中克隆得到的rd22基因的耐盐能力。【方法】采用根癌农杆菌介导法,对烟草进行rd22基因的遗传转化,将分子检测为阳性的6个转基因烟草株系和非转基因对照烟草的组培苗进行盐胁迫(NaCl浓度分别设为0(CK),110,220和330 mmol/L)试验,通过观察相对电导率、SOD活性和相对生长量的变化,研究rd22基因的耐盐能力。【结果】生物信息学分析表明,来自柽柳的rd22基因属于BURP蛋白家族。分子检测证明,该rd22基因已整合到烟草基因组中,并在mRNA水平上有不同程度的表达。相对电导率和SOD活性分析表明,随着盐胁迫浓度的增加,各转基因烟草株系的相对电导率均呈上升趋势,且均小于对照烟草,在盐胁迫浓度达到330mmol/L时,非转基因对照烟草的相对电导率高达16.49%,而各转基因烟草的相对电导率最大为14.91%。各转基因烟草株系的SOD活性也随着盐胁迫浓度的增加均呈上升趋势,且均大于对照烟草,在盐胁迫浓度达到330 mmol/L时,转基因烟草SOD活性是对照烟草的1.10~1.39倍。相对生长量分析表明,盐胁迫浓度达到110,220,330mmol/L时,各转基因烟草株系相对生长量均高于对照株系,非转基因烟草的相对生长量分别为59.92%,36.99%和12.72%,转基因烟草的相对生长量平均为67.00%,44.05%和17.47%。【结论】rd22基因的导入,提高了转基因烟草的耐盐性。     

甜椒内质网小分子热激蛋白基因(CaHSP22.5)克隆及其在转基因烟草中的表达分析

[目的]克隆甜椒内质网小分子热激蛋白基因(CaHSP22.5),并检测其表达特性,为探究其在植物抗逆中的调控机制提供理论依据.[方法]克隆CaHSP22.5基因并构建其表达载体pBI121-CaHSP22.5,转化农杆菌LBA4404后通过叶盘法转化野生型烟草,即获得CaHSP22.5转基因株系;以转pBI121空载体的野生型烟草为对照组.对转基因株系和野生型烟草进行4℃6 h低温处理,根据幼苗成活率测定CaHSP22.5基因表达对植株耐寒性的影响.采用脉冲振幅调制叶室荧光仪Li-6400测量4℃处理10 h后野生型植株与CaHSP22.5转基因株系叶绿素荧光,根据非光化学淬灭系数(NPQ)值测定CaHSP22.5基因表达对在低温下植株光合作用的影响;使用过氧化氢(H2O2)钛络合物法对烟草叶片中H2O2进行定量分析,通过测定活性氧(ROS)积累程度分析CaHSP22.5对植物光合系统的影响;采用检测柠檬酸合成酶(CS)活性的方法,在体外通过对变性CS复性的影响测定CaHSP22.5的分子伴侣活性.[结果]经低温处理后发现CaHSP22.5转基因株系13号、24号和32号幼苗的平均存活率分别为84%、75%和52%,而野生型烟草的平均存活率为30%,CaHSP22.5转基因株系烟草幼苗成活率菌高于野生型幼苗.低温处理10 h后发现CaHSP22.5转基因植株NPQ较野生型植株显著升高(P<0.05),说明转基因烟草中CaHSP22.5的积累有利于保护光合系统,在低温胁迫下清除ROS.同时发现低温胁迫导致植株ROS产量增加,CaHSP22.5转基因植系与野生型相比ROS积累水平较低.不同浓度的CaHSP22.5均可使变性的CS复性,且其CS活性均高于未添加CaHSP22.5的CS活性.[结论]CaHSP22.5蛋白可增强植株的耐寒性及光合作用,在植物体内可降低ROS积累,减轻脂质过氧化,同时具有分子伴侣活性.     

外源铁蛋白基因NtFerl对粳稻生理影响的研究

[目的]验证铁蛋白基因的功能,提高转基因粳稻的含铁量和转基因粳稻对盐胁迫和生物胁迫的抗性。[方法]利用农杆菌介导法将烟草铁蛋白基因mnrl导入粳稻基因组。[结果]对T0、T1代卡那霉素抗性植株PCR、Southern杂交、Northern杂交和RT—PCR检测分析表明,外源基因已整合到粳稻基因组中,并能够稳定遗传表达。转基因粳稻超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性和叶绿素相对含量高于对照,丙二醛（MDA）含量低于对照,其根、叶片和糙米中铁含量均高于对照。接种稻瘟病病菌后转基因植株叶瘟指数低于对照。[结论]转入外源铁蛋白基因NtFerl能够提高粳稻的含铁量和转基因粳稻对盐胁迫和生物胁迫的抗性。     

干旱胁迫对转拟南芥Atpsy基因生菜的影响

干旱胁迫处理转拟南芥Atpsy基因的T1代生菜和野生型生菜,测定各转基因株系与野生型生菜的各项生理生化指标、目的基因的表达量和类胡萝卜素的含量。结果显示:正常情况下,转基因株系与野生型植株的各项生理指标之间没有明显的差异,随胁迫程度加深,转基因株系在发芽率、发芽指数和净光合速率的下降幅度方面小于野生型;同等胁迫强度下,转基因株系的脯氨酸、可溶性糖含量和超氧化物歧化酶活性高于野生型植株;转基因株系植物体内丙二醛的快速积累程度和叶绿素降解速率小于野生型对照组。干旱胁迫处理下,转基因株系Atpsy基因的表达量和类胡萝卜素的含量均有所提高。     

PtrDREB28转录因子的克隆及抗逆性

DREB/CBF转录因子响应植物干旱、高盐和低温等非生物胁迫应答是通过特异结合DRE/CRT顺式作用元件。利用RT-PCR技术从毛果杨克隆PtrDREB28转录因子基因,用基因枪法对其进行亚细胞定位分析,结果表明其定位在细胞核中;利用农杆菌介导法对野生型大青杨进行遗传转化,并对转基因株系进行抗逆性分析,结果显示经高盐胁迫处理的转基因株系的耐受性明显高于野生型植株;通过测定和比较经盐胁迫处理后转基因株系和野生型植株的丙二醛质量摩尔浓度和相对电导率,发现转基因株系的丙二醛质量摩尔浓度和相对电导率均显著低于野生型植株,表明PtrDREB28基因的过表达可以显著提高杨树耐盐性,由此推测PtrDREB28转录因子可能参与杨树逆境胁迫应答过程。     

转耐辐射球菌irrE基因提高拟南芥盐胁迫耐受性的表型分析

耐辐射球菌中的irrE基因作为一种全局性调节因子,在抵御极端辐射照射时起着至关重要的作用。利用农杆菌介导的花序浸染法,将irrE基因转化拟南芥,筛选和鉴定出表达irrE的植株,并分析了转基因植株的盐胁迫耐受能力。结果显示,转irrE拟南芥表现出对盐胁迫的耐受性提高;在盐胁迫下,转基因拟南芥体内脯氨酸含量比野生型有明显的提高。RNA半定量分析显示转基因植株中AtNHX1表达水平升高。因此推测irrE基因在转基因拟南芥中调控了AtNHX1的表达,引起了植株的盐胁迫耐受性提高。     

根癌农杆菌介导AtNHX1基因转化甘蓝型油菜的研究(摘要)(英文)

[目的]研究根癌农杆菌介导AtNHX1基本对甘蓝型油菜的转化。[方法]采用根癌农杆菌介导法,应用cre/lox植物表达载体,研究Na+/H+逆向转运蛋白AtNHX1基因对甘蓝型油菜的转化。[结果]甘蓝型油菜带柄子叶的再生频率远大于下胚轴的再生频率,因此选择带柄子叶作为转化受体。带柄子叶经浓度OD600为0.4的菌液中侵染8～10min,卡那霉素抗性绿苗率达3.75%。[结论]对抗性植株的PCR检测证明,外源基因已经整合到油菜基因组中,为提高甘蓝型油菜耐盐能力研究提供了新的途径。     

超表达OsSsr1基因增强烟草耐盐性

本研究从水稻品种R109中克隆了OsSsr1基因（GenBank Accession No.NM₀01065574）,并用土壤根癌杆菌介导的方法,把OsSsr1基因转入本氏烟（Nicotiana benthamiana）中,提高了转基因植株的耐盐性。生理指标测定结果表明:在盐胁迫下,转基因和野生型植株中的丙二醛（MDA）、脯氨酸的含量以及过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性都呈上升趋势,但转基因烟草中MDA含量升高速率明显低于野生型,而脯氨酸的含量以及POD、SOD活性的升高速率明显高于野生型烟草。因此,OsSsr1转基因烟草耐盐性的增强,可能是脯氨酸含量和活性氧清除能力的提高引起的。     

过量表达AtNHXS1新基因显著提高水稻的耐盐性

以转基因和野生型水稻为材料,通过农杆菌介导法将AtNHXS1转到水稻植株中花11号中,分析在盐胁迫下Na+、K+含量的变化,对两者耐盐性进行比较,并对转基因株系进行分子鉴定和转录表达分析。结果表明:PCR初步鉴定得到了20个转基因株系,随机挑选2个PCR阳性株系进行Southern blot鉴定,确定AtNHXS1以单拷贝的形式成功插入到水稻基因组中。耐盐性分析表明,在盐胁迫条件下,转基因水稻植株的生长状况、干质量、鲜质量、Na+含量显著优于或高于野生型水稻植株;此外,300mmol/L NaCl处理下,转基因水稻植株能够正常存活,而野生型水稻5d内几乎全部死亡。将300mmol/L NaCl处理过的植株在无盐胁迫的条件下进行恢复生长试验,转基因植株10d内恢复正常,而野生型则不能。过量表达改组后的AtNHXS1新基因显著提高了水稻的耐盐性。     

转獐茅AlNHX基因烟草的耐盐生理研究

[目的]研究从禾本科盐生植物獐茅中分离的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因AlNHX在盐胁迫下的功能和表达。[方法]转化AlNHX的烟草经过抗生素和PCR筛选后,用不同浓度的NaCl处理30 d,测定其单株干重、相对电导率、细胞渗透压以及K+/Na+比。[结果]在不同浓度NaCl处理下,转基因烟草的相对干重和细胞渗透压均高于对照烟草。在300 mmol/L NaCl处理下,转基因烟草的相对电导率明显低于对照。K+、Na+含量测定表明在盐胁迫下转基因烟草的根部和叶片均维持一个相对较高的K+/Na+水平。[结论]AlNHX是一个有效的耐盐基因,可进一步应用于单子叶农作物的基因改良研究。     

过量表达棉花GhSAP1提高转基因烟草的耐盐性

【目的】SAP（stress-associated protein）是一类涉及胁迫应答和调控的锌指蛋白。克隆并分析其对逆境胁迫应答的反应,为棉花抗逆育种提供候选基因。【方法】通过电子克隆方法并经RT-PCR验证获得棉花锌指蛋白基因GhSAP1,将带有目的基因的载体质粒通过PEG介导转化棉花叶肉原生质体细胞,瞬时表达分析其编码蛋白的特性及亚细胞定位信息。通过qRT-PCR技术分析目标基因的组织表达特征及非生物胁迫条件下的表达特性。通过农杆菌介导叶盘转化法,经组织培养获得转基因烟草进行异位表达,检测其与抗逆相关的生理指标,证明其提高植物抗逆能力。【结果】GhSAP1 ORF长度为543 bp,编码一条含180个氨基酸残基的多肽。其理论等电点8.97,分子量19.3 kD,具有典型的A20/AN1锌指结构域。亚细胞定位显示该基因编码的蛋白定位于细胞核上。不同组织器官表达分析显示,GhSAP1在根、茎、叶中的表达量高,而在开花后5 d的胚珠中表达量很低。GhSAP1受盐胁迫诱导,高盐处理2 h后表达量最高。利用含100 μg•mL-1 Kan的培养基进行抗性筛选转基因后代,结合目标基因的PCR与RT-PCR验证,获得转GhSAP1的转基因烟草阳性株系10个。目标基因GhSAP1均能在烟草基因组中整合并异位过量表达。随机选择3个转基因烟草株系,盐胁迫处理显示,发芽一周的种子在含200 mmol•L-1 NaCl培养基上胁迫12 d,转基因植株幼苗平均成活率为81.7%,比非转基因对照植株增加近3倍,其平均根长为3.05 cm,极显著高于非转基因对照。利用GhSAP1表达较高的L2纯系进行成株期烟草盐胁迫处理30 d,转基因烟草后代的SOD活性和可溶性总糖含量增幅分别为23.89 U•g-1 FW和8.37 %,均显著高于非转基因对照;与未胁迫处理相比,转基因植株的叶绿素含量降低幅度仅为0.17 mg•g-1 FW,而非转基因对照降低了0.39 mg•g-1 FW;盐胁迫处理后,转基因植株的MDA含量增幅为7.42 nmol•g-1FW,而非转基因对照增幅达20.85 nmol•g-1FW;在盐胁迫下,转基因植株具有更强的K+根部运输到植株绿色组织能力,其地上部的K+/Na+为1.23,显著高于非转基因对照。【结论】GhSAP1在参与植物的逆境应答反应机制中具有重要作用,过量表达GhSAP1可显著提高转基因烟草的耐盐能力。     

应用cre/lox植物表达载体的AtNHX1基因转化杨树研究

[目的]研究Na^＋／H^＋逆向转运蛋白AtNHXl基因对杨树的转化。[方法]以杨树南林895杨的叶片作为外植体,采用根癌农杆菌介导法,构建cre／lox植物表达载体,并对3株转基因植株进行PCR分子检测。[结果]结果表明,较适合的转化条件为：外植体在分化培养基上经过2d预培养后于0D600nm值为0．3～0．4的菌液中浸泡7min,卡那抗性绿苗率可达43．9％;PCR分子检测表明,目的基因已经整合到杨树基因组中。[结论]该系统可以应用于杨树的基因工程研究。     

小麦类CTR1基因的克隆和特性分析

 【目的】克隆小麦类CTR1基因（TaCTR1）,研究其在各种胁迫条件下的表达、亚细胞定位和过量表达TaCTR1对转基因烟草耐盐性的影响。【方法】利用RACE结合RT-PCR技术克隆TaCTR1,利用半定量RT-PCR研究TaCTR1在各种非胁迫及ABA处理条件下的表达,通过烟草转化研究过量表达TaCTR1对转基因植株耐盐性的影响。【结果】TaCTR1全长2 635 bp,编码759个氨基酸,在其羧基端有一个非常保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域,该结构域含有ATP结合位点和一个钙调素结合位点;TaCTR1与其它植物中CTR1的氨基酸序列同源性较高。TaCTR1的表达受NaCl和干旱胁迫的诱导,当用30μmol?L-1 ABA对小麦幼苗进行处理时,TaCTR1的表达受到抑制,当将小麦幼苗转移至无ABA的Hoagland培养液时,TaCTR1的表达又逐渐升高。利用洋葱表皮细胞进行瞬时表达显示TaCTR1可能定位于细胞质膜。过量表达TaCTR1的转基因烟草植株耐盐性下降。【结论】 TaCTR1是小麦中克隆的第一个CTR1基因,TaCTR1:GFP可能定位于细胞质膜,过量表达TaCTR1的烟草植株耐盐性下降说明TaCTR1是植物耐盐信号传导途径的负调控因子。     

MAP30基因转化烟草的研究

通过转基因技术,利用农杆菌介导法,将pBIMAP30植物表达载体转化烟草,Kan筛选抗性苗,选择植株健壮、根系发达的抗性植株,提取叶片DNA进行PCR鉴定,获得阳性转基因烟草.采用RT-PCR方法证实MAP30基因能够在转录水平上正常表达.该研究为探讨具有药用价值的植物资源奠定理论基础,并为获得抗病毒、抗肿瘤功能性药物蛋白的植物新品系研发提供一定的技术支持