新城疫病毒单克隆抗体的制备及与不同分离株的反应性

以纯化的新城疫病毒(Newcastle dis-ease virus,NDV)弱毒株La Sota为免疫原,接种6周龄~8周龄Balb/c小鼠。最后一次加强免疫后3 d,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合。以纯化的NDV建立了筛选单抗的间接ELISA,经多次检测,3次亚克隆,共获得5株NDV特异性单抗,这5株单抗与NDV不同分离株的反应性存在差异,表明部分NDV毒株抗原性发生了变异。     

3株单抗对新城疫病毒HN抗原变异的分析

以新城疫病毒(NDV)LaSota株为免疫原研制了3株针对NDVHN蛋白的单抗,分别命名为1E5、C3-B7和E6-F11。3株单抗与NDV不同毒株在血凝抑制试验(HI)、ELISA和病毒中和试验中的反应性不同,而同一株单抗与同一个NDV毒株在HI、ELISA以及病毒中和试验中的反应性一致。其中,单抗1E5与NDV标准株(LaSota、F48E8)、8个NDV分离株反应阳性,而与9个NDV分离株反应阴性;单抗C3-B7、E6-F11与所有NDV毒株反应均为阳性。结果表明,3株单抗均是针对HN蛋白上的中和位点,国内部分NDV流行株的HN抗原至少有1个抗原位点发生了变异。     

抗新城疫病毒糖蛋白单克隆抗体的研制及在免疫组化中的应用

应用纯化的新城疫病毒(NDV)La Sota野毒株免疫Balb/c小鼠,最后一次免疫后3 d取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选到3株分泌抗NDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,对各株单克隆抗体免疫球蛋白亚类及ELISA效价进行测定.结合单克隆抗体反应结果,鉴定出抗NDV NP蛋白的单克隆抗体,利用该单克隆抗体s3e1做免疫组化试验,用rLa Sota(重组La Sota第2代毒株)免疫2日龄雏鸡,接种后第5天检测到肝脏的部分肝细胞呈阳性反应.     

新城疫病毒基因型差异性单克隆抗体的制备及鉴定

目前新城疫病毒(NDV)弱毒株的混杂对禽病实验室病原诊断工作造成很大困扰,NDV强弱毒株以及基因型的快速鉴别是亟待解决的重要问题。研究选用一株与疫苗株La Sota存在显著抗原性差异的强毒株PI/CHINA/SD/2012/167制备油乳剂疫苗免疫小鼠制备单克隆抗体。采用间接ELISA检测抗体对该强毒株及La Sota株的反应性,筛选广谱型和强弱毒株差异型的单克隆抗体,最终获得2株存在基因型差异的单克隆抗体。其中,3F10株不与ClassⅠ以及ClassⅡ基因Ⅰ型毒株反应,而与其他毒株都有很好的反应性,而7E11株不仅与ClassⅠ以及ClassⅡ基因Ⅰ型毒株反应性弱,而且与La Sota株和Mukteswar株的反应性也远远低于ClassⅠ基因Ⅵ、Ⅶ和Ⅸ型的强毒株。为了确定两株克隆抗体靶向的病毒蛋白,构建了NDV蛋白真核表达质粒转染DF1细胞,并利用Western blot和间接免疫荧光试验进行检测。结果显示,3F10针对NDV M蛋白,而7E11针对NDV F蛋白。两株单克隆抗体与NDV不同基因型毒株反应的差异性为NDV的鉴别诊断技术研究奠定了基础。     

鹅源新城疫病毒单克隆抗体的研制及其与不同NDV毒株的反应性

以鹅源新城疫病毒(NDV)作为免疫原免疫BALB／c小鼠，获得了5株具有HI特性的单克隆抗体，分别命名为2G5、3A4、385、6B1和8C5，其腹水HI效价分别为2^14、2^12、2^9、2^15和2^8。竞争ELISA结果表明，2G5、3A4、385和6B1在HN蛋白上所针对的表位属于同一抗原区，而8C5针对的表位为另一抗原区。将上述5株单抗与不同来源的NDV进行了HI排谱试验。结果显示，同一抗原区4株单抗的反应谱比较一致，而与另一抗原区单抗8C5的反应谱明显不同。5株单抗与鹅源NDV毒株的反应性较强，而与鸽源NDV毒株的反应性较弱。这5株单抗用HRP标记后再与不同单抗进行交叉夹心ELISA，得到了一个新的系统(2G5—8C5)。用该系统对NDV分离株做排谱试验。结果显示，该系统与鹅源NDV分离株的反应性较好，表明所建立的新系统可用于鹅源NDV的检测。     

禽流感病毒单克隆抗体的制备及其抗蛋白抗原的分析

以纯化的H9N2亚型禽流感病毒为抗原,免疫BALB/c小鼠,细胞融合后,经间接ELISA和血凝抑制试验(HI)筛选,获得了8株能稳定分泌抗禽流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。特异性试验证明,8株杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水的特异ELISA抗体效价可达1∶3.2×103~1∶5.1×106,其中2株HI效价达212。8株单抗与H5亚型血凝素分型抗原不发生血凝,与减蛋综合征(EDS-76)病毒、传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)均不反应。亚类鉴定证实,除1C7单抗为IgG2b外,其他7株均为IgG1亚类。Westernblotting试验分析初步表明,8株单抗至少针对纯化病毒粒子3种不同的蛋白抗原,其中3株针对核蛋白(NP),2株针对基质蛋白M1,2株针对血凝素HA/HA1。对感染细胞的Western blotting分析结果与纯化病毒结果基本一致,其中1株未明显沉淀纯化病毒粒子蛋白的单抗可以与感染细胞的M2蛋白多肽反应。     

猪伪狂犬病病毒变异毒株gE和gB蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为建立猪伪狂犬病病毒(PRV)疫苗免疫抗体与病毒感染抗体鉴别诊断方法,分别以PRV变异毒株的gE或gB重组蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选所需单克隆抗体,获得6株抗PRV gE蛋白的单抗(3E6、7E1、7C5、10C3、15C1、14C1)和6株抗PRV gB蛋白的单抗(1C1、5D2、2F11、5G8、10C7、8H5)。IPMA检测结果显示,gE蛋白单抗能识别PRV变异毒株,但不识别疫苗株;而gB蛋白单抗可同时识别PRV变异毒株和疫苗株。gE单抗10C3和gB单抗10C7的ELISA效价和IPMA效价均分别达1∶5×10~(5.0)和1∶8×10~(3.0)以上。所筛选出的单抗均不与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、流行性乙型脑炎病毒(JEV)等其他常见病毒发生交叉反应。gE蛋白和gB蛋白的表达及单抗的制备为PRV感染抗体与疫苗免疫抗体鉴别诊断(DIVA)试纸的研发奠定基础。     

O型口蹄疫泛亚毒株单克隆抗体的制备及抗原表位差异分析

用纯化的O型口蹄疫泛亚毒株免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP 2/0骨髓瘤细胞进行融合,经3次克隆和间接EL ISA筛选,获得了ⅢA 11、ⅢC 3和ⅢF 10 3株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过间接EL ISA测定,单抗效价为:细胞培养上清1∶160~1∶640,腹水为1∶5×104~1∶4×105;经EL ISA法测定,3株单克隆抗体均与泛亚株VP 1蛋白反应,而不与A型口蹄疫病毒VP 1蛋白反应;单抗的亚类鉴定结果表明,ⅢA 11和ⅢF 10分泌的抗体为IgG 1亚类,ⅢC 3分泌的抗体为IgG 2b亚类。单克隆抗体抗原识别位点分析结果表明,ⅢA 11与另外2种单克隆抗体的识别位点不同,而ⅢC 3和ⅢF 10的识别位点相近。     

抗猪瘟病毒NS3(p80)蛋白单克隆抗体的制备及其特性鉴定

在大肠杆菌Rosetta（DE3）中表达猪瘟病毒石门株NS3基因部分功能片段,以纯化的重组NS3（p80）蛋白免疫BALB／c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2／0进行融合,经间接ELISA筛选及3次连续克隆化获得了4株可分泌抗NS3单抗的杂交瘤细胞（2G7,2F11,5D2和6F11）,通过小鼠体内诱生法制备腹水,并对杂交瘤细胞和单克隆抗体的特性进行鉴定。结果表明,杂交瘤细胞染色体正常,抗体分泌稳定,单抗效价高,亲和力各不相同,Ig亚类鉴定均为IgGl。Western blot分析证明4株单抗均能与原核表达的NS3蛋白特异性结合,6F11株与真核表达的NS3蛋白有较强的特异性反应。     

中国黄牛重组PrPc成熟蛋白单克隆抗体的研制

将纯化的牛重组PrP^c成熟蛋白免疫PrP^c基因敲除小鼠（PrP^c-null mice)，利用淋巴细胞杂交瘤技术，经一次融合，共筛选出3株能稳定分泌针对中国黄牛PrP^c成熟蛋白特异单克隆抗体的杂交瘤细胞株4D5、5C10和3F3。免疫印迹试验表明；腹水单抗4D5、5C10和3F3均可特异识别重组中国黄牛PrP^c成熟蛋白。     

5种脑炎人兽共患病病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测流行性乙型脑炎病毒(JEV)、森林脑炎病毒(TBEV)、东方马脑炎病毒(EEEV)、西方马脑炎病毒(WEEV)和基孔肯雅病毒(CHIKV)5种人兽共患脑炎病病毒的多重RT-PCR方法,本研究根据GenBank登录的相关病毒基因序列设计特异引物,通过优化引物组合及PCR反应条件,建立可同时检测5种病毒的方法,扩增片段长度分别为411 bp(JEV)、945 bp(TBEV)、193 bp(EEEV)、545 bp(WEEV)和769 bp(CHIKV);该方法具有良好的特异性,对病毒核酸最低检测拷贝数分别为7.1×103、3.6×103、2.2×103、5.6×103和5.1×103.该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便等优点,为以上5种人兽共患脑炎病病毒提供快速检测手段.     

鸡痘母源抗体对重组鸡痘疫苗免疫效果的影响

为了检测抗鸡痘病毒母源抗体对喉气管炎重组鸡痘疫苗的影响,孵化一批来自禽痘病毒高免母鸡的雏鸡,采用ELISA方法检测鸡痘疫苗免疫鸡后代的血清抗体。检测结果表明,雏鸡自孵出2d开始,血清鸡痘病毒抗体水平就开始缓慢下降,到15日龄时下降至临界值,已有部分鸡开始出现抗体阴性反应;到21日龄时,全部被检血清抗体水平均转为阴性。分别于不同日龄对试验雏鸡免疫接种重组鸡痘疫苗,结果只有当鸡体内的鸡痘病毒母源抗体全部为阴性(21日龄)后免疫时才能产生可靠的保护作用,保护率达到80％以上。这说明鸡痘病毒母源抗体对重组鸡痘疫苗的效果有一定的影响,因此重组疫苗合理的首免时间应选择在3周龄以后。     

IBDV超强毒GX8/99株细胞适应毒及其鸡体回传毒的致病性、免疫原性比较

传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)的超强毒株GX8/99经在鸡胚成纤维细胞(CEF)上连续传代22代后,细胞适应毒株GXC23对鸡的致病性显著减弱,对4~6周龄SPF鸡的致死率从85%~90%,减为0~5%.将GXC23在96孔细胞培养板上经两次无限稀释法得到3个克隆病毒.在SPF鸡回传20代后,相应的毒株GX-2B20、GX-4B20、GX-5B20,对SPF鸡的致死率仍维持在0~5%.回传23代后,GX-2B23,GX-4B23免疫2周龄SPF鸡,3周后虽然能引起法氏囊一定程度的萎缩及点状出血,法氏囊髓质区淋巴细胞坏死和变性,而且,仍表现出明显的免疫抑制性,都能造成新城疫,禽流感(H9-和H5-)疫苗抗体水平的显著降低.但是二者却都可以诱导机体产生很高的抗体水平,可抵抗超强毒GX8/99的人工感染,保护率可达100%.     

表达红色荧光蛋白的重组鸭肠炎病毒的构建及鉴定

鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus, DEV),又称为鸭瘟病毒,是一种只感染雁形目禽类的疱疹病毒。DEV具有基因组大、非必需基因多、能插入外源基因的容量大、遗传稳定等优点,其庞大而复杂的基因组为外源基因提供了诸多可插入位点,以DEV为载体,成功表达了禽流感病毒HA蛋白_^[1]、鸭病毒性肝炎病毒VP0蛋白_^[2]、鸭坦布苏病毒E基因_^[3]以及鹅细小病毒VP2蛋白_^[4]。构建重组DEV的重要一步是将报告基因插入到基因组中,目前常用的报告基因有绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、红色荧光蛋白(RFP)以及LacZ报告基团。本研究用RFP报告基团插入DEV UL2基因中,获得表达红色荧光的重组病毒,一步生长曲线表明,RFP对DEV的生长无影响;连续传代12代,RFP能够稳定表达,为DEV载体研究奠定基础。     

Bovine coronavirus as the causative agent of winter dysentery: serological evidence.

Sera from 9 dairy herds with epizootic enteritis (winter dysentery) were examined for antibodies to bovine coronavirus (BCV) and bovine virus diarrhoea virus (BVDV). Cows in 8 of the 9 herds seroconverted to BCV alone, while the animals in the ninth herd, which showed severe symptoms of the disease, seroconverted both to BCV and BVDV. The BCV antibodies, which were present in high titres 1 year postinfection, were transferred to the offspring via the colostrum and were then detectable in sera of calves until these were approximately 5 months old. A serological survey of 549 Swedish heifers showed that 61% of the animals were reactors to BCV. The prevalence of seroreactors to BCV was equally distributed over Sweden but was commonly either high or low in herds. In conclusion, BCV is commonly detected in animals suffering from winter dysentery. A co-infection with BVDV appears to aggravate the disease.     

用中和免疫过氧化物酶试验检测牛血清中BVD/MD病毒

用中和免疫过氧化物酶试验检测内蒙、北京送检的26份牛血清中BVDV,检出阳性14份,将其中3份用荧光抗体法检测BVDV,均为阳性。试验表明,中和免疫酶试验用于BVDV检测前景广阔。     

体外培养细胞中特异反义RNA表达对猪瘟病毒增殖的抑制作用

应用免疫荧光抗体技术检测了整合有猪瘟病毒反义基因的ＰＫ－１５细胞克隆对猪瘟病毒的抑制效应。结果表明，５个不同的反义基因片段对猪瘟病毒的抑制效率存在很大的差异，其中Ａ片段的抑制效率最高（９４％～９８％），Ｂ片段次之（５８％～７６％），Ｃ片段再次（６４％以下），Ｄ片段和Ｅ片段未见明显的抑制效应。抑制效率的差异可能与反义基因片段的位置、长短以及反义ＲＮＡ表达质粒载体有关。     

免疫抑制鸡群鸡传染性贫血病毒和网状内皮增生症病毒共感染检测

分别用digoxigenin标记的鸡传染性贫血病毒（CAV)和禽网状内皮增生症病毒（REV）核酸探针以及PCR技术对某种鸡场进行检测，检测结果表明，在20个样品中，CAV和REV感染的阳性率分别为10％和5％，这一结果显示，CAV和REV感染是导致该鸡场发生免疫抑制的主要病因之一。