几种病毒与禽病原性大肠杆菌的人工联合感染

以2种剂量的低致病性禽流感病毒(lowly pathogenic avian influenza virus,LPAIV)，传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus,IBV)疫苗株H120和H52，新城疫病毒（Newcastle disese viurs,NDV)Lasota株分别于气管内注射10日龄易感鸡，2d后，气管注射禽病原性大肠杆菌O37株（O78），连续观察5d，结果，除LPAIV单独感染组有6．25％的死亡率外，其余各病毒单独接种组均健活；大肠杆菌O37株单独接种组的死亡率为62．50％，较高剂量的LPAIV，IBV H120和H52，NDV Lasota株与大肠杆菌O37株有效强的协同致病作用，死亡率分别达到81.25%,100.00%,93.75%和87.50%，而较低剂量的上述病毒则无明显的协同作用，IBV，NDV疫苗株与大肠杆菌联合接种组的多数死亡鸡病程推迟。     

实验性鸡大肠杆菌病病理学动态变化

用致病性大肠杆菌O18分离株和／或低致病性禽流感病毒（Mildly pathogenic avian influenza virus ,MPAIV)接种10－12日龄SPF鸡。在接种后1－96h进行临床症状与大体病理变化、组织学观察发现：大肠杆菌接种组、MPAIV接种组和健康接种组除扑杀鸡外未见鸡死亡，MPAIV与大肠杆菌混合接种组除扑杀鸡外死亡率为24％。混合接种组的病变比大肠杆菌接种组出现的时间早，恢复也慢，各脏器的病理变化更严重。MPAIV主要引起各实质器官的坏死，结果表明，大肠杆菌经气管内接种后试验鸡主要表现为呼吸道的炎症反应；MPAVI可使鸡大肠杆菌病严重化。     

不同宿主源NDV毒株对SPF鸡致病性研究

为阐明不同宿主及不同基因型新城瘦病毒(NOV)对SPF鸡致病性,选择分离自鸡、番鸭、鹅、健康野鸟的基因VIId亚型NDV 6株,鸡源基因Ⅲ型和鸽源基因VIb型毒株各1株,以及基因Ⅸ型强毒F48E9,共9株NDV毒株进行致病性试验.在对各毒株的EID50及主要致病指数MDT、ICPI测定基础之上,以相同剂量感染15日龄SPF鸡,观察临床症状及剖检病变,计算发病率和死亡率,并在攻毒后不同时间采集主要组织样品.以SYBR Green I Real-time PCR检测病毒最早出现时间及病毒载量.结果表明,6株基因VIId亚型NDV毒株导致SPF鸡100%发病,死亡率90%以上,属于高致病性毒株;基因Ⅲ、VIb型毒株导致SPF鸡发病但不死亡,属于中等毒力毒株.VIId亚型毒株与F48E9株攻毒后SPF鸡在病理变化、组织嗜性及病毒载量上没有显著差异.根据毒株的MDT、ICPI指数及攻毒鸡病程综合判断,VIId亚型毒株在致病性上与F48E9株差异不显著.健康野鸟携带基因VIId亚型高致病性NDV,在NDV的自然生态传播过程中起重要作用,提示应该加强对野鸟的流行病学监测及相关研究.     

NDV和IBV感染对肉鸡大肠杆菌病发病的影响

为了解新城疫弱毒苗和传染性支气管炎弱毒苗接种对肉鸡大肠杆菌病发病的影响。对8日龄肉仔鸡用不同剂量NDVclone-30株或IBV-H120株进行滴鼻及饮水,48h后相同途径接种2株不同“O”血清型的致病性大肠杆菌。结果表明,致病性大肠杆菌单独接种鸡死亡率在20%-25%之间,而NDVclone-30株或IBVH120株与致病性大肠杆菌联合接种鸡死亡率有明显增加达40%-75%。     

实验性鸡大肠杆菌病的超微动态病理变化

10～ 12日龄 SPF鸡 180只 ,随机分为 4组 ,分别气管内注射致病性大肠杆菌 O18分离株 (大肠杆菌接种组 )、低致病性禽流感病毒 (mildly pathogenic avian influenza virus,MPAIV) H9N2株 (MPAIV接种组 )、先接种 MPAIV再接种大肠杆菌 (混合接种组 ) ,并设健康对照组 ,分别于接种后不同时间 ,取气管、肺、气囊、胸腺、法氏囊、脾、肝和肾组织 ,制作超薄切片 ,电镜观察。结果表明 ,MPAIV与大肠杆菌混合接种组比大肠杆菌接种组出现病变的时间早、恢复慢 ;在大肠杆菌接种组 ,接种后 3h气囊上皮和间质细胞中都可见典型的大肠杆菌 ;在混合接种组 ,接种后 3h,气囊间质细胞的吞噬泡中可见多个 MPAIV粒子。由此认为 ,MPAIV可使鸡大肠杆菌病严重化 ,大肠杆菌对 MPAIV的入侵和在鸡体内的复制可能有促进作用。     

不同宿主源NDV毒株对SPF鸡致病性研究

为阐明不同宿主及不同基因型新城疫病毒（NDV）对SPF鸡致病性,选择分离自鸡、番鸭、鹅、健康野鸟的基因Ⅶd亚型NDV6株,鸡源基因III型和鸽源基因Ⅵb型毒株各1株．以及基因Ⅸ型强毒F48E9,共9株NDV毒株进行致病性试验。在对各毒株的EID50及主要致病指数MDT、ICPI测定基础之上,以相同剂量感染15日龄SPF鸡,观察临床症状及剖检病变,计算发病率和死亡率,并在攻毒后不同时间采集主要组织样品,以SYBR Green I Real-time PCR检测病毒最早出现时间及病毒载量。结果表明,6株基因Ⅶd亚型NDV毒株导致SPF鸡100％发病,死亡率90％以上,     

转移因子联合La Sota株免疫对NDV F48E9株强毒重复感染鸡的保护作用

为了解猪脾转移因子(transfer factor, TF)对新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)La Sota弱毒疫苗株免疫效果的影响,本研究采用10^5.17 EID₅₀ La Sota株单独免疫(单独免疫1组)或与TF联合免疫(联合免疫1组)SPF鸡,14 d后以10^4.7 ELD₅₀ F₄₈E₉株首次攻毒,设立对照1组(非免疫/首次攻毒),首次攻毒14 d后以10^9.1 ELD₅₀F₄₈E₉株二次攻毒,设立对照2组(非免疫/非首次攻毒/二次攻毒)和空白1组(非免疫/非攻毒),通过淋巴细胞增殖率测定法、血凝抑制试验、荧光定量RT-PCR方法检测T淋巴细胞转化水平(PHA-P SI)、B淋巴细胞转化水平(LPS SI)、新城疫(ND)抗体效价、病毒血症、排毒与主要组织的F₄₈E₉株感染情况。...     

猪脾转移因子提高LaSota株鸡新城疫弱毒疫苗的免疫保护率

旨在了解猪脾转移因子（TF）对新城疫病毒（NDV）弱毒疫苗LaSota株的免疫增强效果及机制。本研究分别采用不同剂量（10^-2、10^-3、10^-4、10^-5羽份） LaSota疫苗株单独（单独免疫组）、LaSota疫苗株与TF联合（联合免疫组）免疫SPF鸡,14 d后以NDV F₄₈E₉强毒攻毒,同时设立对照组（非免疫攻毒）和空白组（非免疫非攻毒）,并采用ELISA方法与蛋白质芯片技术分别测定外周血IL-4、IFN-γ与IL-12 P40浓度。结果显示,鸡免疫10^-2、10^-3、10^-4、10^-5羽份时疫苗攻毒保护率和半数保护量（PD₅₀）如下：单独免疫组分别为100%、55%、0%、0%和0.000 8羽份,联合免疫组分别为100%、75%、0%、0%和0.000 5羽份,对照组和空白组死亡率分别为100%和0%。免疫10^-3羽份疫苗后,联合免疫组IL-4和IFN-γ含量均高于其他组,并于第7、14天差异极显著（P<0.01）;攻毒后,联合免疫组IL-4、IFN-γ和IL-12 P40含量均高于其他组,IL-4于第1、14天,IFN-γ于第1、3天,IL-12 P40于第1天差异极显著（P<0.01）。综上表明,TF可增强IFN-γ、IL-12介导的细胞免疫和IL-4介导的体液免疫,提高LaSota株弱毒疫苗的免疫保护率,降低疫苗PD₅₀;在抵抗NDV F₄₈E₉强毒攻击时,联合免疫组的免疫保护率明显高于单独免疫组。     

传染性法氏囊病病毒及新城疫病毒对鸡感染埃希氏大肠杆菌的影响

鸡染性法氏囊病(IBD)弱毒冻干苗与大肠杆菌共同接种组发病率和死亡率均为7%;新城疫(ND)Ⅳ系冻干苗与大肠杆菌共同接种组发病率和死亡率均为7%;单独大肠杆菌接种组发病率和死亡率均为13%,两种疫苗与大肠杆菌共同接种组发病率为33%;死亡率为20%.结果说明.IBD弱毒或ND Ⅳ系冻干苗接种对鸡感染大肠杆菌无影响;两种疫苗联合接种则大肠杆菌对鸡的致病性增强。IDB野毒和大肠杆菌共同接种组发病率为47%,死亡率为27%;隐性ND野毒和大肠杆菌共同接种组发病率为27%,死亡率为20%;IBD野毒、ND野毒和大肠杆菌共同接种组发病率为47%,死亡率为33%;单独IBD野毒接种发病率为33%,死亡率为20%;单独ND野毒接种组发病率为27%,死亡率为13%;单独大肠杆菌接种组发病率和死亡率均为13%。结果表明,IBD病毒、隐性ND野毒可以明显增加大肠杆菌对鸡的致病力,尤以HBD病毒明显.     

鸡胚母源抗体对新城疫Lasota毒株繁殖的干扰及克服方法

鸡胚中过高的母源抗体会干扰Lasota毒株的繁殖。本试验结果证明,当母源抗体＞26时种毒（EID50 108.5,HA 210）稀释1×103-5×103倍;母源抗体平均24左右时,种毒稀释5×103-1×104倍;母源抗体降至23左右时,种毒稀释倍数1×104-1×105为宜。按以上方法接种鸡胚,所收毒液效价最高。     

致病性水貂肠炎病毒MEV-ZJ1株的分离与鉴定

自临床疑似水貂病毒性肠炎发病貂的粪便中分离出1株病毒,经病毒形态观察、理化特性检测、血清学、聚合酶链式反应（PCR）和动物试验鉴定表明,该分离毒为水貂肠炎病毒（mink enteritis virus,MEV）,命名为MEV-ZJ1株。用分离毒接种水貂,试验动物均表现出典型水貂病毒性肠炎临床症状。研究表明,MEV-ZJ1分离株对水貂具有致病性,是1株强毒,为进一步开展该病毒流行病学、致病机理、疫苗免疫与诊断检测的研究奠定了基础。     

新城疫病毒糖蛋白致病作用的研究

本实验以分子生物学和现代免疫学方法,对新城疫病毒（ＮＤＶ）中国毒株Ｆ４８Ｅ９和ＬａＳｏｔａ等毒株的糖蛋白的致病作用进行了探讨。结果表明,ＮＤＶ Ｆ和ＨＮ蛋白为糖蛋白,强弱毒株之间Ｆ蛋白裂解位点的氨基酸序列有明显的不同,并决定了毒株的毒力,但ＮＤＶ的致病作用尚需ＨＮ、Ｆ蛋白的协同作用,单一的Ｆ或ＨＮ蛋白不能构成ＮＤＶ的致病作用。     

猪源脑心肌炎病毒GXLC株对小鼠的致病性试验

为研究猪源脑心肌炎病毒(EMCV)GXLC株对小鼠的致病性,将其接种4周龄健康BALB/c小鼠,观察临床症状,检查病理变化,测定心重/体重比值,检测心脏、脑、脾脏组织及血清中病毒含量,检测心脏、脑、脾脏组织中细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平及血清中IL-1β、TNF-α蛋白含量。结果显示,感染小鼠出现明显的临床症状,感染后第4天开始死亡,第5~7天死亡达到高峰;心脏、脑出现典型的大体病理变化和组织病理学变化,心重/体重比值显著升高、组织病理学炎症分值显著增加;感染后第1天即可在心脏、脑、脾脏及血清中检测到大量病毒,直至第14天仍能检测到病毒;血清中IL-1β、TNF-α蛋白含量显著升高,心脏、脑、脾脏组织中IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平显著上调,而且细胞因子表达的高峰期与出现明显临床症状、严重病理损害及死亡高峰期密切相关。结果表明,猪源EMCV GXLC株对小鼠具有高度致病性,IL-1β、TNF-α、IL-6等促炎细胞因子在EMCV对小鼠的致病机制中发挥重要作用。     

Pathogenic Analysis of Two Strains of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

Samples of sick pigs suspected of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) infection were collected from Hebei and Fujian provinces in China in 2016. Studies were carried out to investigate the variation characteristics of the isolated virus strains.The virus isolates were propagated in Marc-145 cells and caused syncytial cytopathic effect. RT-PCR and indirect fluorescent assay (IFA) results showed that the isolates were HP-PRRSV and hence designated as PRRSV CZ16A and NP16A, respectively. In order to study the pathogenicity of CZ16A and NP16A, the isolated strains were purified by plaque-isolation, and then inoculated to 60-days-old healthy pigs, which were negative in both of PRRSV infection and antibody. Clinical observation, histopathological changes and viremia detection were carried out to evaluate the pathogenicity of these two strains of PRRSV. Results showed that both isolates could replicate in pigs and cause a high body temperature, but these two strains of PRRSV isolates could not cause morbidity or mortality in experimental animals.Autopsy results also showed that NP16A could cause consolidation of the lung, lymph node enlargement in tested animals, suggesting that its virulence was a little stronger than CZ16A.     

2株猪繁殖与呼吸综合征病毒的致病性分析

为追踪猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）分离株的变异特点,本研究于2016年从河北和福建疑似猪繁殖与呼吸障碍综合征（PRRS）发病猪场采集病料,接种Marc-145细胞,产生合胞体样细胞病变,RT-PCR和间接免疫荧光试验鉴定为HP-PRRSV,将其分别命名为PRRSV CZ16A和NP16A。为研究PRRSV分离株CZ16A和NP16A对猪的致病性,将分离毒株经噬斑纯化后分别接种PRRSV抗原、抗体双阴性的60日龄健康仔猪,通过临床观察、解剖病理变化及病毒血症检测等指标初步探讨两株PRRSV的致病性。结果表明,分离株CZ16A和NP16A感染猪后均能够在动物体内复制,并引起体温升高,但两株PRRSV分离株均未引起试验动物的发病和死亡,剖检结果显示NP16A分离株能引起动物肺部实变、淋巴结肿大,其毒力比CZ16A分离株稍强。     

一种鉴别尼帕病毒和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重荧光RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速、敏感和特异地鉴别尼帕病毒(NiV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的检测方法,本试验以NiV M基因和HP-PRRSV nsp2基因为靶序列,通过优化反应条件建立了一种二重荧光RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、定量线性范围、敏感性和重复性进行了评价及初步应用.结果显示,用该方法检测NiV M基因和HP-PRRSV nsp2基因的RNA标准对照(NiV-M-RNA和HP-PRRSV-nsp2-RNA),线性范围分别为4.6×10¹~4.6×10⁷和4.1×10¹~4.1×10⁸拷贝/μL;最低检出限分别为46和4.1拷贝;该方法组内试验和组间试验的变异系数均小于2.0%,显示出良好的可重复性;该方法仅对NiV和HP-PRRSV呈现特异性扩增曲线,不与猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪流感病毒(SIV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)发生交叉反应.用该方法对236份猪实际样品进行NiV和HP-PRRSV核酸检测,所有样本的NiV检测结果均为阴性,8份样本的HP-PRRSV检测结果为阳性.本研究建立的方法为猪实际样本中NiV和HP-PRRSV的鉴别检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段.     

Establishment of a Duplex Real-time RT-PCR Assay for the Differential Detection of Nipha Virus and Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

To establish a rapid,sensitive and specific assay for the differential detection of Nipah virus (NiV) and highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV),a duplex Real-time RT-PCR was developed with specific primers and probes targeting to the special sequences of NiV M gene and HP-PRRSV nsp2 gene by optimization of reaction conditions.The performance of the assay was linear ranging from 4.6×10¹ to 4.6×10⁷ copies/μL for RNA standard control of NiV M (NiV-M-RNA) and from 4.1×10¹ to 4.1×10⁸ copies/μL for RNA standard control of HP-PRRSV nsp2 (HP-PRRSV-nsp2-RNA),and detection limits of the assay was 46 copies for the NiV-M-RNA and 4.1 copies for the HP-PRRSV-nsp2-RNA,respectively.The coefficients of variation (CVs) of both inter-assay and intra-assay repeatability were less than 2.0%,showing good repeatability.The assay was able to specifically detect NiV and HP-PRRSV simultaneously without cross-reaction with classical swine fever virus (CSFV),porcine epidemic diarrhea virus (PEDV),swine influenza virus (SIV),porcine parvovirus (PPV),pseudorabies virus (PRV) and porcine circovirus type 2 (PCV2).Of the 236 samples from pigs for both NiV and HP-PRRSV detection by the established assay,all the samples were negative for NiV,8 samples were HP-PRRSV positive.In conclusion,this assay offers a useful approach for the differential detection of NiV and HP-PRRSV in clinical specimens from the pigs.     

H5N1亚型高致病性禽流感病毒对鸽的致病性分析

为评估H5N1亚型禽流感病毒对鸽的致病性,用我国2004年分离的一株H5NI亚型禽流感病毒A/pigeon/GD/C2/2004( H5NI)人工感染4周龄鸽,进行了致病性试验.结果表明,该株病毒以106EID50/I00μL剂量感染能致死鸽,致死率为22.2％,病毒能在感染鸽体内广泛分布,其中肺脏和肾脏中病毒含量达到...     

病毒样颗粒内标在荧光定量RT-PCR检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒方法中的应用

为建立对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（H-PRRSV）快速准确的检测方法,本试验构建兽医临床用病毒样颗粒内标表达载体,制备检测H-PRRSV的病毒样颗粒内标。在H-PRRSV Nsp2基因保守区域设计了1对特异性引物和1个TaqMan荧光探针,通过对反应体系和扩增条件的优化,建立了检测H-PRRSV的荧光定量RT-PCR检测方法;将MS2噬菌体的成熟酶蛋白和衣壳蛋白基因序列定向插入pET-32a载体的相应位置,在载体下游插入人工合成包含引物和探针的内标基因序列,采用双酶切和PCR鉴定阳性质粒,将阳性质粒转化大肠杆菌BL21工程菌,IPTG诱导表达,制备了病毒样颗粒内标。试验结果表明,所建立的方法特异性强,灵敏度高,对8份已知病毒的检测结果显示特异性为100%,检测滴度为1 TCID₅₀/mL病毒液,对42份临床样本的检测结果与农业部备案试剂盒检测结果完全一致,体现了较好的实用性。     

巴马小型猪对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的敏感性评价

为评价巴马小型猪对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的敏感性,本研究选择PRRSV抗体阴性的16头巴马小型猪和17头本地二元杂交猪作为研究对象,分别分为低剂量接毒组、高剂量接毒组、对照组1和对照组2,低剂量、高剂量接毒组肌肉注射接种PRRSV NVDC-JXA1强毒株,对照组1和接毒组混合饲养,对照组2分开饲养作为空白对照。接毒后每天测量体温,观察精神、食欲、死亡等情况,死亡动物剖检病变,攻毒后每隔7d采血用RT-PCR法检测病原,连续观察21d。结果绝大部分猪体温升高到41℃以上,且有3个以上温次,所有接种及混养动物都死亡,巴马小型猪死亡时间在8d~17d,二元杂交猪在7d~13d,死亡动物出现肺充血、出血、实变,扁桃体、淋巴结、肝脏、肾脏、皮下有出血等症状,病原RTPCR检测为阳性,说明攻毒动物死于HP-PRRS,表明巴马小型猪对PRRSV NVDC-JXA1强毒株非常敏感,可用于PRRS活疫苗的检验。