内生真菌DC-11的分离筛选及对致病疫霉的抑制作用

为了获得对致病疫霉有拮抗作用的植物内生真菌,采用常规的分离方法从健康的芹菜及大葱植株中分离内生真菌,并以对峙培养法筛选对致病疫霉有较强抑制作用的菌株。结果显示:分离获得的41株内生真菌与致病疫霉对峙培养后,有11个菌株的抑制率达到50%以上,以QC-18的抑菌率最高(84.21%),其次是QC-13(79.90%);无菌体发酵液活性表明DC-11菌株的抑菌作用最强(84.6%),其次是DC-1(62%);进一步试验发现,经较高浓度(1.91mg/mL)DC-11菌株的发酵液处理后的致病疫霉菌不能恢复生长,在马铃薯块茎切片上也失去了致病能力;镜检发现在0.51mg/mL浓度处理下菌丝体形态明显发生畸变。这些结果表明DC-11菌株在未来防治马铃薯晚疫病方面有一定的应用潜力。     

大豆疫霉病拮抗内生真菌的鉴定与筛选

[目的]筛选出拮抗致病大豆疫霉的真菌菌株,为深入研发生物菌剂提供依据。[方法]采用平板对峙法测定40株野生大豆真菌对疫霉菌的抑制作用。[结果]供试的40株菌株,不同菌株间菌落型态差异较大。从光滑程度分析,36份菌落表面不光滑,3份表面光滑并显浅黄色;从菌落颜色分析,正面以白色为主,其次是黄色和粉色;反面则以紫色为主,其次为黑色和绿色;从菌落生长型态分析,大多数菌落呈白色絮状突起或羊毛状菌丝;11株野生大豆内生真菌的抑菌率变化幅度为62%~81%,80%以上共1株Y4-S(Ⅰ),75%~80%共2株,70%~75%共3株,其余5株均低于70%。抑菌率从大到小依次为Y4-S(Ⅰ)、Y5-r(Ⅱ)-1、Y6R-15-1、Y1-r-3和Y5R4、Y6S-26、Y5LB、Y5r-12、Y2-5(Ⅱ)、Y2-S、Y5R18-2-1。[结论]最强拮抗菌株Y4-S(Ⅰ)、Y5-r(Ⅱ)-1、Y6R-15-1显微型态相似,呈枝状,有隔,初步判断可能来源同一属,具体属种需要进一步判断。     

玉米内生真菌的分离与鉴定

对不同品种的玉米种子及不同地区、不同部位的玉米内生真菌进行分离和鉴定。结果显示,8个不同品种的玉米种子,内生真菌检出率为25%,不同玉米品种的种子内所含的内生真菌种类和数目都不同,最高的检出率为40%,最低的检出率为10%。从玉米种子中分离得到的92个菌株,经形态学鉴定,分别属于14个属,出现频率最高的是木霉属,为34.78%。从不同地区的玉米组织中一共分离得到内生真菌168株,其中10株未产孢的没有鉴定,其他菌株经形态学鉴定分别属于26个属,以青霉属、曲霉属、头孢霉属为主,占内生真菌分离物总数的41.07%。对形态学鉴定为白僵菌属的10个菌株进行分子鉴定,均确定为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)。此外,球孢白僵菌作为玉米的内生真菌,在国内还是首次分离得到。     

寄生线虫真菌黑葡萄穗霉的分离与鉴定

利用水琼脂平板撒土——腐生线虫诱导法从根结线虫危害的作物根际土壤分离到一株线虫寄生真菌.PDA平板上形态观察显示,菌落黑色凸起,气生菌丝较多,分生孢子梗伞状,产孢结构为瓶状小梗,分生孢子椭圆或近圆形,未成熟孢子光滑,深棕色到黑色,成熟时黑色有棘.经分子鉴定,该菌为黑葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum...     

金银花中产绿原酸内生真菌的分离与鉴定

以不同产区金银花的不同部位为材料,采用组织块法对金银花内生真菌进行分离鉴定,并结合TLC法和HPLC法对菌株发酵液进行定性分析.结果表明,共分离得到内生真菌80株,分属于5目、5科、10属,筛选出3株产绿原酸的菌株,均属于链格孢属.金银花中存在着丰富的内生真菌,不同产区及不同部位间内生真菌的种类和数量均存在差异,河南新密产绿原酸活性菌株较多.     

致病疫霉酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

致病疫霉是引起马铃薯晚疫病的重要病原菌,在全世界范围内造成了严重的经济损失。以2种不同致病力的致病疫霉菌株侵染马铃薯叶片5个时间点的混合菌丝样品作为cDNA文库的材料来源,利用Gateway法分别构建了初级文库与次级文库,初级文库与次级文库的库容量分别为1.60×10⁷、1.52×10⁷ CFU,插入片段长度大多在1 000～2 000 bp之间,重组率均达到100%。次级文库质粒转化酵母菌构建酵母文库,所得酵母文库滴度为1.00×10⁸ CFU/mL,转化效率为6×10⁸ CFU/μg。结果表明,本研究构建的酵母双杂交cDNA文库质量较高,完全可以满足互作蛋白高质量、高效率筛选的要求。该文库为后续深入解析致病疫霉的致病机制奠定了基础。     

马铃薯致病疫霉EST—SSRPCR反应体系的优化

由致病疫霉（Phytophthora infestans Montagne de BaT）引起的马铃薯晚疫病是危害马铃薯生产的最严重病害。试验以致病疫霉菌株HH06—23为模板,以Pi08N为引物,研究致病疫霉EST—SSR PCR反应体系中各主要成分和退火温度对扩增结果的影响。优化后的PCR反应体系为：25ng模板DNA,0．5mmol·L^-1。dNTPs,2μL 10×Buffer（Mg^2＋ Free）,1．75mmoL·L^-1 MgCl2,15pmol引物,1．2U Tap DNA聚合酶,加ddH2O至20μL;同时确定引物退火温度为63℃。PCR体系稳定性试验结果表明,优化后的致病疫霉EST—SSR PCR反应体系稳定、可靠．适合进行致病疫霉群体遗传多样性研究。     

一株来自红树内生拮抗真菌的鉴定

红树内生真菌在病害的生物防治方面有重要作用。本研究从秋茄的叶片和茎部共分离获得15株内生真菌,经对峙培养试验,有61.54%的菌株对目标病原菌蓖麻枯萎病菌有拮抗作用,其中从叶片组织中分离的内生真菌菌株MKA-5作用最明显。经形态学研究显示,该菌株菌落浅灰色至深灰黑色。分生孢子暗褐色,倒棒形或椭圆形,多数无喙,有纵横隔膜,分隔处溢缩,壁光滑,大小为7.0-18.5×3.0-8.8 μm,形态特征与链格孢 (Alternaria alternata)一致。进一步对该菌株的分子生物学研究,结果表明该菌株的ITS系列与链格孢模式菌株的同源性为100%。综合分析,拮抗菌株MKA-5鉴定为链格孢(A. alternata)。该菌株的鉴定对蓖麻枯萎病的生物防治有重要作用。     

3种拮抗烟草疫霉及产IAA内生细菌的分离鉴定

为挖掘河南省洛阳地区烟株体内的内生细菌功能菌株,以期开发优良生防菌剂。采用稀释涂布平板法分离纯化烟株各生育时期内生细菌菌株,采用平板对峙法、生长速率法测定内生菌株对烟草疫霉的抑制作用,紫外分光光度计法测定菌株产生IAA的水平。对筛选出的功能内生菌株进行形态学、生理生化鉴定及16S rDNA、gyrB序列分析鉴定,并测定对种子萌发的促生作用。结果表明,筛选出的12株内生菌株的鉴定结果为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7株,沙福芽孢杆菌(B.safensis)4株,奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)1株。芽孢杆菌属占菌株总数的91.67%,其中菌株LYYY63-1、LYRY39-1、LYSX141具有较强的抑制活性,对烟草疫霉的抑菌率分别为88.10%、84.55%和73.33%;沙福芽孢杆菌菌株LYYY61-2、LYYY117对烟草疫霉的抑菌率达62.10%、64.72%;奇异变形杆菌菌株LYRY45产IAA水平达11.06 mg/L,具有较高的产IAA水平。12株细菌对烟草7种病原真菌具有不同程度的抑制作用,抑菌谱广,对烟草种子根长和总长均有显著的促生...     

河南省烟草黑胫病菌生理小种鉴定

在河南省宜阳、登封、渑池等15个烟叶主产区分离到烟草黑胫病菌36个,采用TTZ颜色反应和游动孢子悬浮液注射接种鉴别寄主两种方法鉴定其生理小种类型。结果表明:36个菌株在TTZ培养基上均呈现红色反应,有32个菌株对L8和NC1071都有较强的致病力,将其鉴定为1号生理小种,占供试菌株的88.9%,为河南省烟草黑胫病菌的优势小种;其他4个菌株有1个菌株对L8无致病力,2个菌株对其致病力较弱,1个菌株对NC1071无致病力,生理小种类型尚未确定。     

分子伴侣4-苯基丁酸通过抑制内质网应激减轻寄生疫霉菌对植物的侵染

旨在利用内质网应激分子伴侣4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid, 4-PBA）探究内质网应激对疫霉菌侵染寄主植物的影响机制。以拟南芥与寄生疫霉菌的亲和互作为研究体系,分析野生型Col-0植株响应寄生疫霉菌侵染的鲜质量及生长表型变化以及4-PBA对其影响;利用实时荧光定量qRT-PCR技术分析4-PBA对内质网应激标记基因 BiP3的诱导表达以及寄生疫霉菌侵染植物的影响;通过4-PBA处理拟南芥幼苗和活体植株,分析其对植物生长表型的影响。结果表明,分子伴侣4-PBA作为内质网应激修复剂,在不影响植物正常生长的同时,不仅能够减轻寄生疫霉菌侵染引发的植物生长受阻和 BiP3基因的诱导表达等内质网应激标志性事件,还对寄生疫霉菌在植物体内的扩展和定殖具有抑制作用,从而减轻植物的感病性。研究结果有助于揭示内质网应激对植物与微生物互作的影响机制,也为开发新型药物靶点用于作物疫霉属卵菌病害的绿色综合防控提供了新思路。     

马铃薯 StBI-1 基因鉴定及其抗疫霉菌的功能探索

Bax inhibitor 1(BI-1）是真核生物中高度保守的细胞死亡调节因子,在植物响应生物与非生物胁迫中扮演重要角色。为探究BI-1是否参与马铃薯响应疫霉菌侵染的免疫应答,首先以拟南芥AtBI-1蛋白序列为模板在马铃薯蛋白数据库中进行BLAST检索。通过比对分析及构建系统进化树,鉴定到与AtBI-1相似度为77.22%的马铃薯蛋白NP_001305552.1,将编码该蛋白的马铃薯基因命名为 StBI-1 ;蛋白结构预测分析表明, StBI-1 包含7个跨膜域和Bax inhibitor-1-like家族结构域。利用实时定量PCR分析 StBI-1 基因在马铃薯响应致病疫霉菌侵染过程中的表达模式,并借助农杆菌介导的烟草瞬时表达体系初步探索 StBI-1 抗疫霉菌的生物学功能。结果显示, StBI-1 响应致病疫霉菌侵染而诱导上调表达,尤其是在侵染后期。同时,过表达 StBI-1 可显著增强本氏烟草对寄生疫霉菌和致病疫霉菌的抗性。综合以上结果,本研究对马铃薯 BI-1基因进行鉴定分析及克隆,并初步揭示 StBI-1 抗疫霉菌的生物学功能,为挖掘马铃薯抗晚疫病新型基因资源及深入解析其抗病分子机理奠定了理论基础。     

亚硝基谷胱甘肽还原酶 GSNOR1正调控植物对疫霉菌的抗性

疫霉属（ Phytophthora）卵菌引致马铃薯晚疫病等作物灾难性病害,严重威胁作物的可持续生产。由于病菌毒性变异,导致品种抗病性丧失问题突出。因此,挖掘植物广谱和持久抗病基因,并探索其在抗病育种中的有效利用具有重要的科学意义。亚硝基谷胱甘肽还原酶1（GSNOR1）是植物氮信号通路中高度保守的关键还原酶,其参与调节r基因介导的植物抗性和非寄主抗性。然而, GSNOR1参与抗疫霉菌的免疫功能和作用机理尚不清楚。本研究中,借助拟南芥与寄生疫霉菌互作的模式体系,首先发现拟南芥T-DNA插入突变体 gsnor1-3对寄生疫霉菌呈现感病表型。进一步利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）降低烟草叶片中 GSNOR1同源基因的表达量,在此基础上,通过抗病表型分析以及一系列抗性相关功能的检测,结果表明,沉默本氏烟草 GSNOR1同源基因能够在寄生疫霉菌侵染植物的过程中削弱植物体内的活性氧（ROS）迸发、病程相关基因（PR genes）的诱导表达以及MAPK信号转导,从而增强了植物对疫霉菌的感病性。本研究揭示了植物 GSNOR1对疫霉菌具有高度保守的抗性功能,并初步解析了 GSNOR1正调控植物抗疫霉菌的作用机理,为进一步探索 GSNOR1在马铃薯抗晚疫病中的功能及其在抗病育种中的有效利用奠定了重要的理论 基础。     

垃圾渗滤液暴露对拟南芥的毒效应研究

为研究垃圾渗滤液的综合毒性,通过盆栽实验探讨了渗滤液对拟南芥早期、成熟期和后期生长发育的影响。结果表明:垃圾渗滤液会影响拟南芥整个生命期的生长情况,低浓度(0.1%)、短时间(24 h)的渗滤液暴露会促进拟南芥早期的萌发及根系生长,分别为对照的256%和324%,而高浓度(10%)、长时间(≥48 h)暴露则产生抑制作用,48 h的抑制效应分别为对照的67%和36%;在相同暴露时间下,芽长随暴露浓度变化不明显,仅在48 h呈现出差异,说明拟南芥幼苗的根系比芽更为敏感。不同浓度的渗滤液还会影响成熟期拟南芥的生长发育,诱导叶片氧化损伤并呈现浓度和时间双重依赖性,进而损伤其抗氧化防御系统。此外,高浓度(20%)渗滤液对晚期阶段拟南芥抽薹率和角果数的抑制效应较为明显(P0.01),在暴露15 d后分别为对照的45%和43%。研究结果说明拟南芥可有效、简单、重复性地监测渗滤液的毒性,为渗滤液的植物监测提供理论依据。     

菜病清对辣椒疫霉病菌的室内毒力测定

采用生长速率法对陕西省农业科学院新农药研究开发中心最新研制的高效、低毒防治蔬菜病害杀菌剂菜病清进行了室内毒力测定试验。结果表明,菜病清对辣椒疫霉病菌的增效系数为１７２．２１,明显大于１００,说明菜病清对辣椒疫霉病菌的毒效明显大于其有效成分单独使用时的毒效,增效作用显著。     

拟南芥At4g05060基因的酵母双杂交诱饵表达载体的构建、表达及自激活检测

为研究At4g05060基因功能,采用PCR扩增拟南芥VAMP(vesicle-associated membrane protein)家族基因At4g05060的ORF序列,定向克隆至酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7,经酶切鉴定并测序后将其转化至酵母Y187细胞;然后采用Western blotting技术分析At4g05060基因在酵母中的表达水平,通过缺陷型培养基培养进行自激活检测。结果表明,成功构建酵母诱饵表达载体pGBKT7-At4g05060,并在酵母细胞正确表达,表达产物对报告基因无自激活作用。     

盐芥和拟南芥根系IAA与GAs应答高浓度NaCl胁迫的比较研究

【目的】比较近缘植物盐芥和拟南芥在高浓度NaCl胁迫下根的生长情况及根中内源赤霉素(GAs)及生长素吲哚乙酸(IAA)的含量变化,为进一步研究盐生植物的耐盐机制提供理论依据。【方法】选取在MS培养基上生长约1周,转接后根长相近的盐芥和拟南芥幼苗进行NaCl胁迫(NaCl浓度拟南芥为0,50,100,150,200,250,300mmol/L,盐芥为0,50,100,150,200,300,500mmol/L),测定高盐胁迫下2种植物根系的生长情况。选取在MS培养基上生长1周,移栽到蛭石/珍珠岩(体积比1∶1)的培养基上继续培养4周的拟南芥和盐芥进行高浓度NaCl胁迫(NaCl浓度为150和300mmol/L),分别于0(对照),1,4,7,10d取根样,采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定2种植物根系内源激素GAs及IAA的含量。【结果】正常生长条件下,盐芥根系的生长速度低于拟南芥;高浓度NaCl胁迫下,盐芥与拟南芥根系的生长均受到抑制,但盐芥耐盐能力较强;高浓度NaCl胁迫下,盐芥和拟南芥根系IAA含量均呈现先下降后增加的变化趋势,而GAs含量则呈现不断增加趋势。【结论】盐芥和拟南芥均可通过积累内源IAA和GAs来应对高浓度NaCl胁迫,且盐芥在高浓度NaCl胁迫下IAA和GAs的积累量高于拟南芥。     

基于公共基因芯片的多农药代谢相关的拟南芥UGT基因挖掘

糖基转移酶1家族,也称尿苷二磷酸糖基转移酶(Uridine diphosphate glycosyltransferase,UGT),是植物解毒系统中最重要的多基因家族之一。该研究基于公共基因芯片数据对拟南芥(Arabidopsis thaliana)的106个UGT基因进行生物信息学分析,期望找到参与广谱农药代谢的UGT靶标。从NCBI数据库收集并重注释关于农药和除草剂安全剂处理的基因芯片数据,差异表达分析和聚类分析表明8个UGT在绝大部分农药处理中均显著转录上调,是重要候选基因。基因本体论(Gene ontology,GO)富集分析表明,候选UGT的共表达基因富集于植物4相代谢解毒过程,暗示这些UGT基因的广谱解毒能力。最后以候选UGT基因及其共表达基因构建共表达网络,发现网络中的桥接节点也参与了植物解毒过程,表明UGT76B4和UGT76B5是最关键的参与多种农药代谢的UGT基因。     

基于机器学习方法的拟南芥基因组DNA复制时间预测研究

【目的】基于机器学习方法,构建拟南芥基因组DNA复制时间分类器,探究与复制时间相关的表观遗传修饰,为进一步研究DNA复制时间的表观遗传调控机制提供参考。【方法】收集拟南芥全基因组的DNA复制时间数据和多种DNA表观遗传修饰特征(ChIP-Seq)数据,以及染色质开放状态(DNase-Seq)数据,先通过t-SNE初步对DNA表观遗传修饰特征数据降维来衡量DNA复制早晚的可预测性,并利用皮尔逊相关系数计算了多种DNA表观遗传特征与DNA复制时间信号两两之间的相关性,再通过构建随机森林、多类别逻辑回归和支持向量机3种分类器对DNA复制时间进行建模分析,以十折交叉验证和ROC曲线下的面积(AUC)为衡量指标,用80%的数据建模,20%的数据对模型效果进行验证。【结果】3种分类器对DNA复制时间都具有良好的预测能力,平均AUC均达0.8以上。DNA复制早期信号与RNA聚合酶Ⅱ结合信号以及染色质开放状态信号等呈正相关,而复制晚期信号则与其呈负相关。其中H3.1、H3.3、H2AW、H4K16ac、H3K36me3、H3K4me3均可能与DNA复制时间存在密切关系。【结论】拟南芥基因组DNA复制时间可以通过表观遗传修饰进行准确预测,其中对DNA复制晚期的预测最为准确;并发现了与DNA复制时间关系密切的组蛋白变体及表观遗传修饰。