烟草基因组中AGO蛋白的生物信息学分析

对在NCBI上登录的烟草AGO蛋白(argonaute proteins)的信息进行了整理,并对其组成成分、系统发育树、信号肽、跨膜结构域、细胞定位、亲水性/疏水性、蛋白质的二/三级结构等进行了预测和分析。结果表明:在烟草基因组中共有22个AGO蛋白,可分为8类;烟草的AGO蛋白与拟南芥的AGO一样在进化上分为3个分支,其编码的蛋白是一个无跨膜结构域、无信号肽/导肽的亲水性蛋白,α-螺旋散布于整个蛋白质中,具有PAZ和PIWI两个特征结构域。此外,烟草的AGO2/4/7/16/PNH1定位在细胞核中,AGO10定位在细胞质中,AGO5定位在线粒体中。     

烟草基因组中AGO蛋白的生物信息学分析

对在NCBI上登录的烟草AGO蛋白(argonaute proteins)的信息进行了整理,并对其组成成分、系统发育树、信号肽、跨膜结构域、细胞定位、亲水性/疏水性、蛋白质的二/三级结构等进行了预测和分析。结果表明:在烟草基因组中共有22个AGO蛋白,可分为8类;烟草的AGO蛋白与拟南芥的AGO一样在进化上分为3个分支,其编码的蛋白是一个无跨膜结构域、无信号肽/导肽的亲水性蛋白,α-螺旋散布于整个蛋白质中,具有PAZ和PIWI两个特征结构域。此外,烟草的AGO2/4/7/16/PNH1定位在细胞核中,AGO10定位在细胞质中,AGO5定位在线粒体中。     

黑尾叶蝉RNAi途径关键蛋白AGO2多克隆抗体制备及应用

[目的]制备效价高且特异性强的黑尾叶蝉RNAi途径关键蛋白Argonaute 2(AGO2)多克隆抗体,为进一步研究AGO2蛋白在叶蝉RNAi免疫途径中的调控功能及作用机制提供技术支持.[方法]通过RT-PCR从黑尾叶蝉基因组扩增出AGO2基因的功能片段,与原核表达质粒pET-28a重组构建重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行诱导表达;以纯化的AGO2融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔获得高效价的多克隆抗体,并以多克隆抗体为一抗,采用Western blotting检测AGO2蛋白在健康和带毒黑尾叶蝉中的表达情况.[结果]RT-PCR扩增获得的黑尾叶蝉AGO2基因片段为1635 bp,构建的pET-AGO2重组质粒能在BL21感受态细胞中成功表达出AGO2融合蛋白,其最适表达条件:温度28℃,IPTG浓度0.5 mmol/L,诱导时间5 h,摇床转速220 r/min.以纯化AGO2融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔获得的多克隆抗体效价为1:106,抗体浓度约350μg/mL.Western blotting检测结果表明,AGO2蛋白在健康和水稻矮缩病毒(RDV)感染黑尾叶蝉中均有表达,但与健康黑尾叶蝉相比,AGO2蛋白在RDV感染黑尾叶蝉中的表达水平更高,即RDV侵染能提高AGO2蛋白的表达水平.[结论]制备获得的黑尾叶蝉RNAi途径关键蛋白AGO2多克隆抗体具有高纯度和高效价,且特异性强,可用于检测AGO2蛋白在病毒感染黑尾叶蝉中的表达水平,进而揭示AGO2蛋白在介体昆虫RNAi途径中的功能机制.     

针对人蛋白激酶CK2α亚基的shRNA表达质粒的构建与鉴定

目的:构建针对人蛋白激酶CK 2α亚基的shRNA表达质粒。方法:以mU 6pro为载体,化学合成shRNA表达模板,并定向克隆到载体的U 6启动子下游,琼脂糖凝胶电泳法筛选阳性克隆,基因测序法检测插入模板序列的正确性。结果:获得了正确的重组质粒,插入的转录模板序列完全正确。结论:成功构建了针对人蛋白激酶CK 2α亚基的RNA i体系。     

高粱CBL家族基因的鉴定和初步分析

植物CBL家族基因在逆境响应过程中具有重要功能。本文利用生物信息学的方法,从高粱的基因组中鉴定出8个CBL基因,并对这些基因的染色体分布、序列特征、遗传进化和蛋白基序进行了系统分析。结果表明,高粱的CBL基因分为3个不同的进化类群,它们在基因组中的分布是不均匀的。高粱CBL基因预测编码的蛋白大多含有3个EF一手型结构,而且它们被预测定位在不同的细胞组分中。这些结果说明高粱CBL存在结构上的分化,可能它们的功能有所不同,这为进一步研究高粱CBL基因的功能以及利用它们进行高粱的分子育种改良奠定了基础。     

杨树TLP基因家族的生物信息学分析

[目的]分析预测杨树类甜蛋白(TLP)基因家族功能,为杨树TLP蛋白的差别研究、功能基因发掘及遗传性状改良提供理论依据.[方法]从Phytozome数据库搜索杨树TLP基因家族序列,并依据Pfam数据库进行筛选鉴定,利用生物信息学方法对其编码的蛋白氨基酸序列进行预测分析.[结果]从Phytozome数据库中筛选获得50个TLP基因家族序列,其编码的蛋白分子量10.19~74.09 kD,氨基酸数量98~672个,等电点(pI)4.15~9.12,大部分为亲水性蛋白和不稳定性蛋白,在细胞内外均有分布,并具有thaumatin蛋白家族的保守结构域,其中42个成员能形成与抑菌有关的酸性侧翼区域,且大多数成员具有FF motif结构和5个保守的REDDD氨基酸残基,但少数氨基酸残基发生改变.50个杨树TLP基因家族成员可分为4个进化组,各进化组成员的蛋白理化特性和亚细胞定位不完全一致,且功能域结构和motif结构也具有多样性,各进化组成员间差异与进化程度总体上呈正相关.根据motif结构和功能域结构可将所有成员分别分为7组和4组,但分组结果与系统发育进化结果并不完全一致.[结论]杨树TLP蛋白家族成员存在序列保守性和进化性,特异表达呈多样性,具有抗菌活性,但作用机制存在差异.     

小鼠CHD5基因siRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建小鼠染色质区解旋酶DNA结合蛋白5(CHD5)基因干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)重组腺病毒载体并在NIH3T3细胞中验证其干扰作用.方法:人工合成靶向CHD5的siRNA干扰序列,用分子克隆的方法插入到穿梭载体pSES-HUS上,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,得到pAdeasy-SES-HUS-CHD5siRNA重组质粒,在HEK293细胞中包装成重组腺病毒Adr-simCHD5,然后感染NIH3T3细胞,用RT-PCR和Western Blot方法检测其对CHD5mRNA和蛋白表达的干扰效果.结果:得到高滴度Adr-CHD5siRNA重组腺病毒,RT-PCR和Western Blot结果表明该重组腺病毒能有效地降低CHD5基因的表达.结论:成功构建Adr-CHD5siRNA重组腺病毒载体,并在NIH3T3细胞上实现CHD5基因表达抑制,为进一步研究CHD5基因功能奠定了基础.     

猕猴桃多胺氧化酶基因家族的鉴定及表达分析

通过鉴定猕猴桃多胺氧化酶（PAO）基因家族成员，分析其在猕猴桃果实生长发育、成熟及储藏过程中的表达变化，发掘与猕猴桃果实成熟、软化相关的重要候选基因，为调控猕猴桃鲜果的发育及采后保鲜提供参考。以拟南芥AtPAO、水稻OsPAO蛋白序列作为参考序列，利用BLAST程序分别从中华猕猴桃、毛花猕猴桃、软枣猕猴桃基因组或转录组中筛选和鉴定PAO家族成员；利用Compute pI/Mw分析蛋白质分子质量、理论等电点，利用SignalP-4.1、TMHMM-2.0预测信号肽和跨膜区，利用WoLF PSORT进行亚细胞定位预测；利用MEGA 6构建系统发育进化树，利用MEME进行保守基序分析，利用TBtools分析PAO基因的共线性关系；基于转录组数据和荧光定量PCR技术，分析PAO基因的组织表达情况及其在猕猴桃果实生长发育、成熟及储藏过程中的表达变化。结果表明，中华猕猴桃、毛花猕猴桃、软枣猕猴桃中各存在4、4、5个PAO基因，分别是AcPAO1—4、AePAO1—4、AaPAO1—5。AcPAO、AePAO位于中华猕猴桃、毛花猕猴桃的8条染色体上，基因长度为1 722～9 837 bp。AcPAO...     

胡萝卜4CL基因家族的鉴定及分析

旨在全基因组水平上鉴定胡萝卜 4CL基因，揭示该基因家族成员的理化性质、系统进化、基因结构、组织表达模式及胁迫响应情况，为胡萝卜 4CL的功能研究和利用奠定基础。基于AMP结合结构域(PF00501)的隐马尔可夫模型文件，利用HMMER软件对胡萝卜蛋白质数据库进行检索，获得胡萝卜 4CL基因(命名为 Dc4CL);利用ProtParam分析 Dc4CL的理化性质；利用MEGA6对Dc4CL进行系统进化分析；使用GSDS2.0、MEME分析 Dc4CL的基因及蛋白结构；利用荧光定量PCR技术对 Dc4CL的组织表达模式及胁迫响应情况进行研究。结果表明，胡萝卜基因组中存在12个 4CL基因，分别为 Dc4CL1～ Dc4CL12。 Dc4CL基因开放阅读框(ORF)长度为1 350～3 363 bp,编码蛋白质长度为449～1 120 aa,编码蛋白的分子质量和等电点分别为48.92～123.73 ku和5.34～8.82。系统进化分析表明，Dc4CL与其他来自水稻、拟南芥、二穗短柄草、高粱、大白菜的4CL蛋白可分为两个类群。结构分析表明， Dc4CL基因外显子数目为4～11个，其蛋白序列...     

靶向猪瘟病毒NS3基因shRNA干扰载体的构建与鉴定

利用RNA干扰在线生物学软件分析猪瘟病毒NS3基因,设计针对NS3基因不同位置的小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列(其结构特征为正链(19nt)-环(9nt)-负链(19nt))。化学合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定向克隆到干扰载体中,构建重组载体pGene-NS3-1,pGene-NS3-2和pGene-NS3-3,转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对转化产物进行kan+筛选,碱裂解法提取重组质粒,将酶切鉴定为阳性的质粒测序。结果显示,双链干扰片段克隆方向正确,序列中未出现核苷酸的插入,缺失等突变现象。表明靶向猪瘟病毒NS3基因shRNA干扰载体构建成功。     

猕猴桃 AcNPR1基因克隆及抗病响应表达分析

为探究猕猴桃 AcNPR1基因在抗病响应中的作用及其在不同抗性猕猴桃品种间抗性差异机制,以高感病品种‘红阳’和抗病品种‘徐香’猕猴桃叶片为材料克隆 AcNPR1基因序列;利用ExPASy-ProtParam tool、MEGA 7.0 等对‘红阳’AcNPR1蛋白的理化性质进行分析、亚细胞定位进行预测、进化关系等进行分析;通过RT-qPCR分析 AcNPR1基因在不同品种猕猴桃植株中的组织表达模式以及病原菌和水杨酸（Salcylic acid,SA）对其诱导表达模式。结果表明, AcNPR1基因开放阅读框1 770 bp（Genbank 登录号MW881148）,编码589个氨基酸,理论等电点6.27,具有典型的BTB/POZ结构域、ANK重复序列、NPR-like等NPR1蛋白保守结构域,AcNPR1蛋白预测定位于细胞核中;蛋白质的二级结构以α螺旋和无规卷曲为主;系统进化显示其与茶树的亲缘关系最为密切,相似性为83.94%。组织特异性分析表明 AcNPR1基因在‘红阳’和‘徐香’品种叶片中的表达水平最高。在丁香假单胞杆菌猕猴桃致变种（Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa）处理下,抗病品种‘徐香’ AcNPR1基因的相对表达水平在处理0 h后迅速增加,为对照的3.6倍;而高感品种‘红阳’在48 h后显著增加,为对照的2.7倍。在SA+Psa处理下,‘徐香’ AcNPR1基因相对表达水平在24 h内达到最高水平,是对照的7.7倍;‘红阳’在72 h后达到最大值,仅为对照的1.6倍。 ‘徐香’ AcNPR1基因的抗病响应反应早于‘红阳’且更易受SA诱导表达。 AcNPR1基因在猕猴桃抗病胁迫方面具有一定作用,在不同抗性的猕猴桃品种抗病机制中存在差异。     

葡萄HAK基因家族的鉴定与表达分析

从葡萄基因组数据库中检索到18个HAK基因家族成员,对其在生物信息学及非生物胁迫下的表达水平进行分析。结果表明:葡萄HAKs编码CDS序列长度为2 000～2 500 bp,外显子数从7个到12个不等。二级结构主要以α-螺旋和不规则卷曲为主,至少含9个跨膜区域,亚细胞定位表明该家族主要在细胞质膜上。葡萄HAK基因分为7个亚族且整个家族与拟南芥HAK家族成员的同源性很高。基因芯片表达谱分析表明,葡萄HAK基因家族能够响应高温、低温、盐、干旱和水分等非生物胁迫,不同成员的表达水平存在一定的差异。荧光定量分析表明, VvHAK01、 VvHAK04、 VvHAK06和 VvHAK13质量分数为10%PEG处理6 h后表达量显著上升; VvHAK02、 VvHAK07、 VvHAK09、 VvHAK10、 VvHAK12、 VvHAK13、 VvHAK15、 VvHAK16、 VvHAK17、 VvHAK18在50μmol·L~(-1) ABA处理6 h后表达量显著上升; VvHAK07、 VvHAK09、 VvHAK11在400 mmol·L~(-1) NaCl处理6 h后表达量显著上升; VvHAK05在50μmol·L~(-1) ABA、400 mmol·L~(-1) NaCl和质量分数为10%的PEG处理6 h后,叶片表达量显著下调。大多数HAK基因家族成员对ABA、NaCl和PEG无法有响应,试验为进一步解析HAK基因功能和利用HAK基因进行植物的遗传改良奠定基础。     

甘蓝型油菜WOX基因家族的鉴定与表达分析

对甘蓝型油菜WOX基因家族进行研究，利用生物信息学方法鉴定到58个家族成员，对其理化性质、系统发育树、基因结构、保守结构域、染色体位置、顺式作用元件和表达模式等进行分析，结果表明：氨基酸长度为121~397，分子质量为13 962.77~44 157.46 u，等电点为5.23~9.63，亲水性均小于0，不稳定系数为42.12~75.63，亚细胞定位在细胞核和叶绿体；系统进化树将WOX基因分为3大类和9个亚支；相同亚支的成员motif和基因结构相似或相同；除 BnWOX1、 BnWOX3、 BnWOX4、 BnWOX15、 BnWOX32、 BnWOX42、 BnWOX43、 BnWOX51、 BnWOX53 基因外，其余 49 个BnWOX基因不均匀分布在19条染色体中的18条染色体上(ChrC06 除外)，有38对串联重复基因；基因上游序列中包含转录因子结合位点、逆境响应、光响应、激素响应、分生组织调控等顺式作用元件等；各组织器官表达分析表明，BnWOX基因在根、茎尖、种子、角果中表达量较高；对WOX基因进行定量分析发现，在冷胁迫和干旱胁迫下基因表达量有显著变化，表明BnWOX基因可能在油菜响应冷/旱胁迫的调控机制中发挥着重要作用。     

星星草脂氧合酶基因家族鉴定及生物信息学分析

星星草（Puccinellia tenuiflora）具有较强的耐盐碱特性,是改良土壤盐碱化的优良牧草。脂氧合酶（Lipoxygenase,LOX）广泛存在于动植物中,催化多不饱和脂肪酸的双加氧反应,最终生成各种氧脂素,从而在植物生长发育、响应逆境胁迫中发挥重要的生物学功能。目前,星星草中的LOX家族基因仍未见报道。本研究利用生物信息学方法对PutLOX基因家族成员进行鉴定,并对其理化性质、亚细胞定位和系统进化进行了分析。结果表明,星星草基因组中共有8个LOX基因,它们均具有Lipoxygenase homology 2（beta barrel）（简称LH2）和Lipoxygenas结构域,均不包含跨膜结构域,预测定位于细胞质或叶绿体。系统发生分析表明PutLOXs蛋白分为9-LOX和13-LOX两个亚家族,并且与水稻和玉米这类单子叶植物的LOXs系统发生关系更近。本研究将为后期深入解析星星草耐盐碱分子机制提供理论依据。     

长穗偃麦草LBD基因家族的鉴定与进化分析

为深入研究长穗偃麦草LBD基因家族中基因的结构与功能以及小麦与其近缘属的进化关系,以长穗偃麦草LBD（Lateral organ boundaries domain）基因家族为研究对象,生物信息学分析发现该基因家族含有32个成员,根据其结构域特征,可分为Class Ⅰ和Class Ⅱ两个亚家族,Class Ⅰ又可分为Ⅰ_A、Ⅰ_B、Ⅰ_C、Ⅰ_D和Ⅰ_E,Class Ⅱ可分为Ⅱ_A和Ⅱ_B;该基因家族的结构域、基因结构相对保守,不同成员之间具有相似的蛋白二级和三级结构。对32个基因的上游序列预测,发现基因上游序列中含有光响应、多种激素、逆境响应等顺式作用元件,说明LBD基因的表达受到光、激素、逆境等多种因素的诱导。与普通小麦、圆锥小麦、乌拉尔图小麦、粗山羊草、大麦进行共线性分析发现,Tel-2E-LBD2、Tel-3E-LBD4、Tel-4E-LBD1和Tel-4E-LBD6为长穗偃麦草特有的LBD基因,而其他28个LBD基因在进化中具有高度的保守性;在普通小麦、圆锥小麦、乌拉尔图小麦和大麦基因组中均发现第1、3部分同源群染色体上存在染色体间的片段重复;普通小麦、圆锥小麦和乌拉尔图小麦的A基因组中第4、5部分同源群染色体均有易位现象,同时,乌拉尔图小麦4A染色体上存在染色体内片段重复而在普通小麦和圆锥小麦的A基因组上发现第4部分同源群染色体内易位与倒位。     

黄藤Dof家族的全基因组鉴定及系统进化分析

为了揭示黄藤全基因组中Dof基因家族的生物学功能,利用生物信息学手段,对黄藤Dof基因家族进行了全基因组鉴定,并系统分析了黄藤与其他9个物种Dof基因家族分子进化关系。结果表明：黄藤基因组中含有25个Dof基因,亚细胞定位预测发现它们均位于细胞核,跨膜结构预测到黄藤所有的Dof蛋白成员均不具有跨膜结构;黄藤的Dof蛋白家族均为不稳定亲水蛋白,其二级结构由α−螺旋、无规则卷曲为主导,其三级结构主要由α−螺旋和β−转角进行复杂的空间构象变化组成;黄藤Dof蛋白成员的氨基酸个数为184到586 AA,pI范围为4.71～9.57;根据系统进化分析,黄藤Dof基因家族分为ClassⅠ −ClassⅣ共4个亚组, 其中ClassⅡ成员最多（8个）,约占总数的32%;其次是ClassⅣ（7个）、ClassⅠ（5个）和ClassⅢ（5个）;从组别上来看,ClassⅡ成员分化速度是最快的,与原始祖先的亲缘关系最远。从组中来看,ClassⅡ中成员DjDof9和DjDof10分化最快,与原始祖先的亲缘关系最远,DjDof12和DjDof24分化较慢,与原始祖先的亲缘关系相对较近;黄藤与拟南芥的进化关系表明两者亲缘关系不是很近;黄藤与其他9个物种的Dof 基因的系统进化分析表明黄藤与甘蓝型油菜和小麦有较近的亲缘关系,序列同源性也较高,与可可亲缘关系最远。     

胡萝卜类黄酮含量的测定及DcCHS基因家族的鉴定分析

查尔酮合成酶(chalcone synthase, CHS)是类黄酮合成过程中的第一个关键酶,具有重要的生理功能。测定胡萝卜不同发育时期、不同组织部位的类黄酮含量,并在全基因组水平上对胡萝卜CHS基因家族进行鉴定和分析。结果表明,无论在苗期还是收获期,胡萝卜叶中的类黄酮含量均极显著地高于根中的含量。叶中的类黄酮含量在不同发育时期无显著差异,而根中的类黄酮含量在不同发育时期却差异显著。胡萝卜基因组中共有12个DcCHS基因,分布于5条染色体上,氨基酸序列长度为253～398 aa,外显子1～3个。经预测,DcCHS蛋白均定位于细胞质,二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主。DcCHS蛋白可分为ClassⅠ和ClassⅡ两类,含有10种保守基序,motif1、4、6、7为CHS蛋白N端结构域,motif2、3、8为CHS蛋白C端结构域。这些研究结果可为胡萝卜CHS基因的功能研究提供参考。     

芸薹属DFR基因家族RNA干扰载体的构建

二氢黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavonol-4-reductase,DFR)是类黄酮途径的一个关键酶,对种皮色泽和花色的形成具有重要作用。本研究从甘蓝型油菜克隆了600 bp(不计人工酶切位点)的芸薹属DFR基因家族的RNA干扰片段BDFRI,将其反义片段和正义片段分别插入到本课题组新近改造的植物RNAi平台载体pFGC5941M的启动子与间隔区之间、间隔区与终止子之间,构建了11 400 bp的RNAi干扰载体pFGC5941M-BDFRI,通过多重PCR鉴定证实载体构建成功,并转化到根癌农杆菌菌株LBA4404中形成了工程菌株。此载体的构建为进一步研究DFR基因参与决定芸薹属种皮色素和茎叶彩色性状的分子机理和代谢调控奠定了基础。     

葡萄CIPK基因家族的鉴定表达分析

以水稻、玉米、拟南芥中已知CIPK基因注册序列为基础,从葡萄基因组数据库中电子克隆出16条CIPK基因。对其理化性质分析表明,除VvCIPK10编码的251个氨基酸数目外,其余氨基酸数目基本稳定为300~470。整个CIPK家族的理论等电点为6~9。基因结构分析表明,VvCIPK01、VvCIPK03、VvCIPK04、VvCIPK08、VvCIPK09、VvCIPK13包含外显子数都大于10;VvCIPK02、VvCIPK05、VvCIPK06、VvCIPK07、VvCIPK10、VvCIPK11、VvCIPK12、VvCIPK14、VvCIPK15、VvCIPK16包含外显子数都小于7。聚类分析表明,CIPK基因被分为4个亚族,且在每一个亚族中都包含葡萄和拟南芥的CIPK基因家族成员,说明它们具有很高的同源性。对CIPK蛋白质的二级结构分析表明,葡萄CIPK基因家族所编码的蛋白质均以α-螺旋和不规则卷曲为主,而β-转角最少。亚细胞定位后发现,VvCIPK基因在细胞质中表达最多。对葡萄CIPK基因家族上游2kb区域顺式作用元件分析表明,VvCIPK13对于ABA和脱水胁迫的响应最为明显,葡萄CIPK基因家族对于MYB转录因子和WRKY转录因子均有响应。荧光定量分析表明,VvCIPK15在根中表达量最多,在茎中表达量最少;在不同处理下该基因表达差异性显著。其中,受PEG、ABA、NaCl诱导后呈明显上调表达,其表达量依次为PEGNaClABA。同时该基因在受到高、低温胁迫时表达量也有明显上调,9个处理中只有在山梨糖中呈下调表达。推测该基因能够参与调控干旱、盐碱、低温等逆境过程。