印楝素A诱导Sf9细胞凋亡的显微和超微形态变化

利用倒置显微镜和透射电子显微镜技术观察印楝素A诱导草地贪夜蛾Spodoptera frugperda蛹卵巢Sf9细胞凋亡的显微和超微形态变化.结果表明:1.5μg.mL-1印楝素A对Sf9细胞具有显著的凋亡诱导作用,从凋亡小体和贴壁细胞数量变化判断,印楝素A处理12 h,细胞开始出现少量凋亡小体,12~24 h凋亡小体逐渐增多,但贴壁细胞未见明显减少,因此24 h之前(0~24 h)属于凋亡早期阶段;24~36 h凋亡小体大量出现,贴壁细胞逐渐减少,属于凋亡中期;处理36 h以上,凋亡小体和贴壁细胞急剧减少,细胞凋亡进入晚期.观察诱导24 h的细胞超微结构发现,胞内的主要细胞器在数量或形态上发生了显著变化,包括溶酶体数量显著增加,线粒体内部嵴变模糊,内质网从囊泡状变成线管状,细胞核出现分页、皱缩以及区域性膨大等.     

印楝素对小菜蛾胚胎细胞增殖和凋亡的影响

【目的】探讨印楝素对小菜蛾Plutella xyllostella胚胎细胞增殖和凋亡的影响及可能的机制。【方法】将体外培养的小菜蛾胚胎细胞分为印楝素处理组和未处理组,采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖的抑制率,激光共聚焦镜检PI染色后的细胞死亡和DAPI染色后的凋亡小体,通过Western-blotting检测各组细胞Caspase-3的表达情况以及通路蛋白Akt的磷酸化水平。【结果】印楝素对小菜蛾胚胎细胞有明显的增殖抑制作用,且呈现浓度依赖性,24 h的IC_(50)为4.4μg·mL~(-1)。印楝素处理后的细胞经PI染色后能明显观察到死亡细胞,DAPI染色后可见凋亡小体;Caspase-3蛋白发生剪切,并且抑制Akt的磷酸化水平。【结论】印楝素对小菜蛾胚胎细胞的增殖有明显的抑制作用,并通过抑制Akt信号通路的活化,诱导细胞产生依赖于Caspase-3的Ⅰ型凋亡。     

印楝素可能通过干扰细胞凋亡抑制果蝇生长发育

为了探讨印楝素调节昆虫生长发育的细胞毒理机制,寻找杀虫作用新靶标,以含印楝素0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mg/kg的培养基饲养黑腹果蝇幼虫,观察幼虫生长发育情况,通过荧光显微技术研究胚胎发育过程中的细胞凋亡. 结果表明,印楝素处理可显著抑制黑腹果蝇幼虫的生长发育,处理后5 d平均虫重由对照的1.41 mg降低至1.13~0.38 mg,发育历期由对照的4.50 d延长至5.17~12.33 d,发育抑制率为19.86%~73.05%,或形成永久性幼虫不能化蛹,最终死亡;部分幼虫虽然能化蛹,但化蛹率下降至1.67%~63.33%,均显著低于对照组的95.00%,羽化率由对照的95.00%下降至63.33%~1.67%,平均产卵数由对照的57.33下降至29.67~4.33,出现畸形成虫,个体明显变小. 运用荧光显微镜观察发现,印楝素0.5 mg/kg和2.0 mg/kg处理能明显推迟果蝇胚胎细胞凋亡高峰期,缩短凋亡峰期的持续时期.     

响应面优化诱导子促进印楝悬浮细胞培养产印楝素的研究

通过单因素实验法研究了水杨酸(SA)、萘乙酸(NAA)、壳聚糖(CTS)、吲哚丁酸(IBA)、茉莉酸(JA)、激动素(KT)和甲基茉莉酸(MJ)等7种诱导剂对印楝悬浮细胞培养产印楝素的作用,筛选出SA、NAA、CTS、IBA等4种刺激效果明显的诱导剂,利用响应面法优化了该4种诱导剂的最佳组合为SA 92.00 mg/L、NAA 6.0 mg/L、CTS5 4.0 mg/L和IBA 3.0 mg/L,得到印楝素含量的实际值为8.61 mg/g,与理论预测值8.69的相对误差为0.92%。回归方程的预测值和实验值差异不显著,所得回归方程模型拟合情况良好,符合要求。     

印楝素A和印楝素B的稳定性比较

印楝种子甲醇抽提物在甲醇 水 (体积比为 55∶5) 中于 (54±1)℃下贮存 7和 14d, 印楝素A的降解率分别为33 59%和 54 45%, 印楝素B的为 11 96%和 21 11%; 印楝种子甲醇抽提物在 (54±1)℃下贮存 7和 14d, 印楝素A的降解率为 82 35%和 94 79%, 印楝素B的为 20 32%和 54 75%; 印楝素干粉于 (54±1)℃下贮存 14d, 印楝素A和印楝素B的降解率分别为 90 15%和 81 85%。在 (54±1)℃下热贮 7d, 在甲醇、甲醇 水 ( 9∶1 ) 和甲醇 印楝油(9∶1) 中印楝素A的降解率分别为 29 65%、44 99%和 12 76%, 印楝素B的分别为 19 68%、25 65%和 9 67%。印楝油对印楝素A和印楝素B均有保护作用。     

印楝素A和印楝素B的稳定性比较

印楝种子甲醇抽提物在甲醇+水(体积比为55:5)中于(54±1) ℃下贮存7和14 d,印楝素A的降解率分别为33.59%和54.45%,印楝素B的为11.96%和21.11%;印楝种子甲醇抽提物在(54±1) ℃下贮存7和14 d,印楝素A的降解率为82.35%和94.79%,印楝素B的为20.32%和54.75%;印楝素干粉于(54±1) ℃下贮存14 d,印楝素A和印楝素B的降解率分别为90.15%和81.85%.在(54±1) ℃下热贮7 d,在甲醇、甲醇+水(9:1)和甲醇+印楝油(9:1)中印楝素A的降解率分别为29.65%、44.99%和12.76%,印楝素B的分别为19.68%、25.65%和9.67%.印楝油对印楝素A和印楝素B均有保护作用.     

接种量与通气比对印楝悬浮细胞生长及印楝素产量的影响

为印楝悬浮细胞扩大培养提供依据,利用5L气升式发酵罐,以印楝悬浮细胞作种子细胞,研究接种量与通气比对印楝悬浮细胞生长和印楝素产量的影响。结果表明:在反应器中,印楝悬浮细胞生长和印楝素产量呈偶联型;种子细胞适宜接种量和通气比分别为60g/L和0.2vvm,在此条件下,悬浮培养基质中的pH呈先降后升的变化趋势,细胞干重和印楝素产量分别为11.41g DW/L和8.32mg/g,添加复合诱导子后48h印楝素产量最大,达94.78mg/L。     

印楝素A和印楝素B的生物活性及增效作用

印楝素A、印楝素B和印楝素A B(1：1,m／m)对斜纹夜蛾2龄幼虫具有较好的拒食活性,处理后24h,拒食中浓度(antifeedant medial concentration,ARC50)分别为0．97mg／L、2．42mg／L和1．01mg／L~印楝素A与印楝素B按质量比1：1混合后具有增效作用。印楝素A、印楝素B和印楝素A B对大菜粉蝶3龄幼虫具有一定的拒食活性,处理后24h,AFC50分别为176．67mg／L、224．48mg／L和149．99mg／L印楝素A与印楝素B按质量比1．6：1混合后具有一定的增效作用。3mg／L印楝素A和印楝素B能延缓斜纹夜娥的化蛹,降低蛹重,且印楝素B对蛹的影响高于印楝素A。1mg／L印楝素A与印楝素B能明显降低斜纹夜娥幼虫的体重,处理后3～5d,印楝素B对斜纹夜蛾幼虫的体重的影响明显高于印楝素A。     

不同杀虫成分对Sf9细胞凋亡的影响

通过倒置显微形态观察凋亡小体、DNA琼脂糖凝胶电泳确证的模型,研究了8种代表性杀虫成分对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda离体培养细胞系Sf9的凋亡诱导效果,以探讨不同杀虫成分对昆虫细胞凋亡的影响.结果表明,印楝素0.15～1.50 μg/mL处理后72 h内、喜树碱0.35～3.50 μg/mL处理后36 h,Sf9细胞产生大量典型凋亡小体,处理时间延长或剂量加大则以造成细胞坏死为主;DNA电泳产生典型的DNA Ladder,表明印楝素和喜树碱对Sf9具有明显的细胞凋亡诱导作用.印楝素1.5 μg/mL诱导处理Sf9细胞凋亡高峰期为处理后24～48 h,喜树碱0.35～3.50 μg/mL诱导处理Sf9细胞凋亡高峰期为处理后12 h.苦参碱、氟铃脲、毒死蜱、灭多威、氯氰菊酯以0.1～10.0 μg/mL及昆虫蜕皮激素20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone)以0.048～4.800 μg/mL处理后72 h内对Sf9均无明显的细胞凋亡诱导作用.杀虫剂对昆虫细胞凋亡诱导效应随供试化合物、细胞种类、处理剂量、处理时间而异.     

印楝果实成熟期调查及不同采收期印楝素含量的变化

印楝果实的成熟期较长,不同成熟期所采样品的百粒重、印楝素含量和印楝素产量也不相同,调查和实验结果显示：印楝果实的成熟期集中在7月初至9月中旬期间;早期样品的百粒重低而印楝索含量高,后期样品百粒重高而印楝素含量低,成熟率约30％时百粒重和印楝素含量基本稳定,印楝素产量在果实成熟后基本稳定;同一时期采摘的样品中,绿色果皮的样品印楝素含量和产量均高于黄色果皮的样品。     

斑蝥素诱导草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）卵巢细胞系Sf9凋亡的临界条件

为进一步利用昆虫细胞研究斑蝥素对鳞翅目昆虫的毒杀机理,采用细胞形态学观察法和DNA凝胶电泳法研究斑蝥素诱导草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）卵巢细胞系Sf9细胞凋亡的临界条件。结果表明：供试细胞凋亡率与斑蝥素处理剂量、时间呈现密切相关性;在较低剂量处理下,可观察到细胞凋亡。当斑蝥素质量浓度达到6.25μg/mL,处理细胞3 h或3.125μg/mL处理细胞12 h时,斑蝥素处理Sf9导致细胞出现明显畸形、形成凋亡小体等凋亡症状。DNA Ladder条件要求严格,在冰浴条件下,当斑蝥素处理质量浓度达到6.25μg/mL处理细胞24 h时,或者12.5μg/mL处理细胞12 h时,可观察到明显的DNA梯度条带。     

印楝素B稳定性的观察

室内试验测定结果表明,印楝种子甲醇抽提物中印楝素B在甲醇、乙醇、乙腈和DMF等溶剂中具有良好的稳定性。在54℃下贮存14 d,印楝素B的降解率分别为-1.87%、1.13%、-2.32%和5.24%。印楝素干粉中印楝素B在甲醇、乙醇、丙酮和DMF等溶剂中的稳定性不佳,在54℃下贮存14 d,印楝素B的降解率分别为24.07%、35.65%、19.88%和10.29%。印楝种子甲醇抽提物在甲醇 水(55/3,V/V)中于0℃下贮存7 d和14 d,印楝素B的降解率分别为-2.98%和1.03%。于54℃下贮存7 d和14 d,印楝素B的降解率分别8.73%和15.09%。于甲醇 水(9/1,V/V)中在54℃下热贮14 d,印楝素B的降解率为52.47%,稳定性高于印楝素A。紫外光下照射19 d,印楝种子甲醇抽提物中印楝素B的降解率为-2.94%。     

三丁基锡（TBT）对罗非鱼精巢细胞凋亡的影响

以雄性奥利亚罗非鱼为试验材料,研究了三丁基锡(TBT)对鱼类精巢细胞凋亡的影响。通过腹腔注射染毒TBT(剂量分别为0、1、3、5、10μg·kg-1体重),取染毒后的精巢,一部分用于制备石蜡切片,原位末端标记法(TUNTEL法)进行细胞凋亡分析,另一部分用于研究TBT对精巢细胞Ca2 -ATP酶活性的影响。结果表明,染毒后24和48h,随着染毒剂量的升高,罗非鱼精巢细胞凋亡率先增高后降低,在5μg·kg-1体重时达最高;染毒后96h,相应细胞凋亡率先降低后升高,在5μg·kg-1体重时最低。与之相对应的精巢细胞Ca2 -ATP酶活性,低剂量组(1～3μg·kg-1)与对照组相比,差异不显著;高剂量组与对照组相比,差异显著或极显著;在试验剂量范围内,Ca2 -ATP酶活性随着注射剂量的升高而升高。     

印楝素诱导黑腹果蝇复眼发育异常的形态学研究

将果蝇置于含印楝素2 mg/kg的昆虫培养基中产卵,待卵孵化发育至不同虫态,运用光学显微镜及扫描电镜研究果蝇新羽化成虫复眼外观,发现复眼明显萎缩并呈现不规则状,表面粗糙,出现异常凹陷,刚毛缺失或增生,排列不规则或弯曲;运用透射电镜研究复眼超微结构,结果表明,3龄末期幼虫复眼组织细胞中染色质高度聚集成小体、小体分散,吞噬泡数量明显增多,核膜皱缩、界限模糊,蛹和新羽化成虫复眼中感光细胞丢失.这些结果确证了印楝素诱导果蝇复眼发育异常,为寻找新型昆虫生长发育调节剂提供了可能的新靶标.     

ROS对氯化镉诱导的人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响

为研究活性氧(ROS)对氯化镉(CdCl2)诱导的人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响,本文采用荧光探针DHR检测CdCl2诱导的MCF-7细胞内ROS的变化水平;分别采用MTT法和DNA Ladder法检测CdCl2对细胞的毒性作用和细胞DNA的凋亡情况;通过加入自由基清除剂LNAC抑制细胞内的ROS水平,从而研究ROS对细胞凋亡的影响。结果显示,1.00×10-3 mol/L的CdCl2处理MCF-7细胞6h,细胞内ROS水平为对照组的2.04倍,细胞存活率为26.54%,DNA出现片段化分解。用CdCl2+LNAC复合处理MCF-7细胞6h,细胞内ROS水平为对照组的1.25倍,细胞存活率为61.17%,DNA不出现凋亡条带。因此,由CdCl2所导致的MCF-7细胞凋亡和DNA片段化分解,与细胞内ROS水平的升高有关。     

海带多糖在诱导肿瘤细胞凋亡机制方面的研究

海带作为一种重要的海生资源,其食用与药用价值很早就为世人所知。从海带中提取的海带多糖是一种特有的含有硫酸酯的天然活性多糖,具有多种生物学活性,如抗凝血、抗肿瘤、抗病毒、抗血栓、提高免疫力等,有很好的医药应用价值。对海带多糖的抗肿瘤作用及其诱导肿瘤细胞凋亡机制进行了综述。     

奶牛淋巴白血病中细胞凋亡与细胞增殖病理研究

利用细胞凋亡试剂盒（POD）及小鼠抗大鼠增殖细胞核抗原（PCNA）单克隆抗体将淋巴白血病中的凋亡细胞与增殖细胞准确地染色显示出来,并进行对比观察分析.结果表明,奶牛淋巴白血病中有凋亡细胞与增殖细胞,细胞凋亡与细胞周期调控是肿瘤发生发展的两方面.单克隆抗体免疫细胞化学方法可以很好地检测PCNA和细胞凋亡的表达,PCNA与细胞凋亡可作为奶牛淋巴白血病细胞增殖活性的指标,其表达可能是急性白血病预后不良的一个指标.可以认为牛淋巴白血病乃是细胞死亡被抑制,而细胞的增殖率相对升高的病理过程.     

喹乙醇诱导鲤肝细胞凋亡的电子显微镜观察

在饲料中添加200mg/kg的喹乙醇,连续30d饲喂60尾实验鲤鱼,分别于染毒后的第7、14、20、25d和30d剖杀4尾鱼,取肝脏进行电子显微镜检测其细胞凋亡。结果表明,喹乙醇可引起鲤鱼肝细胞凋亡。其特征表现为肝细胞出现染色质浓缩、边移,呈半月状,随后裂解成大小不等的团块,并可见凋亡细胞形成具有特征性的、质膜完整的凋亡小体。随着实验时间的延长凋亡检出率越高。     

金黄色葡萄球菌诱导牛原代乳腺上皮细胞的凋亡

【目的】观察金黄色葡萄球菌能否诱导牛原代乳腺上皮细胞发生凋亡。【方法】先以新鲜牛奶为材料分离培养牛乳腺上皮细胞并鉴定,然后用金黄色葡萄球菌侵染牛乳腺上皮细胞,采用普通光镜和扫描电子显微镜观察金黄色葡萄球菌诱导牛乳腺上皮细胞凋亡的形态学变化;用流式细胞仪（Annexin V/PI双染法）定量检测金黄色葡萄球菌感染对牛乳腺上皮细胞凋亡的诱导作用;RT-PCR检测细胞凋亡通路中关键蛋白caspase 3和caspase 8的变化情况。【结果】从乳汁中分离的细胞经原代培养后,细胞呈典型的铺路石状,细胞表层可产生大小不等的乳滴,RT-PCR法扩增出乳腺上皮细胞的骨架蛋白8特异性条带;免疫荧光细胞染色法结果显示分离培养的牛乳腺上皮细胞表达角蛋白8;金黄色葡萄球菌感染牛乳腺上皮细胞3 h后,可诱导牛乳腺上皮细胞发生凋亡,表现为细胞核皱缩,染色质边缘化和细胞浆内空泡增多等典型凋亡特征;Annexin V/PI双染法检测后发现,与对照组相比,感染组细胞凋亡率明显升高,差异极显著（P﹤0.01）;与对照组相比,感染组细胞caspase3及caspase 8表达量明显增高。【结论】金黄色葡萄球菌可以诱导牛原代乳腺上皮细胞凋亡,具有细胞凋亡的典型形态特征和生化特性,凋亡通路可能涉及caspase 3和caspase 8参与的外源性凋亡途径。