鸡痘病毒HQ98株超微结构观察

取白喉型鸡痘病死鸡的喉气管组织 ,固定、包埋、切片、染色 ,用电镜对其形态的超微结构进行观察。结果表明 ,鸡痘病毒HQ98株除了有与一般鸡痘病毒相似的形态结构外 ,其核心膜为二层 ,包涵体均被一层膜包围 ,病毒粒子的第二层外膜就是从包涵体膜出芽时获得。该病毒的大小为 175 .72± 2 0 .80nm× 2 76.84± 2 7.5 1nm     

蓖麻蚕核型多角体病毒的超微结构

本文应用电子显微镜技术对蓖麻蚕核型多角体病毒(pcMNPV)的超微结构进行了研究。其多角体蛋白质晶体为规则的线型、方格型花样。pcMNPV以病毒束随机封闭于多角体内,病毒束内含有数目不等的核衣壳,它是一种多粒包埋类型的NPV(MNPV)。     

家蚕核型多角体病毒四角形多角体的研究

BmNPVt是从BmNPVh中筛选出的一株四角形多角体病毒突变株。研究表明:BmNPVt的潜伏期、致病力、寄生部位、细胞病变同BmNPVh无甚差异;BmNPVt和BmNPVh之间存在干扰现象;Bm-NPVt的增殖类似于BmNPVh,但囊膜的形成方式两者之间不同。四角形多角体表面粗糙,具有小孔;它的外层电子密度较高,有一厚度为1500A的中间层。多角体蛋白晶格间距离为48A,分子量为29000dolt。同六角形多角体蛋白相比,四角形多角体蛋白的Glu含量较低,Tyr含量相对较高,胰酶酶切图谱两多角体蛋白存在差异。此外,多角体蛋白中Cu、Fe的含量和对酸碱溶解性,两多角体间也存在差异。BmNPVt为杆状,大小为330—340×85nm,纯病毒具有典型的杆状病毒紫外吸收特性,BmNPVt—DNA的变性温度为83℃,分子量为6.94×10~7dolt。镇江株、苏州株、日本株之间病毒DNA的EcoRI酶切图谱存在差异。     

应用重组家蚕核多角体病毒在蚕体中表达人丙型肝炎病毒C区及E1区基因

将人丙型肝炎病毒的C区、E1区及部分E2区基因装入转移载体 pBM0 3 0 ,经原位杂交筛选、酶切鉴定、Southern杂交检测确定转移质粒装载成功。将转移质粒与家蚕核多角体病毒重组 ,在家蚕BmN细胞中挑选重组病毒 ,经点杂交技术确证重组病毒带有目的基因。将重组家蚕核多角体病毒通过针刺和注射方法感染蚕蛹及 5龄期家蚕 ,肽抑制试验检测目的基因表达的多肽活性。结果表明 ,目的基因已得到表达 ,表达量较高 ,为每蛹体约 60～ 60 0 μg。     

蓖麻蚕核多角体病毒的研究及其预防试验

感染核多角体病毒后的蓖麻蚕,逐渐表现发育迟缓,体背及两侧出现很多大小不一的黑点(斑),甚至头壳及胸足都变为棕褐色,食欲减退,静伏少动,时见口吐胃液、拉稀或排念珠状粪等病征,从感病至死亡约需6～9天。病毒多角体一般为三角形,也有四角形或不规则形,其大小约为1.7～2.8微米,经生物测定其致死中浓度(LC_(50))为1×10~7个多角体/ml。病毒粒子呈杆状,直径约为60nm,长度约为344nm。取病蚕组织固定,用石蜡包埋切片、染色镜检及电镜观察,可见在脂肪、气管、皮肤、丝腺等组织细胞核内形成大量的多角体。病毒粒子首先侵入中肠上皮细胞,在圆筒细胞核内复制增殖后,再侵入体腔内各种组织,最初在细胞核内出现电子密度高、呈网状构造的病毒发生基质,继而出现零散的病毒粒子,至病毒粒子整齐排列,散开外面包膜,然后埋入多角体蛋白质中,不断成长变为成熟的多角体。对广东现行蓖麻蚕品种进行抗病毒病的测定试验,结果以广四品种抗性较强,其次为高州1号、广花黄、广白黄。根据病毒干扰原理,1～3龄起蚕添食灭活多角体,再以活性病毒多角体感染,结茧率仍有40～60％。各龄起蚕若以10％石灰清液添食,3龄后用活性病毒多角体感染,结茧率仍可达50～73.3％。以上试验证明,均有一定的抗病毒感染作用,可供生产上参考、应用。     

家蚕核型多角体病毒主要结构组分的血清学关系研究

用蔗糖密度梯度离心与琼脂糖凝胶柱层析相结合的方法,分离纯化家蚕核型多角体病毒的多角体蛋白和病毒粒子。用非离子型去污剂NP—40脱除病毒粒囊膜,制备核衣壳。经用多种方法对这三种主要结构组分进行纯度鉴定。制备相应的兔抗血清。用双向免疫扩散和免疫电泳对三者之间的血清学关系进行了比较。试验结果表明,家蚕核型多角体病毒的多角体蛋白与病毒粒子和核衣壳之间无交叉反应,核衣壳与病毒粒子囊膜之间亦无血清学关系。     

家蚕核型多角体病毒(BmNPA)在消石灰(氢氧化钙)溶液中的失活作用/周重钦等//日蚕杂,

核多角体充分暴露在消石灰溶液中时多角体与病毒结构蛋白就会被降解为低分子蛋白。在电子显微镜下可以观察到病毒粒子在消石灰溶液中降解过程。病毒核衣壳先从囊膜的一个开口突出,并溶解,然后剩下的囊膜也被溶解掉。消石灰溶液把核型多角体病毒(NPV)的基因组DNA降解为片状的低分子DNA。本研究证明,消石灰溶液对核型多     

体外培养蓖麻蚕蛹精巢组织细胞对核型多角体病毒的敏感性分析

为开展核型多角体病毒与宿主互作关系的研究,建立蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricini)细胞体外扩增体系,分析其对不同核型多角体病毒的敏感性差异。采用剪切分离后的蓖麻蚕蛹精巢组织材料,将分散的细胞在TNM-FH培养基中经数月换液培养后,获得了扩增的蓖麻蚕蛹精巢细胞系(BMC1)。BMC1的倍增时间约为65h。病毒的感染性实验表明:BMC1细胞对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)比较敏感,在感染的细胞中可以明显地观察到多角体;家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的多角体蛋白基因启动子可以在BMC1细胞中表达,但难以观察到多角体形成和细胞的病变,提示BMC1可以作为BmNPV的稳定化表达受体;而蓖麻蚕核型多角体病毒(PcrNPV)单独感染BMC1细胞时,无明显病变,只有在与AcNPV混合感染时可观察到PcrNPV多角体形成。BMC1细胞对不同核型多角体病毒的敏感性具有差异,不同核型多角体病毒的感染性差异的机制有待深入解析。     

无包埋体对虾病毒（NOSV）的纯化和随机文库构建

通过超薄切片和负染电镜观察,从患暴发性传染病死亡的中国对虾体组织中,发现一种无包埋体对虾病毒（ＮＯＳＶ）或称中国对虾类杆状病毒（ＰｃＢＬＶ）。对其用不连续蔗糖梯度离心纯化,观察了其核衣壳的负染结构：核衣壳平均大小为６２ｎｍ×３１４ｎｍ,由蛋白壳粒环堆砌而成,每３层环形成１个重复单位,重复单位之间有较大空隙;核衣壳一端较平,另一端近于帽状。提取纯化病毒的核酸,电泳后用低熔点琼脂糖回收,用ＥｃｏＲＩ酶切,克隆于ｐＵＣ１８质粒中,共获得１６个阳性克隆质粒,克隆片段总长度约５３．４５ｋｂ。     

PRRSV核衣壳蛋白基因在杆状病毒中的表达

根据已发表的猪生殖 -呼吸道综合征病毒 ( PRRSV) CH-1 a分离株核衣壳 ( N)蛋白基因核苷酸序列和杆状病毒转移载体 p Blue-Bac-His B多角体蛋白阅读框架 ,设计合成了 1对特异性引物 P7S1 /P7R1。应用PCR对重组质粒 p UC1 8-ORF7扩增 ,获得了 CH-1 a株 N基因的片段。经 Hind 和 Bgl 双酶切 ,将其定向克隆到同样双酶切的 p Blue-Bac-His B的 PH启动子下游 ,获得转移载体 p Blue-Bac-His B-ORF7。将转移载体p Blue-Bac His B-ORF7与苜蓿银蚊夜蛾多核型多角体病毒 ( Ac MNPV,简称杆状病毒 )线性化 DNA ( Bac-N-Blue TMDNA)共转染 Sf9细胞 ,经过蓝斑筛选和蚀斑纯化 ,获得重组病毒 r Bac7。经用引物 P7S1 /P7R1和杆状病毒多角体蛋白基因通用引物 PCR鉴定 ,证明目的基因已插入到杆状病毒中。将重组病毒接种于对数生长期的 Sf9细胞 ,分别于感染后 2 4、4 8、72、96、1 2 0 h收集感染细胞 ,经 SDS-PAGE和 Western blot分析 ,结果表明 ,细胞接种重组病毒 2 4 h即开始表达重组蛋白 ,至 96h达到峰值 ,占整个细胞蛋白的 8.4 % ,此后开始下降。表达产物为融合蛋白 ,大小约 2 0 0 0 0。将重组病毒感染的 Sf9细胞用抗 PRRSV N蛋白的单克隆抗体SDOW-1 7进行间接免疫荧光试验 ,结果在细胞浆和细胞核中观察到了特异性的亮绿     

樗蚕和蓖麻蚕的DNA条形编码与系统进化分析

樗蚕(Philosamia cynthia cynthia)与蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricini)均是鳞翅目大蚕蛾科吐丝营茧的昆虫,二者的血缘关系很近,成虫的外形也极其相似。为了获得用于樗蚕与蓖麻蚕分子鉴定的DNA条形编码,测定了二者的线粒体细胞色素酶C亚基I基因(COI)574 bp的DNA片段序列(GenBank登录号:FJ788507,FJ772004),对序列特征及与同科其它绢丝昆虫同源序列的系统进化关系进行了分析。在大蚕蛾科绢丝昆虫中,樗蚕与蓖麻蚕COI序列表现出最强的碱基T偏好性(ATskew=-0.194),二者的COI序列之间具有明显差异,共鉴定出25个变异位点,表明所测定COI序列可以作为各自的DNA条形编码。樗蚕与蓖麻蚕之间基于Kimura-2-Parameter的遗传距离为0.041,而与同科其它绢丝昆虫之间的遗传距离则在0.076~0.159之间,二者与惜古比天蚕(Hyalophora ce-cropia)之间的亲缘关系较近。     

绢丝昆虫卵黄原蛋白一级结构的特性分析

家蚕、天蚕、蓖麻蚕、柞蚕、野桑蚕、透目天蚕、樟蚕7种绢丝昆虫分别属于鳞翅目的家蚕蛾科和天蚕蛾科的不同属。通过对7种绢丝昆虫卵黄原蛋白一级结构保守序列如信号肽序列、多聚丝氨酸、糖基化位点等的比较和分析,并进一步根据氨基酸的同源性构建了系统树。结果证明了7种绢丝昆虫的卵黄原蛋白的一级结构在进化上具有很好的保守性,其中蓖麻蚕和樗蚕的亲缘关系最近,家蚕蛾科的野桑蚕和天蚕蛾科的樟蚕的亲缘关系最远。     

蓖麻蚕核型多角体病毒解旋酶基因的克隆和序列分析

为了解柞蚕核型多角体病毒(Antheraea pernyinucleopolyhedrovirus,ApNPV)和蓖麻蚕核型多角体病毒(Philosamia cynthia riciniNPV,PcrNPV)在感染性及基因水平上的差别,克隆了PcrNPV解旋酶基因helicase,对该基因进行了测序及同源性分析。感染性试验表明,ApNPV对柞蚕和蓖麻蚕的感染率分别为78%和57%;而PcrNPV对蓖麻蚕的感染率为79%,但几乎不感染柞蚕。对PcrNPVhelicase分析的结果表明,该基因长度为3 639 bp,编码1 212个氨基酸(登录号:EU143371)。基因的同源性分析表明,PcrNPVhelicase与ApNPVhelicase的同源性最高,达98.6%,与苜蓿银纹夜蛾NPV(Autographa califorlicaNPV,AcNPV)helicase和家蚕NPV(BombyxmoriNPV,BmNPV)helicase的同源性最低,分别为58%和58.8%。PcrNPV和ApNPV的helicase基因7个保守功能域上的氨基酸序列均相同,仅在靠近DNA结合区螺旋-转角-螺旋结构处的第974位上有1个氨基酸不同,推测该位点可能与宿主域范围有关。     

蚕丝心蛋白的亚基及其分子量、氨基酸组成研究

试验以家蚕、野桑蚕、天蚕、柞蚕、樗蚕、蓖麻蚕为材料，测定了丝心蛋白及其亚基的分了量和氨基酸组成。结果表明，丝心蛋白亚基的组成家蚕、野桑蚕表现为Ｈ－Ｌ型，天蚕、柞蚕、樗蚕、蓖麻蚕为Ｈ－Ｈ型。家蚕蛾科的蚕类与天蚕蛾科的蚕类在丝心蛋白氨基酸组成上，具有种待异性，各种蚕类丝心蛋白氨基酸组成差异同它们的分类地位相一致。从家蚕和野桑蚕绢丝腺液状丝心蛋白中分离出小亚基，小亚基的氨基酸组成和大亚基有很大不同。     

蓖麻蚕和栗蚕的性染色体研究

根据在蓖麻蚕（ｐｈｉｌｏｓａｍｉａｃｙｎｔｈｉａｒｉｃｉｎｉ）（♀）和栗蚕（Ｄｉｃｔｙｏｐｌｏｃａｊａｐｏｎｉｃａ）（♀）减数分裂前期所观察到的ｘ（Ｚ）染色体的长度和在全套染色体中的序号以及栗蚕Ｘ染色体的异染色质区域等特征，认为蓖麻蚕的ＸＯ型可能是由ＸＹ型中的Ｙ染色体缺失所致，而栗蚕的Ｘ染色体则可能是由Ｘ和Ｙ染色体融d合为一条而成。     

6种野生蚕类的RAPD分析

野生蚕类是我国重要的泌丝昆虫资源,研究其亲缘关系对于发掘和利用野生蚕类资源具有重要意义。利用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术分析大蚕蛾科的柞蚕、栗蚕、野生柞蚕、天蚕、蓖麻蚕、透目天蚕间的亲缘关系,利用从54个引物中筛选出的30个重复性较好的随机引物对6种野生蚕类的基因组DNA进行扩增,共得到632个RAPD标记,其中可变条带数为632条,单个引物扩增的条带数为15～27,平均为21.1。6种野生蚕类相互间的遗传距离(D)较大,说明相互间的亲缘关系较远,其中:蓖麻蚕和栗蚕的遗传距离最大,为0.761 2;天蚕和透目天蚕的遗传距离最小,为0.671 1。采用UPGMA法构建的聚类图显示6种野生蚕类聚为4类,柞蚕与野生柞蚕聚为一类,天蚕与透目天蚕聚为一类,栗蚕、蓖麻蚕各自单独聚为一类。     

天蚕、柞蚕线粒体DNA（mtDNA）的限制性酶切电泳图谱

采用差速离心和碱变性法，以９种限制性内切核酸酶对天蚕和柞蚕ｍｔＤＮＡ进行了单酶切分析，发现这两种蚕的ｍｔＤＮＡ在分子长度和酶切类型上存在明显差异。还对天蚕、柞蚕、蓖麻蚕和家蚕的ｍｔＤ－ＮＡ限制性酶切电泳图谱进行了比较研究。     

绢丝昆虫茧丝蛋白酶抑制剂含量的比较分析

以 6种绢丝昆虫的茧壳为材料 ,对茧丝蛋白酶抑制剂的含量及热稳定性进行了研究。结果表明 :家蚕品种间茧丝蛋白酶抑制剂的含量差异极显著 ,外层丝中含量较多 ,F1代的含量呈双亲中间型 ,偏向于含量较多的亲本 ,雌雄间含量无显著差异 ;家蚕茧丝蛋白酶抑制剂对热稳定性较强 ;天蚕绿茧、野蚕的茧丝中有少量的蛋白酶抑制剂存在 ,蓖麻蚕的茧丝中有微量蛋白酶抑制剂存在 ,天蚕黄茧、柞蚕茧、樗蚕茧的茧丝中基本无蛋白酶抑制剂存在。     

家蚕主要血浆蛋白质的发育变化及与其它蚕的比较研究

用SDS-聚丙烯酰腔凝胶电泳(SDS—PAGE)法,观察了家蚕不同发育阶段血液主要血浆蛋白质浓度的发育变化,比较了不同的地方性三眠蚕品种间主要血浆蛋白质组成及浓度的异同。比较家蚕与野桑蚕、蓖麻蚕、樗蚕及柞蚕血浆的电泳图谱,发现家蚕与野桑蚕的电泳图谱相似而不同于蓖麻蚕、樗蚕和柞蚕。后三者之间的电泳图谱很相似,它们不存在类似于家蚕及野桑蚕中的分子量为30KD的一组蛋白质,但也存在分子量相当于家蚕贮藏蛋白质的成分。用精制的家蚕贮藏蛋白质、30K蛋白质和卵黄磷蛋白分别制备免抗血清,并使之与五种试验蚕的血液分别进行了双向免疫扩散试验。