传染性法氏囊病病毒VP2基因真核表达载体的构建及初步表达

根据GenBank已登录的传染性法氏囊病病毒VP2基因序列,设计1对特异引物,应用反转录-聚合酶链反应技术从标准毒株B87中扩增了VP2基因,将其克隆到proVAX载体上,构建了proVAX-VP2真核表达载体,在脂质体介导下转染Hela细胞,用RT-PCR方法从转录水平证实VP2在Hela细胞中有特异性表达。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因真核细胞表达载体的构建及免疫应用研究

应用DNA重组技术将含有IBDV保护性抗原VP2质粒，以EcoRI、xhoI酶切，将酶切得到的VP2基因移入到载体pcDNA3CMV启动子下游，得到含有IBDV VP2基因的真核表达载体pcD-VP2基因疫苗。pcDVP2体外转染细胞能正确表达目的的蛋白，免疫雏鸡后20d，在体内可检测到特异性抗体。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因在家蚕中的表达

传染性法氏囊病病毒（IBDV）能引起以淋巴细胞衰竭为特征的抑制性疾病。IBDV的主要结构蛋白VP2蛋白是主要的宿主保护性抗原，在VP2上的点突变是造成IBDV抗原漂变的主要原因。为研究VP2作为IBDV亚单位疫苗的潜力，本实验将IBDV JD1株的VP2基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中，将重组载体pBacPAK-VP2与病毒Bm-Bac-PAK6的线性化DNA共转染家蚕培养细胞，获得重组病毒BacPAK-VP2。DIG点杂交表明重组病毒基因组中含有VP2基因。重组病毒感染家蚕5龄幼虫后，用ELISA、SDS－PAGE和Western blotting检测蚕血淋巴中重组VP2蛋白的相对表达量及免疫反应性。结果表明重组VP2蛋白具有免疫反应性，感染后5－6d在蚕血淋巴中的表达量最高。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因植物表达载体的构建

采用含传染性法氏囊病病毒(HK46毒株)VP2基因的质粒FA-pAlter为模板，根据其序列设计引物进行PCR扩增，得到1．3kb左右的VP2基因产物；用Bgl Ⅱ和Nhe Ⅰ酶切后纯化，并在T4DNA连接酶的作用下，将其定向克隆到经Bgl Ⅱ和Nhe Ⅰ不完全酶切后的pcAMBIA3301质粒上，构建成VP2植物表达载体。以电击转化法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中，并用PCR方法进行了鉴定，为下一步的植物转基因研究生产可食用疫苗打下了基础。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因在昆虫细胞中的表达

本研究将鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(very virulent infectious bursal disease virus,vvIBDV)JM-1/10株VP2基因克隆至pcDNA-3.1(+)启动子CMV之后,随后将CMV-VP2基因序列一同克隆入杆状病毒表达系统的质粒 pFastBac^TM Daul中构建了pFast-CMV-VP2。将pFast-CMV-VP2转化Escherichia coli DH10Bac感受态细胞,筛选出重组质粒Bacmid-CMV-VP2。用 Bacmid-CMV-VP2转染Sf9昆虫细胞,获得了重组杆状病毒vBac-CMV-VP2。将该重组杆状病毒转导BHK-21细胞,48~72 h后经间接免疫荧光试验(IFA)检测到VP2蛋白具有特异性荧光;样品经Western blotting分析,结果显示目的蛋白得到表达。结果表明,本试验制备的重组 vBac-CMV-VP2 既能在昆虫细胞中表达,也可在哺乳动物细胞中表达。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因原核表达及抗原性分析

从辽宁省某鸡场分离到一株传染性法氏囊病病毒(IBDV)。以该毒株基因组核酸为模板,应用RT-PCR扩增得到VP2基因,构建表达质粒pET28a-VP2,再将其转化至大肠埃希菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析在48ku处出现特异性蛋白条带;经Western blot分析VP2蛋白可以与IBDV阳性血清发生特异性反应。用VP2蛋白制备的油乳剂疫苗免疫接种SPF鸡,2周后体内可以检测到特异性抗体。证明VP2蛋白具有重要的应用价值,为IBDV基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

不同传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2表达差异性分析

将在不同时间、地域从传染性法氏囊病（IBD）发病鸡群中获得的15个IBDV株分别用SPF鸡、鸡胚和鸡胚成纤维细胞增殖，经氯仿处理后，采用聚乙二醇沉淀、超速离心和不边疆蔗糖密度梯度离心的方法纯化病毒，检测表明，病毒主要分布于40%蔗糖层，对纯化病毒进行SDS-PAGE分析，结果显示，病毒结构蛋白VP2在不同毒株表达量有较大差异。本实验为IB-DV主要保护性抗原VP2高表达疫苗的研究奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因在转基因烟草中的初步表达

将鸡传染性法氏囊病病毒TS株VP2基因置于植物组成型表达启动子CaMV 35 S之下,构建了IBDV VP2基因的表达载体pBR-VP2,经根瘤农杆菌介导法将VP2基因整合到烟草基因组中,Northern杂交结果表明,转基因烟草中存在IBDV VP2基因的mRNA;Dot-ELISA和Western blotting检测表明IBDV VP2基因在烟草中得到了表达.     

传染性法氏囊病病毒VP5基因的克隆与原核表达

根据GenBank已登录的传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP5基因序列,设计合成了一对VP5基因特异性引物,应用RT-PCR技术从IBDV标准毒株中扩增得到VP5基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建了重组原核表达质粒pGEX-6P-1-VP5,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,IBDV VP5基因在大肠埃希菌BL21中得到了正确表达,所表达的融合蛋白与IBDV阳性血清具有特异性抗原抗体反应。     

鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的融合表达及兔抗血清的制备

以鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)Gt株基因组RNA为模板,通过RT-PCR扩增VP2基因,经EcoR Ⅰ/Sal Ⅰ酶双酶切处理后与经相同酶切处理的pET30a原核表达载体连接,将酶切、PCR及序列鉴定正确的阳性重组子转化E. coli DE3菌,经IPTG诱导,表达的VP2蛋白通过Ni-NTA树脂纯化后,免疫新西兰白兔,制备兔抗血清,并对其进行间接ELISA、IFA和Western blot分析.SDS-PAGE分析表明,在IVFG诱导下成功表达了约为50 kDa的His-VP2融合蛋白;间接ELISA检测制备的兔抗血清效价在1:25 600以上;IFA及Western-blot分析结果表明,其可特异性结合真核表达的VP2蛋白以及IBDV全病毒.研究结果提示,免抗VP2血清可用于VP2蛋白及病毒的检测,为进一步研究IBDV分子生物学功能提供了物质基础.     

传染性法氏囊病病毒主要结构蛋白VP2、VP1和VP2-VP1串联基因的原核表达及其初步应用

为获得传染性法氏囊病病毒(IBDV)特异性抗体检测用抗原VP2、VP1及VP2-VP1蛋白,分别设计引物扩增IBDV野毒株NN1172的VP2和VP1基因,并扩增VP2和VP1基因中抗原性和亲水性较好的重要区域,通过PCR扩增基因串联方法对截短的VP2和截短的VP1基因进行串联,首次获得VP2-VP1串联基因,并对VP2、VP1和VP2-VP1串联基因进行了原核表达和鉴定。结果成功构建了原核表达载体pET-VP2、pET-VP1和pET-VP2-VP1;诱导表达条件显示,3个重组质粒分别转入BL21菌株后经0.05 mmol/L IPTG诱导表达,分别得到分子量为69、114和63 kDa的VP2、VP1和VP2-VP1重组蛋白,且均以包涵体形式表达,3个重组蛋白分别于诱导后5、3和6 h时表达量最多。Western blot结果显示,表达的VP2、VP1和VP2-VP1蛋白与鸡抗IBDV阳性血清均具有良好的反应原性。以纯化的VP2、VP1和VP2-VP1蛋白作为包被抗原对传染性支气管炎病毒(IBV)、呼肠孤病毒(ReoV)、禽白血病病毒(ALV)和新城疫病毒(NDV)4种阳性血清检测均为阴性,表明所获得的纯化蛋白具有高度的特异性;对免疫了IBD灭活疫苗,IBD基因工程疫苗和IBD弱毒疫苗的商业鸡群进行抗体检测,结果均能显示疫苗免疫后机体抗体水平的变化趋势。本研究表明利用该原核表达系统所表达的3个蛋白均具有良好的免疫反应活性,为IBDV特异性抗体的检测和新型亚单位疫苗的研发奠定基础。     

鸡传染性腔上囊病病毒VP2基因在昆虫细胞中的表达

为了深入研究鸡传染性腔上囊病病毒（IBDV）VP2基因的结构和功能,利用Bac-to-Bac系统研制出含有VP2基因的重组杆状病毒rBac-VP2,将rBac-VP2感染Sf9细胞,并用抗IBDV VP2特异性单克隆抗体经间接免疫荧光试验检测,证实感染重组病毒Sf9细胞能高效表达IBDV VP2基因产物;Western-blotting分析结果表明,VP2基因表达产物的分子质量约为40 ku.     

传染性法氏囊病超强病毒株VP2基因原核表达及其免疫原性检测

为检测传染性法氏囊病超强毒株(vvIBDV)重组VP2蛋白的免疫原性,本研究利用RT-PCR方法扩增vvIBDV的结构蛋白VP2基因,并将其克隆到表达载体pGEX-4T-3中,构建重组表达质粒pGEX-VP2。将其转化受体菌E.coli BL21(DE3)plysS,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳和western blot分析表明,表达的重组蛋白约69 ku,并以包涵体形式存在。表达的重组蛋白经纯化后,免疫6周龄BALB/c小鼠制备免疫血清,ELISA分析表明制备的血清效价在1∶5 120以上,表明vvIBDV VP2具有良好的免疫原性,为建立vvIBDV的ELISA检测方法提供了试验依据。     

兔病毒性出血症病毒VP60基因真核表达载体的构建以及在真核细胞中表达

应用RT-PCR技术扩增编码兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因,将PCR产物克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,获得重组质粒pcDNA-VP60,并将其转染Vero细胞。经间接免疫荧光试验,证实pcDNA-VP60在体外细胞中能够成功表达具有免疫原性的VP60蛋白。     

PPV VP2-PCV2 ORF2真核表达载体的构建及对小鼠免疫效应试验

将猪细小病毒(PPV)VP2基因和猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2截短基因(47～207aa)克隆到真核表达载体pCI-neo,构建了含VP2和ORF2基因的融合表达质粒pCI-ORF2-VP2,经脂质体法转染PK15细胞后,用间接免疫荧光检测法测到融合蛋白能正常表达。将pCI-ORF2-VP2质粒肌注BALB/c小鼠(100μg/只),相同剂量免疫2次,间隔2周,同时设立圆环亚单位苗、细小灭活苗和空载体对照组,于免疫后7、14、21、28、42d无菌摘取脾脏作T淋巴细胞增殖试验,摘眼球采凝血和抗凝血,分别作PPV、PCV2抗体的监测和T淋巴细胞亚群的动态监测。结果显示,pCI-ORF2-VP2免疫小鼠脾脏T淋巴细胞对ConA刺激的反应性、诱导CD4+、CD8+T淋巴细胞的免疫功能和血清PPV/PCV2的抗体水平在不同时间段均显著高于空载体对照组。表明真核表达质粒pCI-ORF2-VP2能刺激小鼠产生良好的细胞免疫和体液免疫。     

Evaluation of modified vaccinia virus Ankara expressing VP2 protein of infectious bursal disease virus as an immunogen in chickens

A recombinant modified vaccinia Ankara (MVA) virus expressing mature viral protein 2 (VP2) of the infectious bursal disease virus (IBDV) was constructed to develop MVA-based vaccines for poultry. We demonstrated that this recombinant virus was able to induce a specific immune response by observing the production of anti-IBDV-seroneutralizing antibodies in specific pathogen-free chickens. Besides, as the epitopes of VP2 responsible to induce IBDV-neutralizing antibodies are discontinuous, our results suggest that VP2 protein expressed from MVA-VP2 maintained the correct conformational structure. To our knowledge, this is the first report on the usefulness of MVA-based vectors for developing recombinant vaccines for poultry.     

鸡传染性法氏囊病病毒DK株VP2基因序列分析及其对SPF雏鸡的致病力

为探究鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)DK分离株的致病性和遗传变异情况,本研究测定了该分离株的鸡胚半数致死量(ELD50)、对SFP雏鸡的致病力以及扩增病毒的VP2基因并分析其序列。结果显示,DK分离株对鸡胚的ELD50为104.5/0.2mL,以2×10^3ELD50剂量感染SFP雏鸡出现典型IBD的临床症状、剖检和组织学病变;实验鸡发病率为100%,致死率为44.4%;DK株VP2基因序列与参考株的同源性为93.1%~97.0%、氨基酸序列同源性为93.6%~97.5%,其基因序列和氨基酸序列均与Cu-1wt参考株(经典株)同源性最高;DK株VP2氨基酸序列的七肽区SASWSGS及249Q、253Q、279D、284A、290M、313V、330S氨基酸位点均与强毒株的氨基酸位点一致;但其222P、256V、299N3个氨基酸不符合IBDV超强毒株的特征;而其第222、249位氨基酸为P和Q,与抗原变异株(vIBDV)的T和K也不相同。结果表明:IBDVDK株为中等偏强毒力病毒。本研究为IBD的防控提供参考依据。     

传染性腔上囊病病毒VP3蛋白模拟表位的筛选

为了研究传染性腔上囊病病毒（IBDV）的致病机理及研制有效的IBDV疫苗，利用噬菌体展示技术对IBDV VP3抗原表位进行了筛选。以4株IBDV VP3单克隆抗体HRB-3F、HRB-7B、HRB-7C和HRB-10E作为筛选分子，对噬菌体随机15肽库进行3轮吸附-洗脱-扩增淘洗，从每株单克隆抗体筛选到的噬菌斑中随机挑取20个单克隆噬菌斑，通过间接ELISA和竞争抑制ELISA检测，共选出13个单克隆噬菌斑，经噬菌体gⅢ部分基因的核苷酸序列测定，确定了8个15肽为IBDV抗原表位。这8个15肽在一级结构上没有3个以上连续氨基酸与IBDV GX（Gen—Bank登录号：AY444873）VP3的氨基酸序列相同，但二级结构上均以β折叠为主，并且与单抗的结合可被VP3蛋白有效地抑制。证实，筛选的是IBDV VP3的模拟表位。     

Reduction of infectious bursal disease virus replication by shRNAs targeting the VP1 and VP2 genes driven by chicken U6 promoter

Infectious bursal disease virus (IBDV) causes a highly contagious and immunosuppressive disease in young chickens and results in considerable economic losses for the poultry industry. To suppress the replication of IBDV, two short hairpin RNAs (shRNAs) were designed for targeting the VP1 and VP2 genes of IBDV. Recombinant plasmids carrying each shRNA or two shRNAs were constructed based on vector pSilencer2.1-U6 in which the human U6 promoter was replaced with chicken U6 promoter. In chicken embryo fibroblasts, transfection with these shRNA plasmids 24 h before infection with IBDV B87 reduced 50% tissue culture infectious doses (TCID₅₀) from 10^8.75 TCID₅₀/0.1 mL to 10^3.75–10^1.0 TCID₅₀/0.1 mL. In 10-day old specific pathogen-free (SPF) chicken embryos, incubation with a mixture of IBDV B87 and a shRNA plasmid via the allantoic cavity resulted in 100% mortality and high IBDV virus titer in the control group but 25–0% mortality and near normal embryo development in the specific shRNA groups; additionally, IBDV VP1 and VP2 mRNA levels were reduced by 72–95% in the shRNA groups as compared with the control groups. When challenged with a virulent strain IBDV GX8/99, 14-day-old chickens pre-treated with the single shRNA plasmids or the dual shRNA plasmid showed approximately 70% or 90% survival at 5 days post-challenge while those pre-treated with control plasmid or saline had less than 5% survival. The current study suggests that two IBDV shRNAs expressed by a plasmid under chicken U6 promoter could effectively and synergistically reduce IBDV replication in vitro and in vivo.