牛腔前卵泡在体外无血清培养中发育为有腔卵泡

用无血清培养系统研究了牛腔前卵泡的体外培养。直径为100－200μm的牛腔前卵泡在添加L－谷氨酰胺、BSA、睾酮、转铁蛋白和硒的McCoy′s 5a培养液中培养，卵泡保持正常的形态结构并持续生长，培养10d左右形成贸泡腔，成腔率约50％。培养液中添加胰岛素对卵泡直径的增长和卵泡腔的形成有明显的促进作用，但添加FSH对腔前卵泡的生长未表现促进作用。     

牛腔前卵泡的体外培养

通过在α- MEM和 D- MEM/ F1 2 基础液中添加不同比例的 ITS、丙酮酸钠、谷氨酰胺、次黄嘌呤和血清 ,观察了不同基础液对牛腔前卵泡体外生长发育的影响 ,从而筛选出较好的组别。在筛选出的基础液组别中添加 3个水平的FSH、L H、E2 ,观察了其对牛腔前卵泡体外生长发育的影响。结果表明 ,α- MEM和 D- MEM/ F1 2 2种基础液中以α-MEM为好 ,不同的基础培养液组合对牛腔前卵泡的体外培养有一定的影响。添加不同水平的激素对牛腔前卵泡体外培养也有显著影响。试验初步筛选出最佳的培养液成分为α- MEM ITS(I- 5 m g/ L ,T- 5 mg/ L ,S- 5μg/ L ) 丙酮酸钠(0 .2 3mmol/ L) 谷氨酰胺 (1.5 m mol/ L) 次黄嘌呤 (2 m mol/ L) 血清 (7.5 % ) FSH(0 .2 5 mg/ L) L H(5 IU/m L ) E2 (0 .5 mg/ L )。     

促性腺激素(FSH、LH)对牛腔前卵泡体外发育及E_2分泌的影响

利用McCoy's 5a基础无血清培养系统研究了促卵泡素(FSH)、促黄体素(LH)2种促性腺激素对牛腔前卵泡的体外生长、存活及雌二醇(E2)分泌的影响.结果显示,培养液中单独添加LH对牛腔前卵泡生长影响不大,而单独添加50、100μg/L以上FSH对牛腔前卵泡直径增长和培养后期体外存活有明显的促进作用;当培养液中有10 μg/L LH存在时,2种促性腺激素协同刺激卵泡生长的作用更加明显.添加10 μg/L LH 50μg/L FSH对腔前卵泡体外生长、发育、存活及E2分泌均具有显著的促进作用(P<0.05).     

维生素对牛腔前卵泡体外培养的影响

用改良的McCoy’s 5a无血清培养液 (含 3mML -谷氨酰胺、0 1%BSA、2 0ng/ml睾酮、2 5 μg/ml转铁蛋白、10 0ng/ml胰岛素和 4ng/ml硒 ) ,在 96孔培养板中 ,每孔 2 5 0 μl培养液的条件下 ,研究了维生素C和维生素E对腔前卵泡体外发育的影响。结果表明 :在培养液中添加 90 μM的维生素C有利于维持腔前卵泡体外生长时结构的完整性 ,显著提高牛腔前卵泡体外培养 10天的存活率 (P <0 0 5 ) ,但并没有发现对腔前卵泡的生长、发育和成腔有促进作用 (P >0 0 5 ) ;在培养液中添加3 0 μM的维生素E对Φ >13 0 μm的腔前卵泡及其卵母细胞有促进发育和促进卵泡腔形成的趋势 (P >0 0 5 ) ;在培养液中联合添加 12 μM维生素E和 96μM维生素C ,能显著提高牛腔前卵泡体外培养 10天的存活率 (P <0 0 5 ) ,并对牛腔前卵泡的生长和发育有一定的促进作用 ,但差异不显著 (P >0 0 5 )。     

影响小鼠腔前卵泡体外发育因素的研究

通过在培养液中添加胎牛血清（FCS），牛血清白蛋白（BSA）及卵泡刺激素（FSH），对小鼠腔前卵泡进行体外培养，观察卵泡腔的形成及雌二醇（Estradiolum,E2)和睾酮（Testosteroni propioas,T)的分泌情况.     

牛腔前卵泡的机械分离与采集

本实验建立了皮肤移植刀切割、剪碎、分级过筛的牛卵巢腔前卵泡体外分离技术 ,分离出了在直径 6 0～180 μm的不同大小的腔前卵泡 ,提高了腔前卵泡的回收效率 [5 7.2 3± 10 .2 1(个 /h) ,n =2 0 ]。     

牛腔前卵泡体外培养前后质量评定

采用台盼蓝染色、相差显微镜观察以及透射电镜方法对体外培养前后牛腔前卵泡活力进行评定。结果表明,台盼蓝染色和相差显微镜观察检测卵泡活力有一定的误检率,超微结构检测能够客观、真实地反映腔前卵泡健康状况,可作为评定腔前卵泡培养系统优劣的一个可靠手段。在实际应用中,相差显微镜观察与超微结构评定相结合可发挥良好作用。     

山羊腔前卵泡卵母细胞体外发育与体外成熟的研究

通过比较3种培养基、5个培养系统和4种培养方法对卵母细胞生长率的影响,结果发现,就卵母细胞生长率而言。以MEM HEPES培养液＋5％FCS＋40μg/mlFSH 20ng/ml IGF-1 2mmol/L cAMP 2mmol/L次黄嘌呤培养系统为佳。在腔前卵泡体外培养过程中,12个卵泡经腔期发育,约占同等培养条件下卵泡九的2％（12／603）。培养卵泡经腔期发育并未改善其卵母细胞的成熟率（0／12）。腔前卵泡卵母细胞经过不同时间的体外培养,发现经12和14d培养结不的卵母细胞中,有81％（47／58）生发泡明显迁移至质膜下;培养14d的卵母细胞中,约16．4％（9／55）产生pbI但不排出,因而在胞质中见到极体;;培养16d得到1枚排出pbI的孤雌激活卵;同时发现培养16－18d卵母细胞退化率明显增高（P＜0．01）。推测山羊腔前卵泡卵母细胞体外培养的适宜时间为16d。     

体外培养牛腔前卵泡颗粒细胞的超微结构研究

透射电镜下，简易机械法分离得到的腔前卵泡有1～3层颗粒细胞，相邻颗粒细胞间存在明显而广泛的间隙连接，卵泡基膜完整，外无卵泡膜。培养过程中超微结构的变化与体内发育腔前卵泡类似。培养6d时观察到颗粒细胞增殖现象，培养15d时，个别卵泡的内膜细胞开始形成。超微结构研究结果表明，本培养体系适于小腔前卵泡的体外培养。     

Effect of Cryoprotectant Agents on the Potential Development of Sheep Preantral Follicles

Veterinary Research Communications -     

Effects of Growth Hormone on In Situ Culture of Bovine Preantral Follicles are Dose Dependent

The objective of this study was to evaluate different concentrations of growth hormone (GH) on the development of bovine preantral follicles cultured included in the ovarian tissue (in situ) on the rates of morphologically normal, viable, primordial and developing follicles, as well as the oocyte and follicle diameter and ultrastructural analysis. Ovarian fragments collected from cows with no cross‐breeds defined were cultured in situ for 1 and 7 days in minimal essential medium (α‐MEM+) supplemented with different concentrations of recombinant human GH (0, 10, 25, 50 ng/ml). The ovarian fragments non‐cultured (control) and cultured were processed for classic histology, mechanical isolation and electron transmission microscopy (MET). The parameters underwent anova (Tukey′s and Dunnett′s tests) and chi‐square test (χ²). After 7 days of culture, the treatment with 50 ng/ml GH showed no differences with fresh control (p > 0.05) and had greater effectiveness than in the 0, 10 and 25 ng/ml GH concentrations of the morphologically normal follicles. Regarding the primordial follicles, a reduction was observed in the 50 ng/ml GH concentration concomitant with the significant increase in developing follicles, differing from both the fresh control and the other GH concentrations tested. In addition, 50 ng/ml GH showed a larger follicle and oocyte diameter when compared to the other treatments cultured. Similar structures were ultrastructurally observed in the control group, 50 ng/ml GH. Follicles cultured in 10 ng/ml GH showed nuclear invagination, vacuoles and lesioned basal membrane. Hence, it is concluded that 50 ng/ml GH is the most effective concentration for the development of preantral follicles cultured in situ.     

哺乳动物腔前卵泡体外培养及研究进展

哺乳动物卵巢内的原始卵泡库是雌性生殖资源的储存库,但大部分卵泡在腔前阶段已退化闭锁了,这无疑是对这一资源的巨大浪费。因此,越来越多的学者致力于腔前卵泡的开发和利用,建立了一系列的培养体系,尤其在小鼠上做的比较成功,已经得到了少量后代。文章主要就卵泡的发生发育过程,腔前卵泡的分离方法,培养基的选择,不同直径腔前卵泡培养体系的建立,影响腔前卵泡发育的因素及研究进展进行了阐述,为进一步完善腔前卵泡培养体系,揭示其发育机理提供参考。     

猪腔前卵泡机械分离研究

本研究以分离到的卵泡数量、分离时间和卵泡在体外培养3 d后的存活率为指标比较了两种机械方法分离猪腔前卵泡的效果。结果表明:用针刮法分离猪腔前卵泡的数量(Φ<50μm:203600±59000;50μm≤Φ≤150μm:29.40±10.34;Φ>150μm:9.30±3.29)极显著(P<0.01)高于剪碎法(Φ<50μm:18900±12000;50μm≤Φ≤150μm:13.95±3.70;Φ>150μm:4.95±1.61),而且针刮法16.16±1.43 min分离时间比剪碎法(20.30±1.48)min短,(P<0.01)。体外培养3 d后,腔前卵泡存活率在两种方法之间没有明显差异。说明应用针刮法分离猪腔前卵泡能有效保护卵母细胞和颗粒细胞的正常形态以及基膜的完整性,从而使分离到的猪腔前卵泡维持正常的生理活性。     

小鼠腔前卵泡体外培养研究进展

哺乳动物卵巢中有数量丰富的腔前卵泡,小鼠腔前卵泡卵母细胞从开始尝试分离至今已经获得试管后代,为在动物生产中的应用奠定了良好的理论基础和技术路线。文章简要地综述了小鼠腔前卵泡体外培养的方法,主要讨论了血清、生殖激素等培养液添加成分对小鼠腔前卵泡培养的影响及小鼠腔前卵泡体外培养技术的发展前景。     

猪腔前卵泡体外培养研究进展

哺乳动物卵巢中有数量丰富的腔前卵泡,腔前卵泡体外发育的研究,对于揭示卵子发生和卵泡发育的内在规律有重要意义,并可以最大限度利用卵巢资源促进动物繁殖,保护濒临灭绝物种及人类生殖健康。猪腔前卵泡自开始研究以来,已取得了很大的进展。作者简要阐述了猪腔前卵泡培养方法、培养条件的研究进展及其体外培养技术存在的问题和发展前景。     

Effects of IGF‐1 on In Vitro Culture of Bovine Preantral Follicles are Dose‐Dependent

This study aimed at assessing the effect of different concentrations of the growth factor similar to insulin 1 (IGF‐1) in the development, survival and ultrastructure of the bovine preantral follicles cultured in situ. Fragments of bovine ovarian cortical tissue were cultured during 1 and 7 days in 1 ml of α‐MEM⁺, supplemented with different concentrations of human recombinant IGF‐1 (0, 30, 70 and 100 ng/ml), in an incubator at 37°C and 5% of CO₂ in 24‐well plates with total replacement of the medium every 2 days. Non‐cultured ovarian fragments (control) and ovarian fragments cultured during 1 and 7 days were processed for classic histology, mechanical isolation and electron transmission microscopy (ETM). Parameters such as normality, viability, activation, development, diameter and ultrastructure were evaluated. All statistical analyses were carried out using sas Version 9.2. The results showed that the percentage of follicles morphologically normal in the IGF‐1 30 ng/ml treatment was similar to the fresh control (p > 0.05) both on the day 1 and on the day 7 of in vitro culture. In the viability analysis, the cultured treatments maintained the percentage of viable follicles during the entire culture period (p > 0.05). After 7 days of culture, the IGF‐1 30 ng/ml treatment showed higher percentages of developing follicles (48.33%) than those of the fresh control (22.22%) and the cultured treatments (p < 0.05). Also, after 7 days of culture, IGF‐1 30 ng/ml presented a higher follicular diameter when compared to the control and other concentrations of IGF‐1 tested. Ultrastructurally, the non‐cultured control and IGF‐1 30 ng/ml, after 7 days of culture, showed conserved oocytes, nuclei and organelles. Hence, it is concluded that IGF‐1 30 ng/ml was the most efficient concentration for the development of bovine preantral follicles cultured in vitro.     

一氧化氮对猪腔前卵泡生长发育的影响

旨在研究在培养液中添加不同浓度（0、0.001、0.01、0.1和1 mmol.L^-1）的一氧化氮供体硝普钠（Sodium Nitroprusside,SNP）对猪腔前卵泡体外生长发育的影响。结果显示,体外培养后,各处理组卵泡直径均增加,但未达显著水平（P〉0.05）;第6天1 mmol.L^-1SNP处理组卵泡存活率要显著低于1μmol.L^-1SNP（61.61%vs81.52%,P〈0.05）,与其它各组间差异不显著（P〉0.05）;卵泡成腔率在第4天以1μmol.L^-1SNP组最高,达到50%;第6天,1μmol.L^-1SNP组的卵泡成腔率显著高于0.1和1 mmol.L^-1SNP组（73.07%vs50%,47.62%,P〈0.05）,也高于对照组和0.01 mmol.L^-1SNP组,但差异不显著（P〉0.05）。培养结束（6 d）后,除1mmol.L^-1SNP组卵母细胞正常率显著低于1μmol.L^-1SNP组（71.21%vs 48.18%,P〈0.05）外,其余各组间差异不显著（P〉0.05）,其中0.001 mmol.L^-1SNP组卵母细胞正常率最高,为71.21%;0.001 mmol.L^-1SNP组COC回收率要显著高于其余各组（37.27%vs 22.88%、25.59%、20.74%和19.39%,P〈0.05）。结果表明,NO对猪腔前卵泡的存活、发育成腔及卵母细胞发育都有促进作用,但高浓度会产生毒性作用。