棉花花粉管通道法转基因的分子细胞学机理研究

利用花粉管通道法转基因,由于具备不受基因型限制、操作简单、易于育种工作者掌握等显著特点,自我国科学家周光宇先生提出后,引起科学工作者的关注.目前,多数利用花粉管通道法获得转化后代的研究报告,提供了分子生物学证据.中国棉花抗虫转基因工程实践为花粉管通道法作了有力的实践证明.然而,国内外有些学者提出了种种看法,或者试图否认该方法的科学性(Potrykus,1990;Moore等,1997),或者对这一方法持观望态度.     

花粉管通道法介导的棉花遗传转化

花粉管通道法介导的遗传转化是一种借助于植物自身的种质细胞卵细胞或受精卵为转化对象的直接转化技术。作为一种颇具特色的转基因技术,由于具备无基因型限制和易于实现大规模基因转化的特点,可以在任何开花植物和不同物种之间实现基因的转移,使得受体物种在获得新的基因型的同时,也获得转基因所表达的新的表型性状,由此成为为农作物转基因育种的崭新技术途径。利用花粉管通道法,成功地进行了棉花的抗虫／抗病的基因工程,获得了多种实用化的抗虫／抗病转基因棉花新品种(系),进入了棉花大面积生产。     

百合花粉管通道法遗传转化的研究

为了提高百合花粉管通道法遗传转化效率,采用pBI121-GFP-FT载体,对外源基因携带形式、导入方式和导入时间进行了研究。对质粒和农杆菌两种形式携带的外源基因的研究结果表明：菌液形式携带外源基因有利于百合花粉管通道法遗传转化。采用切割柱头授粉后涂抹外源基因、常规授粉后涂抹外源基因以及子房注射外源基因3种导入方式进行百...     

花粉管通道法转化小麦影响因素的研究

以西农1376和中13小麦品种(系)为受体,携带叶片衰老抑制基因PSAG12-IPT的pCM鄄LA35-1质粒为转化载体,对花粉管通道转化法中的基因型、转化时间、质粒DNA浓度进行了研究。结果表明:不同基因型、转化时间对结实率影响不显著,质粒DNA浓度对结实率影响显著。在0~700ng/μl范围内,小麦结实率随着质粒DNA浓度的增加而降低,其中质粒DNA浓度300ng/μl和500ng/μl与对照相比结实率差异达到显著水平,而700ng/μl则达到极显著差异。不同基因型的转化率因转化时间和质粒DNA浓度的不同而有所差异,其中西农1376的适宜转化时间为40~80min,适宜质粒DNA浓度为300~500ng/μl,以500ng/μl×40min处理的转化率最高,而中13小麦的适宜转化时间为80~120min,适宜质粒DNA浓度为300ng/μl。     

用花粉管通道转化法将兔防御素基因导入新疆陆地棉试验

介绍了用花粉管通道转化方法对新疆陆地棉新陆早7号和新陆早8号进行基因转化的初步研究结果.     

花粉管通道法转化影响因素的分析

花粉管通道法转化过程中外源基因转化途径、转化受体细胞、转化时间是重要的影响因素;结合大豆花粉管通道形成与受精过程,突出受体细胞的感受态的获得,对转化操作要点加以分析,为花粉管通道法的进一步研究指明方向.     

牡丹花粉管通道形成时间初探

人工授粉后 ,于不同时间段剪除“凤丹白”牡丹的柱头 ,根据种子发育状况初步探明了牡丹花粉管通道形成所需的时间。结果表明 :牡丹授粉 1h后已形成花粉管通道。为牡丹花粉管通道法转基因技术研究奠定了一定的理论和实践基础     

烟草花粉管通道导入外源DNA研究初探

以不同浓度的 pIG12 1Hm质粒DNA为供体 ,在烟草授粉后不同时期 ,采用不同的方法经花粉管通道导入 ,收获的种子经卡那霉素 (Km )抗性筛选。结果表明 ,在授粉后 10h ,DNA浓度为5 0 0 μg/ml,采用注射的方法可得到最大转化率 (2 3.5 % )。     

花粉管通道介导外源DNA导入技术的研究与应用

探讨了花粉管通道法介导外源DNA导入技术的分子机理,并对其在育种中的应用、转基因后代变异特点及目标性状的鉴定方法进行了综述,最后对该技术的应用前景进行了展望。     

提高棉花花粉管通道法转化率的研究

针对棉花不同受体材料、果台、棉铃大小、注射时间以及操作技术的研究 ,逐步总结出一套适合于新疆的实用操作方法。使外源 DNA通过花粉管通道导入技术得到了不断提高 ,注射棉铃未落铃率平均达到2 5 %以上 ,最高达到 5 6% ,大大提高了外源 DNA的转化率 ,获得了针对性强的高表达率转化棉花植株     

TAIL-PCR对红莲型水稻不育系特异片段HL-sp1侧翼序列的分析

以红莲型水稻不育系粤泰A（YTA）线粒体DNA为模板,在具有细胞质遗传的线粒体特异性片段HL-sp1侧翼各设计3条特异性巢式引物（LSP1﹑LSP2﹑LSP3﹑RSP1﹑RSP2、和RSP3）,利用特异性引物和随机引物AD1﹑AD2和AD3,通过热交错PCR（TAIL-PCR）扩增HL-sp1的侧翼序列。通过扩增和序列分析得到了HL-sp1 5′侧翼1 456 bp和3′侧翼2 570 bp的序列。改进后的TAIL-PCR方法为线粒体目的片段的侧翼序列分析提供了一种简单而高效的方法。     

TAIL-PCR方法克隆约氏黄杆菌aroA基因序列

[目的]研究草鱼烂鳃病病原约氏黄杆菌芳香氨基酸代谢途径的合成基因aroA的全序列。[方法]以草鱼烂鳃病病原M165菌株基因组DNA为模板,分别利用5′和3′的3个特异性巢式引物与随机引物,通过热不对称交错PCR（TAIL-PCR）扩增菌株M165的aroA基因序列,并对其序列进行分析。[结果]电泳检测结果表明,扩增产物与预期扩增结果相符;测序结果分析表明,aroA基因序列全长1 230bp,编码410个氨基酸。aroA蛋白序列与Flavobacterium johnsoniae的aroA蛋白质序列具有高度同源性。[结论]TAIL-PCR方法为基因全序列的克隆提供了一种简便、高效的方法。aroA基因全序列的获得为进一步阐明aroA等营养相关因子对鱼类烂鳃病病原的致病力的影响奠定基础。     

TAIL-PCR的技术改良及对香蕉NBS-RGC5基因侧翼序列的克隆

香蕉枯萎病是一种毁灭性真菌病害,对香蕉的种植和产业发展危害严重,研究香蕉枯萎病相关的抗性基因,具有重要的理论意义。对TAIL-PCR进行技术改良,以简并引物组合的方式与特异性引物进行扩增,代替最初的单一简并引物方式,在TAILPCR 第一轮扩增的大循环中设置不同的退火温度;采用改良后的TAIL-PCR成功克隆了巴西蕉NBS型抗性蛋白（NBS-RGC5）基因的侧翼序列。     

TAIL-PCR方法克隆约氏黄杆菌aroA基因序列（摘要）

[目的]研究草鱼烂鳃病病原约氏黄杆菌芳香氨基酸代谢途径的合成基因aroA基因的全序列。[方法]以草鱼烂鳃病病原M165菌株基因组DNA为模板,分别利用5′和3′的3个特异性巢式引物与随机引物,通过热不对称交错PCR（TAIL-PCR）扩增菌株M165的aroA序列基因,并对其序列进行分析。[结果]电泳检测结果表明,扩增产物与预期扩增结果相符;测序结果分析表明,aroA基因序列全长1230bp,编码410个氨基酸。aroA蛋白序列与Flavobacterium johnsoniae的aroA蛋白质序列,具有高度同源性。[结论]TAIL-PCR方法为基因全序列的克隆提供了一种简便、高效的方法。aroA基因全序列的获得为进一步阐明aroA等营养相关因子对鱼类烂鳃病病原的致病力的影响奠定基础。     

花粉管通道法转Bar-Bt-1Ab基因到北方优质粳稻的研究

利用抗性外源基因的整合,获得对水稻害虫和除草剂均有一定抗性的的转基因植株,通过对遗传转化过程中各种条件的研究,将Bar-Bt-1Ab基因的高纯质粒DNA通过花粉管通道法转化到松粳9号、龙稻5号等粳稻品种中,并对抗性苗进行了初步筛选鉴定,获得转基因植株,优化北方粳稻高效的遗传转化体系。     

应用改良TAIL-PCR克隆黄瓜6PGDH基因上游序列

运用改良的热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR)对黄瓜6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(6-phosphogluconate dehydrogenase gene, 6PGDH)的上游序列进行了克隆。与最初的TAIL-PCR相比较,主要改进之处有:(1)根据Primer 5.0软件计算结果从随机RAPD引物库中筛选出合适的上游引物,低严谨和高严谨反应中的退火温度也分别进行了调整;(2)将热不对称交替反应继续应用到第3轮PCR扩增反应中以提高特异目的条带和减少非目的条带。经过3轮PCR扩增反应最终获得位于黄瓜6PGDH起始密码子ATG上游长度为517 bp新序列。试验结果表明,应用改良TAIL-PCR能快速、有效地克隆与已知区域相邻的序列。     

用本因分析法研究农业技术转化问题

从影响农业技术转化的22个因素中，筛选出科研单位经费渠道单一与运行机制不良、农民化素质低、农业生产资料价格高、农业经营规模小和推广体系结构不合理等5个本因。针对5个本因提出5项政策，再利用本因模型对这5项政策的影响力进行了模拟分析。提出：通过市场增加农业科研经费渠道、变革农业科研单位运行机制是提高农业技术采用率的首选措施。     

鹅源草酸青霉CBHⅠ基因克隆及真核表达载体构建

【目的】鹅源草酸青霉F67(Penicillium oxalicum Currie Thom)纤维素酶二糖水解酶(cellobiohydrolase,CBHⅠ)基因克隆并构建真核表达载体,为该菌株分子特性的进一步研究及构建高效纤维素分解菌奠定基础。【方法】首先通过兼并PCR法扩增CBHⅠ基因片段,然后利用改良热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术克隆CBHⅠ基因5′端和3′端侧翼序列,最后采用RT-PCR法扩增鹅源草酸青霉F67CBHⅠ基因序列全长,并对该基因进行生物信息学分析,构建pPIC9K真核表达载体。【结果】分别扩增到鹅源草酸青霉F67纤维素酶CBHⅠ基因片段A(EU574736)、5′端序列B1(EU603295)、3′端序列B2(EU652768)及全长基因C(EU727171),并成功构建真核表达载体pPIC9K-CBHⅠ;生物信息学分析表明,该基因蛋白序列与微紫青霉氨基酸序列同源性最高,达76%,前26个氨基酸为信号肽序列,疏水性可达2.63,由催化功能域、衔接区和真菌性纤维素结合域构成,其三级结构主要为β-sheet。【结论】鹅源草酸青霉纤维素酶CBHⅠ基因全长序列的克隆进一步丰富了丝状真菌的生物信息学资源;其真核表达载体的构建为将该菌株进一步在真核宿主中表达,从而获得高效工程菌株奠定了基础。     

通过改良农杆菌介导的floral-dip法和花粉管通道法转化紫薇

以绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因,分别用改良农杆菌介导的花序浸渍法(floral-dip)和花粉管通道法转化紫薇(Lagerstroemia indica),统计果实数、结实率、成苗率,然后用紫外灯照射28d左右的幼苗筛选转化株。结果表明:花粉管通道法转化紫薇的结实率、成苗率均明显高于floral-dip法;用手携式紫外灯(365nm)照射进行活体鉴定,floral-dip法转化率比花粉管通道转基因法转化率高0.06%,但未达到显著水平;而花粉管通道法的结实率比floral-dip法的高11.87%～26.74%,更利于获得转化植株。说明通过花粉管通道法进行转化更适合于紫薇转基因新品种的培育。     

超声波直接转导外源基因转化八棱海棠的技术研究

应用超声波直接转导法,对八棱海棠进行rolC基因转化,同时,利用gus基因瞬间表达的方法研究了超声波处理时间、处理功率和转化缓冲液中二甲基亚砜(DMSO)对rolC基因转化率的影响.结果表明:当DMSO为5%(体积分数)时,用80 W功率处理20 min,能够获得最佳的转化效果.在超声波最佳处理条件下转化486个八棱海棠叶片,共得到237个抗性愈伤组织和9株抗性苗,转化率为1.85%.GUS染色、PCR及Southern blotting检测结果显示,有8个八棱海棠株系的基因组中整合了完整的外源rolC基因.