伪狂犬病病毒TKˉ/gIˉ株PK基因转移载体的构建及LacZ基因表达

伪狂犬病病毒TKˉ/gIˉ株基因组经AscⅠ酶切获得含PK基因的8.7kb片段,将此片段克隆入pPolyⅡ载体的AscⅠ位点,获得中间载体P8-AA,将LacZ表达盒插入其SphⅠ/NdeⅠ位点,构建重组转移载体P8AA-lacZ,将其与伪狂犬病病毒TKˉ/gIˉ株基因组共转染PK-15细胞,细胞出现病变后通过覆盖含有X-gal的营养琼脂进行蓝白斑筛选,通过蚀斑克隆方法分离到重组体PRV（rPRV）,且经过连续传代的rPRV仍能稳定的表达β-半乳糖苷酶活性。通过对重组病毒PRV-LacZ和亲本株TKˉ/gIˉ株TCID50的试验表明,PK基因的缺失对病毒增殖无影响。     

伪狂犬病病毒gE/TK基因缺失突变株的构建

在伪狂犬病病毒转移载体pBdTK-Uni的多克隆位点中插入由SV40启动子控制下的IacZ基因表达盒,同时在右侧同源臂下游插入一个1.7kb的KpnI片段,构建成一个新的转移载体pUhi-LacZ.用该载体与Bartha-K61株基因组通过脂质体法共转染Vero细胞,经过10代蓝斑筛选纯化和PCR鉴定获得了一株稳定表达LacZ基因的伪狂犬病病毒gE/TK基因缺失突变株,命名为rPrV-LacZ.在不同的细胞(PK-15、IBRS-2、Vero和CEF)上,对该重组病毒与亲本病毒的增殖滴度和细胞病变进行比较,未见显著差异.结果表明转移载体pBdTK-Uni具有实用性,可用于构建伪狂犬病病毒基因工程活载体疫苗.     

表达口蹄疫病毒3AB基因的伪狂犬病毒载体的构建

为了获得口蹄疫病毒3AB基因重组伪狂犬病毒载体,试验以伪狂犬病毒TK/gⅠ缺失疫苗株为亲本株提取病毒基因组DNA,用限制性内切酶AscⅠ酶切基因组获得含完整PK基因的8.7 kb片段,将此片段克隆入pPolyⅡ载体的AscⅠ多克隆位点获得中间载体P8-AA;用限制性内切酶SacⅠ+NdeⅠ酶切质粒P8-AA,切去PK基因中的2 218 bp片段,在质粒P8-AA的PK基因缺失区插入已构建好的质粒pEGFP-3AB中含绿色荧光蛋白(EGFP)基因和3AB基因的完整表达盒,转染于猪肾细胞。结果表明:成功构建出可以用于同源重组的转移载体P8-EGFP-3AB,并且在猪肾细胞中成功表达了绿色荧光蛋白基因。     

伪狂犬病病毒鄂A株TK—／LacZ＋突变株的构建

本研究以地高辛标记的含TK基因的BamHI/KpnI片段为探针，通过Southern杂交确定伪狂犬病病毒鄂A株基因组中一大小约5．9kb的KpnI片段中含有TK基因，回收该片段并克隆于PUC18铁KpnI位点，然后进一步克隆其中含TK基因的PstI/KpnI片段，并将LacZ表达盒插入到该片段中的BamHi位点，构建转移质粒pUEKPZ，该将质粒与伪狂犬病病毒鄂A株基因组共转染PK－15细胞，待完全病变后在X－gal存在下筛选蓝斑，蓝斑纯化3次后，经PCR扩增，Southern杂交证实获得的病毒为伪狂犬病病毒鄂A株TK－／LacZ 突变株。     

狂犬病病毒糖蛋白基因正向重组伪狂犬病病毒（疫苗株TK^-／gI^-）的构建

构建以伪狂犬病病毒(PRV)为载体表达狂犬病病毒糖蛋白的重组活载体疫苗。采用AseⅠ/MluⅠ切下EG-FP-rgp的表达盒,将其克隆入p8-AA载体的酶切位点处,经酶切鉴定为正向连接,阳性重组子命名为p8-EGFP/rgp。将该质粒与PRV TK-/gI-基因组在质脂体介导下共转染PK-15细胞,获得PRV-EGFP/rgp重组病毒;通过噬斑克隆对其进行筛选、纯化,并通过RT-PCR、Southern-blot、Western-blot和间接免疫荧光对其进行鉴定,并对重组病毒的滴度、外源基因的遗传稳定性及其与亲本病毒株生长特性的关系进行了测定。结果表明:重组病毒的滴度(TCID50)为108.125/mL;外源基因在细胞内得到了有效的表达,并具有良好的免疫反应性和遗传稳定性;PRV-EGFP/rgp与亲本病毒PRV TK-/gI-生长趋势差异不显著。通过构建表达狂犬病病毒糖蛋白正向重组PRV的活载体疫苗的研制,为狂犬病疫苗的研制提供了新的思路和方法。     

表达口蹄疫病毒P1基因的重组伪狂犬病病毒TK/gG-/PgG-P1的构建

为了构建口蹄疫与伪狂犬病二价基因工程疫苗株 ,将口蹄疫病毒 (FMDV) P1基因插入到伪狂犬病病毒 (PRV)通用载体 p Pg G- uni中 ,得到 PRV转移载体 p Pg G- P1。将转移载体与 Eco R 线性化后的 PRV弱毒疫苗株 TK- /g G- / lac Z 基因组 DNA共转染 PK- 15细胞 ,转染产物经多次空斑纯化和 PCR鉴定 ,获得了纯化的重组 PRV TK- /g G- / Pg G- P1,重组病毒基因组 DNA经酶切鉴定进一步表明 ,FMDV的 P1基因已成功地整合到 PRV弱毒疫苗株的基因组中。Western blot试验表明 ,FMDV P1基因在重组 PRV中得到表达。该研究为进一步研制口蹄疫与伪狂犬病二价基因工程疫苗奠定了坚实的基础     

重组伪狂犬病病毒介导的siRNA对高致病性PRRSV N蛋白基因表达的抑制作用

构建表达HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因的siRNA重组伪狂犬病病毒3株,将其感染PK-15细胞,在细胞水平上评价重组伪狂犬病病毒介导的siRNA对N蛋白表达的抑制效果.PCR扩增带CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因,通过酶切将CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因分别插入伪狂犬病病毒转移载体pUSKBH中,构建重组伪狂犬病病毒通用转移载体pUsiRNA.分别用BamH Ⅰ和HindⅢ酶切pUsiRNA,回收后与HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因的3个siRNA分子连接,构建表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒表达载体.将鉴定正确的重组伪狂犬病病毒表达载体与伪狂犬病病毒DNA共转染PK-15细胞,经同源重组及噬斑纯化获得表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒株,应用PCR及Southern blot鉴定重组病毒.将HN1株N蛋白基因的真核表达质粒pAcGFP1-N转染PK-15,经筛选获得稳定表达N蛋白基因的细胞.将鉴定正确的表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒接种于稳定表达N蛋白基因的细胞,利用绿色荧光蛋白基因及半定量RT-PCR检测重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA对N蛋白表达的抑制效果.结果显示,PCR扩增到的CMV-siR-NA-poly(A)片段约为0.7kb,新霉素基因约1.5kb.经酶切、PCR及测序鉴定,构建了表达siRNA的通用伪狂犬病病毒转移载体pUsiRNA.经PCR及Southern blot检测,获得了3株表达HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒gG-/siRNAN1、gG-/siRNAN2和gG-/siRNAN3;经荧光显微镜观察和半定量RT-PCR检测表明,重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA能够显著抑制N蛋白在PK-15细胞中表达,其中gG-/siR-NAN2抑制效果最好.这为深入研究N蛋白基因siRNA抑制HP-PRRSV复制奠定基础,并为HP-PRRSV的防制提供新的思路.     

通用伪狂犬病病毒转移载体的构建

克隆伪狂犬病病毒（ＰＲＶ） Ｂａｒｔｈａ－Ｋ６１株基因组的ＫｐｎⅠ　Ｊ片段,然后亚克隆其中的ＫｐｎⅠ－ ＰｓｔⅠ片段,缺失重组质粒中的ＥｃｏＲⅠ位点和ＮｏｔⅠ－Ｈｉｎｄ Ⅲ片段;再用ＡｃｃⅠ切去３７８ｂｐ,在此缺失位置插入来源于ｐＣＲ３－Ｕｎｉ的ＣＭＶ启动子、多克隆位点和ＢＧＨ ｐｏｌｙＡ信号,构建了通用 ＰＲＶ转移载体 ｐＢｄＴＫ－Ｕｎｉ。此转移载体为改造 Ｂａｒｔｈａ－Ｋ６１株及开发二价或多价基因工程疫苗提供了有力工具。     

伪狂犬病病毒鄂A株 TK－／LacZ＋突变株的构建

本研究以地高辛标记的含TK基因的BamHI／KpnI片段为探针，通过Southern杂交确定伪狂犬病病毒鄂A株基因组中一大小约5.9kb的KpnI片段中含有TK基因，回收该片段并克隆于pUC18的KpnI位点。然后进一步克隆其中含TK基因的PstI／KpnI片段，并将LacZ表达盒插入到该片段中的BamHI位点，构建转移质粒pUEKPZ。将该质粒与伪狂犬病病毒鄂A株基因组共转染PK-15细胞，待完全病变后在X-gal存在下筛选蓝斑，蓝斑纯化3次后，经PCR扩增、Southern杂交证实获得的病毒为伪狂犬病病毒鄂A株TK     

伪狂犬病病毒通用转移载体的构建及应用

将来自质粒pFSV40的300bpBamHI/PstI片段[其中含有SV40poly(A)和部分多克隆位点]插入到质粒pUSK相应的酶切位点中，获得重组质粒USKSV40。该重组质粒中gG基因5’端编码区缺失了428bp。将来自质粒pcDNA3.1( )的946bpBglⅡEcoRI片段（其中含CMV启动子及部分多克隆位点）插入到质粒pUSKSV40的BamHIEcoRI位点，构建了通用载体pPRVCMV-uni，其中含有CMV启动子，SV40poly(A)以及NheI,Pme1,BamHI,BstXI,EcoRI,StuI,XbaI等7个单一克隆位点，将eGFP基因插入到该通用载体的BamHI和EcoRI之间，用所获得的转移载体与TK/gG-/LacZ^ PRV基因组共转染PK-15细胞，经检测eGFP基因在重组伪狂犬病病毒中获得表达，从而证实该通用载体的构建是可行的。本研究研制以伪狂犬病病毒为载体的二价或多价基因工程疫苗奠定了物质基础。     

含PRRS病毒ORF5的伪狂犬病病毒TK基因缺失转移载体的构建

提取伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）ＢａｒｔｈａＫ６１株基因组ＤＮＡ,用限制性内切酶ＫｐｎＩ充分消化,回收５．９ｋｂ片段（Ｊ片段）,将其克隆于质粒ｐＵＣ１１９ ＫｐｎＩ位点上,获得ｐＢＫＪ。用两对针对ＰＲＶ ＴＫ基因的特异性引物对重组质粒进行ＰＣＲ鉴定,证明其中含有ＰＲＶ ＴＫ基因。然后用ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ和ＢａｍＨＩ等限制性内切酶对其进行酶切分析,确定了克隆片段的物理图谱。进一步研究证实ＴＫ基因位于其中的     

伪狂犬病病毒PK基因的克隆与PK、gG双缺失转移载体的构建

地高辛标记伪狂犬病病毒（PRV）Ea株短区段蛋白激酶（PK）基因3′端0．4kb片段，Southern杂交确定短区段PK基因定位在基因组DNA BamH Ⅰ 4．0kb片段中。将该片段克隆获得重组质粒pSB304，对pSB304亚克隆，构建了仅含完整PK基因约1．3kb片段的重组质粒pSB305，并进行了序列测定。结果表明，PK基因存在2种可能的同框编码方式，分别编码388或334个氨基酸残基，并具有真核细胞蛋白激酶催化结构域序列。同国外PRV NIA-3、Ka株相比，氨基酸同源性分别为98．8％和97．3％，有意义的是Ea株、Ka株均较NIA-3株在同一位置缺失2个氨基酸（Asp，Gly）。进一步对pSB305和含gG全基因以及部分gD基因的质粒pUSK进行酶切拼接，将PK基因大部分编码区、gG基因5′端部分编码区进行缺失，构建成两端同源侧翼分别为3．1kb和1．6kb的PK、gG双缺失转移载体pLR001。上述结果为深入研究PK基因功能及研制更安全的TK^-／PK^-／gG^-三缺失基因工程疫苗奠定了基础。     

表达乙脑病毒PrM基因重组伪狂犬病病毒的构建

本研究以乙型脑炎病毒SA14—14—2疫苗株基因组RNA为模板，采用RT—PCR一步法扩增了PrM基因的全长cDNA（558 bp），用BamHI和EcoRI双酶切PrM基因的扩增产物，回收目的基因后将其克隆至经同样酶切的伪狂犬病病毒通用转移载体pPgG-uni中，获得了转移载体pPgG-PrM，并对其外源片段进行了测序。序列分析结果表明：与已报道的乙型脑炎病毒SA14强毒株和SA14-14-2疫苗株的核苷酸序列比较，PrM基因的同源性为100％。以伪狂犬病病毒Ea株TK^-／gG^-／LacZ^＋突变株为载体构建了一株表达乙型脑炎病毒PrM基因的重组伪狂犬病病毒TK^-／gG^-／PrM^＋，为进一步开展猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

猪伪狂犬病病毒流行株gE/gI双基因缺失突变株的构建及纯化

根据GenBank中公布的猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)US区基因序列(KJ789182),设计2对特异性引物,扩增PRV NY株gE/gI基因两侧序列,克隆至pUC-19载体,构建转移质粒pUC-gE/gILR,同时插入绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因,构建转移质粒pUC-gE/gILRE,作为重组同源臂。以PRV NY流行株为亲本株,将其基因组与转移质粒pUC-gE/gILRE共转染ST细胞,通过筛选绿色荧光蚀斑,获得含有荧光蛋白的重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~--EGFP~+。再以该毒株基因组与转移质粒pUC-gE/gILR进行同源重组,通过筛选无荧光蚀斑,纯化重组病毒,经PCR扩增、测序,证实获得了去除EGFP基因的重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~-。该重组病毒在ST细胞上培养时,与亲本株PRV NY具有相似的生长曲线,但该重组病毒的体外生长动力学比亲本株弱。本研究成功构建了1株针对目前PRV流行株的gE/gI双基因缺失病毒,为我国根除PR提供技术支持。     

乙型脑炎病毒NS1基因重组伪狂犬病毒的构建

设计1对引物从含有乙型脑炎病毒NS1基因的质粒pNS1上亚克隆NS1基因,将NS1基因插入到中间转移载体pUSK中，获得重组中间转移质粒pUSK—NS1。将pUSK—NS1与伪狂犬病毒Ea株TK／gG／LacZ^ 突变株基因组共转染真核细胞IBRS-2，通过空斑纯化得到了乙型脑炎病毒NS1基因重组伪狂犬病毒株TK／gG^-／NS^ 1。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的NS1蛋白。该重组病毒可作为猪乙型脑炎和伪狂犬病双价基因工程疫苗用毒株。     

伪狂犬病病毒鄂A株gG^—／LacZ^＋突变株的构建

以从湖北某猪场分离鉴定的鄂A株为亲本，提取其基因组DNA，克隆含gG基因的SphI/KpnI片段，然后将LacZ基因融合到gG启动子下游，得到重组质粒pUSKZ,将重组质粒与鄂A株基因组共转染PK－15细胞，待细胞完全病变后，在X－gal存在下，作蓝斑筛选纯化。经斑点杂交和PCR扩增证实得到的是基因型为gG^-/LacZ^ 的重组伪狂犬病病毒。     

以伪狂犬病病毒(Bartha-K61)为载体正向表达狂犬病病毒(8202株)糖蛋白重组疫苗的构建

构建以伪狂犬病病毒Bartha-K61株为载体的正向表达狂犬病病毒(8202株)糖蛋白的重组活载体疫苗.将eGFP-rgp的表达框克隆入p8-AA载体的Mlu Ⅰ/Nde Ⅰ酶切位点处,经酶切鉴定为正向连接,阳性重组子命名为p8AA-eGFP/rgp.在质脂体介导下将该质粒与Bartha-K61共转染PK-15细胞,获得rPRV/eGFP/rgp重组病毒.对纯化后的重组病毒进行RT-PCR、Western-blot和间接免疫荧光鉴定.结果表明,重组病毒的滴度(TCID_(50))为10~(8.125)/mL;外源基因在细胞内得到了有效的表达,并具有良好的免疫反应性和遗传稳定性;通过构建表达狂犬病病毒糖蛋白正向重组Bartha-K61的活载体疫苗的研制,为狂犬病疫苗的研制与开发奠定基础.     

伪狂犬病毒5基因缺失株体外重组获得缺失基因的研究

为研究伪狂犬病毒缺失株体外重组情况,将伪狂犬病毒5基因缺失毒株PRV-gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-株与野毒株等量混合,经PK15细胞连续传代至第10代,通过分析第10代培养物中毒株类型和比例了解缺失毒株体外同源重组的情况。结果发现,除PRV野毒株和PRV-gE-/gI-/US9-/△UL49.5/TK-株外,出现了5种新的基因组合类型,分别为PRV（gI-/gE-/US9-/TK-）、PRV（gI-/gE-/US9-/gN-）、PRV（gI-/gE-/US9-）、PRV（TK-）、PRV（gN-）,病毒重组百分率为72%。重组毒株中以gI/gE/US9三基因缺失型为主,占重组蚀斑数的41.7%,占挑选蚀斑数的30%,高于野毒株和5基因缺失毒株的比例（26%和2%）,成为主要的优势重组毒株。从各病毒类型比例上看,缺失株同时获得所有缺失基因的几率很小,且重组后的毒株趋向于稳定的自然缺失毒株（如gE自然缺失的Bartha株）。5种新的基因组合类型的毒株以103.0TCID50接种健康易感家兔,未出现伪狂犬病典型临床症状,安全性好。     

表达绿色荧光蛋白为伪狂犬病病毒转移载体的构建及转移特性

对含伪狂犬病病毒（PRV）鄂A株gG全基因，PK，gD基因部分编码序列的质粒pUSK进行改造，肖除其中的EcoRI位点，将通过PCR扩增的增强绿色 荧光蛋白基因（EGFP）融合到gG启动子下游，构建了由gG启动子控制EGFP表达的PRV转移载体pgG^-1/EGFP^ ，该转移载体单独转染或同PVR基因组DNA共转梁IBRS－2细胞，结果单独转染时EGFP不能表达，共转梁时，6h就可在荧光显微镜下观测到明显的荧光。