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猪圆环病毒多重PCR诊断方法的建立 总被引:8,自引:0,他引:8
根据GenBank中20株猪圆环病毒(PCV2)核苷酸序列设计两对引物,建立的检测猪圆环病毒的多重PCR方法,其中引物P1、P2为PCV特异性,扩增938bp片段。P3、P4为PCV2特异性扩增490bp,因此本方法不仅可以扩增PCV片段,还可以同时区分PCV1和PCV2。该方法具有良好的特异性和敏感性,为猪圆环病毒的临床诊断与流行病学调查等研究奠定了基础。 相似文献
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猪圆环病毒多重PCR诊断方法的建立 总被引:2,自引:0,他引:2
猪圆环病毒(PCV)是迄今发现的最小白勺动物病毒。主要引发猪断乳后多系统衰竭综合征(PMWS),该病主要特征是猪进行性消瘦、多系统病理损伤.严重影响断乳猪生长发育。对PCV和PMWS的一系列研究表明,PCV在猪体内长期演变过程中,产生了有致病性的变异株,称为PCV2, 相似文献
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猪圆环病毒PCV属于圆环病毒科,根据国外已经报道的猪圆环病毒的序列,设计了下面的一对引物,上游引物和下游引物(upper:5'-TTTTTATCACTTCGTAATGGTTTTT-3'lower:5'-GGCCCCCTTCCTCCGTG-GATTGTTC-3'),提取DNA,对PCV-2进行PCR试验.然后对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳.结果显示,从美国进口的种毒中扩增出了长为1768bp的基因片段.本试验可以从病料或全血中检测出PCV,且该方法能区分PCV-1和PCV-2,快速、敏感、特异性强,适合于PCV的检测. 相似文献
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猪巨细胞病毒环介导等温扩增方法的建立 总被引:2,自引:0,他引:2
根据GenBank已登录的猪巨细胞病毒(Porcine cytomegalovirus,PCMV)gB基因的DNA序列设计合成4对特异性引物,通过优化反应条件,以及敏感性、特异性检测,建立了猪巨细胞病毒的环介导等温扩增检测方法(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP);用建立的检测方法对2013年来自四川省雅安、成都、绵阳、眉山、乐山、德阳、遂宁、资阳等市的136份病料进行猪巨细胞病毒检测,将检测结果与常规PCR方法检测结果进行比对。结果显示,本试验建立的方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,是常规PCR的10倍;136份病料用LAMP检测,其中有89份样品为猪巨细胞病毒阳性,其阳性率与常规PCR方法检测的阳性相符率为100%。结果表明,本试验成功建立了PCMV的LAMP检测方法,可用于临床上PCMV感染猪的确诊,对PCMV的快速诊断、综合防控等具有重要意义。 相似文献
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猪圆环病毒复合PCR检测方法的建立 总被引:7,自引:0,他引:7
根据已发表的PCV—1和PCV-2全基因组序列,设计了3条引物,组成PCV-2的特有引物对和PCV-1、PCV-2的共有引物对,分别扩增长度为472bp和339bp的片段。为验证PCR扩增的特异性,将472bp的扩增产物纯化后,克隆到pMD18-T载体,转化大肠埃希氏菌TG1,对阳性克隆进行酶切及PCR鉴定,并测序。将该序列递交NCB1进行BL-AST同源序列比较,发现它与美国、加拿大及我国台湾的PCV-2毒株核苷酸序列的同源性均在99%以上,与PCV—1毒株的同源性为86%。结果显示,该方法最少可用于3μg病料组织和0.75pg DNA的PCV-2检出.具有很高的灵敏性。应用该PCR方法检测了浙江省和上海市47份“猪高热综合征”病料,PCV-2感染阳性率为36.17%,PCV—1单独感染阳性率为34.04%。 相似文献
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猪Hokovirus(PHoV)是近年来在香港发现的一种猪细小病毒。为及时评估该病毒在我国的感染及流行情况,本研究根据GenBank中登录的PHoV核苷酸序列设计并合成一对特异性引物,建立了PHoV的PCR检测方法。研究结果表明,所建立的PCR检测方法特异性强,对其它的猪主要病毒无交叉反应;敏感性较高,最低可以检测2.4×104拷贝/μL;而且重复性较好。采用该方法对2009年~2010年我国华东地区猪场的318份临床样品进行检测,结果显示38份样品为PHoV阳性,表明我国猪群中存在PHoV感染。本研究建立的PCR方法可以作为在临床上检测PHoV的一种有效手段。 相似文献
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为建立直接检测可疑病料中胸膜肺炎放线杆菌(APP)的PCR诊断方法,对用以扩增apxⅣA毒力基因3’端长约442bp的核苷酸片段的引物、模板、Taq DNA聚合酶、dNTPs的最适剂量及退火温度进行了优化筛选,并进行了特异性及重复性试验;以筛选出的优化条件,对临床可疑病料进行了PCR检测。结果,在25μL体系中,以5pmol/μL引物、0.25μL Taq DNA聚合酶、2mmol/L dNTPs、56℃退火温度对APP标准菌株apxⅣA毒力基因的扩增效果最好,重复性和稳定性高;而对类症菌株的扩增结果则为阴性,表明其特异性强。对分离到APP的病料PCR阳性率为100%(5/5);未分离到APP的纤维渗出性病料中,新鲜与陈旧病料PCR阳性率分别为70.59%(12/17)、50.00%(4/8),而非纤维渗出性病料的PCR结果均为阴性(0/45、0/9)。结果表明,建立的PCR方法特异、快速、稳定、敏感,优于细菌学方法,它可作为APP可疑病料的理想诊断方法。 相似文献
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为建立检测PHoV的TaqMan荧光定量PCR方法,本研究根据PHoV的VP2基因序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有VP2基因的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应.结果显示,该方法的检测灵敏度为10拷贝;而且该检测方法特异性较好,与猪的其他病毒核酸均无交叉反应;批内和批间的变异系数低于3.29%,表明该方法的重复性较好.对华东地区采集的225份临床样品进行检测,结果显示,PHoV的阳性率为14.2%.本研究建立的荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好,可以为PHoV的流行病学调查和发病机制等研究提供可靠的工具. 相似文献
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为建立牛巴贝斯虫(B.bovis)的TaqMan实时荧光PCR检测方法,本研究根据GenBank中B.bovis的18S rRNA基因保守序列,设计引物和TaqMan探针,通过优化反应体系,建立检测B.bovis的实时荧光PCR方法.试验结果表明:实时荧光PCR对靶基因的最低检测值为1.31×101 copies/μL,比常规PCR的敏感性高1 000倍;而且与牛的其他血液原虫无交叉反应;组内及组间重复性试验的变异系数均小于3%,具有良好的重复性;在23份被检样品中,实时荧光PCR和常规PCR的检出率分别为52.17%和30.43%.该检测方法的建立为B.bovis的检测提供了一种快速、敏感、特异的技术手段. 相似文献
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SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法检测猪细小病毒 总被引:1,自引:0,他引:1
为建立特异敏感的猪细小病毒(PPV)的SYBR Green I实时定量PCR检测方法,本研究根据GenBank上PPV NS1保守序列设计合成了1对引物,利用本实验室构建的重组质粒(pMD18-T-PPV NS1)为标准模板,对反应条件进行优化,绘制标准曲线,并进行熔解曲线分析,建立了PPV的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法.分别进行了特异性、敏感性及重复性检验,结果表明,本方法具有良好的特异性,与PRRSV、CSFV、PRV、PCV-2、SIV及阴性对照均为阴性;其最低检出量为7copies/μL,比PCR敏感100倍,且批内和批间重复性良好.用该方法对15份临床病料进行检测,并与常规PCR、环介导等温扩增(LAMP)方法进行对比,显示该方法灵敏度高、成本低,能够对样品组织中病毒进行定量检测,为快速检测PPV提供了有效的技术手段. 相似文献
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为建立猪圆环病毒3型(PCV3)荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中PCV3基因序列设计特异性引物和探针,经过反应体系和条件优化,建立了特异性检测PCV3的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。该检测方法在4.78×10~1拷贝/μL~4.78×10~9拷贝/μL质粒标准品范围内均有良好的线性关系;该方法特异性试验结果显示,其与多种常见猪病病毒均无交叉反应,特异性良好;本研究建立的方法敏感性是常规PCR方法的100倍,敏感性较高;批内批间重复性试验变异系数均小于2.3%,重复性良好。对临床样品的检测结果显示,该方法对PCV3的检出率高于常规PCR方法,并且PCV3阳性样品多存在混合感染情况。该方法的建立为PCV3的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。 相似文献
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根据GenBank中猪嵴病毒(porcine kobuvirus) 3D-RNA聚合酶基因序列设计并合成了1对特异性引物,建立了一种猪嵴病毒RT-PCR检测方法.反应产物测序结果与GenBank中猪嵴病毒SH-W-CHN/2010/China株比较,基因序列同源性为93%.利用该方法对猪蓝耳病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、链球菌、猪巴氏杆菌和大肠杆菌等病原核酸进行扩增,均无条带出现,表明该方法具有较高的特异性;敏感性试验表明,该方法最低能检测到的病毒核酸含量为1 pg.利用所建立的RT-PCR方法检测采集自我国四川地区123份临床样品,结果阳性率为59.3%,表明猪嵴病毒在四川地区猪群中流行率较高. 相似文献