猪瘟病毒E2基因的克隆及原核表达

利用RT-PCR技术扩增出不含信号肽的猪瘟病毒石门株的E2基因,将其克隆到PGEX-T-Easy 载体上,用BamH Ⅰ和HindⅢ进行双酶切,回收目的基因。将目的基因克隆到表达载体质粒pPROEX-HTb中,获得 重组质粒PPRO,EXE2,用pPROEXE2转化大肠杆菌,诱导含重组质粒PPROEXE2的大肠杆菌BL21表达E2基因蛋 白,研究E2蛋白与猪瘟阳性血清反应的特异性。结果表明,受体菌诱导后能表达E2基因蛋白,所表达的E2蛋白能 与猪瘟阳性血清发生特异性很强的反应。     

陕西省猪瘟病毒流行毒株E2基因变异分析初报

根据GenBank公布的猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)Shimen株全基因序列,设计并合成2对引物,用RT-PCR方法对采自陕西省部分地区的30份CSF病料中,CSFV流行毒株的E2基因进行了扩增,并将其克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌DH5α。提取pMD-18T-E2重组质粒,进行BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定,并对阳性质粒进行测序,将测序结果与HCLV疫苗株和shimen株E2基因及E2蛋白进行序列分析。结果表明,从30份病料中共扩增到10株CSFV流行毒株的E2基因;扩增的10株陕西CSFV流行毒株E2基因同源性为92.3%~99.6%,与Shimen株及HCLV疫苗株的同源性为75.0%~79.4%;10株CSFV流行株E2蛋白的同源性为90.0%~100%,与Shimen株和HCLV疫苗株E2蛋白的同源性分别为78.9%~84.4%和77.8%~83.3%。说明所扩增的10株陕西CSFV流行毒株的E2基因发生了较大变异。     

猪瘟病毒石门株E2基因4个抗原结构域的原核表达

【目的】对猪瘟病毒石门株E2基因进行原核表达，以期获得可溶性表达产物，为检测猪瘟抗体的ELISA试剂盒的研制奠定基础。【方法】用PCR技术扩增了重组S21质粒载体上的猪瘟病毒石门株E2基因的4个主要抗原结构域ABCD，A1A2，B和C。分别将4个片段克隆于pMAL－p2X载体中，经PCR、双酶切和测序鉴定，E2基因的4个主要抗原结构域片段的位置、大小和读码框均正确。将4个片段分别转化到表达菌TB1、BL21、BL21－CodonPlus(DE3)-RP和BL21(DE3)中，共得到16株重组表达菌，用IPTG进行诱导表达，对表达产物进行SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析。【结果】E2基因的4个主要抗原结构域均可在这4种表达菌中表达，但以BL21－CodonPlus(DE3)-RP的表达效果最好，可表达出可溶性并且产量较高的目的蛋白。免疫印迹结果表明，表达的目的蛋白可以被猪瘟阳性血清和针对E2蛋白的单克隆抗体所识别。【结论】只表达目的基因的抗原结构域，可以缩短表达片段的长度，有利于获得可溶性目的蛋白，并且具有良好的血清学反应的特异性。     

陕西省部分地区猪瘟流行毒株与疫苗毒株E2基因主要抗原区序列变异分析

研究陕西省猪瘟病毒E2基因主要抗原区变异情况,为猪瘟防控提供依据.用巢式PCR方法对猪瘟疫苗和采自陕西省部分地区的疑似猪瘟病料进行E2基因主要抗原区扩增并测序,将测序结果与HCLV疫苗株和Shimen株E2基因进行序列比对分析.结果表明,23株流行毒株之间的核苷酸同源性在86.0％～100％,氨基酸同源性在87.8％～...     

猪瘟病毒E2基因的克隆表达

PCR扩增猪瘟病毒(CSFV)定点突变后的E2基因,克隆至原核表达载体质粒pET-28a中,重组质粒pET28a-E2转化BL21(DE3),IPTG诱导,高效表达了E2基因,表达量达菌体总蛋白的25.3%。免疫印迹表明,所表达的蛋白是CSFV特异性的。     

陕西省猪瘟流行毒株E0和E2全基因分子特征分析

【目的】分析目前陕西省猪瘟病毒（CSFV）流行毒株的E0、E2全基因分子特征,为猪瘟防控提供参考。【方法】根据CSFV Shimen株及HCLV株全基因序列,设计并合成了4对引物,采用RT-PCR方法,从采自陕西不同地区的猪瘟病料中扩增E0、E2全基因并进行序列测定分析。【结果】从采集的病料中成功扩增了5株猪瘟流行毒株的E0、E2全基因,这5株流行毒株E0基因核苷酸同源性在94.4％～99.8％,与参考毒株ALD、Alfort187、Brescia、CAP、Glentorf、GPE、GXWZ02、HCLV、Paderborn、Rimes和Shimen的核苷酸同源性在80.4％～96.3％,氨基酸同源性在86.5％～99.3％。5株流行毒株E2基因核苷酸同源性在91.1％～98.0％,与参考毒株的核苷酸同源性在77.7％～94.6％,氨基酸同源性在85.2％～95.9％。5株流行毒株E0 Rnase活性区域氨基酸基序位点没有变异,但导致流行毒株发生免疫逃逸的E2蛋白关键位点中有3个发生了变异。【结论】测定的陕西省猪瘟流行毒株E0、E2基因序列变异明显,其中E2蛋白关键位点变异较大。     

山东省猪瘟流行毒株E2基因主要抗原编码区序列差异分析

用RT-PCR方法对山东省猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的E2基因进行克隆,用DNAstar软件对获得的CSFV及已发表的CSFV毒株E2基因核苷酸和氨基酸序列进行了比较和分析,构建了CSFV遗传发生树.结果表明:扩增的12株猪瘟流行病毒的E2基因长度均为270bp,与预期大小一致;12株病毒株均属于1个组群中的2个亚群,其中,病毒株SDTA-1、SDTA-2属于同一个亚群,E2基因与疫苗株HCLV相比,核苷酸、氨基酸同源性分别为83.5%、88.9%,其余10株病毒株属于同一个亚群,E2基因与疫苗株HCLV相比,核苷酸、氨基酸同源性分别为80.5%～83.5%、82.2%～84.4%.     

表达猪瘟病毒石门株E0和/或E2基因重组非复制型腺病毒疫苗的免疫保护试验

用已构建好的表达猪瘟病毒石门株E0基因的重组腺病毒pAd-E0、表达猪瘟病毒石门株E2基因的重组腺病毒pAd-E2以及联合表达猪瘟病毒石门株E0-E2基因的重组腺病毒pAd-E0-E2,肌肉和皮下接种免疫商品猪2次(间隔20 d),同时设非重组腺病毒PAD-CMV、常规猪瘟疫苗和空白对照组。二免21 d后进行CSFV石门株强毒超致死量(1 000倍TCID50)攻击,研究表达猪瘟保护性抗原基因重组腺病毒疫苗的免疫效果。结果表明,pAd-E0、pAd-E2和pAd-E0-E2免疫组猪的死亡率分别为50%,25%和25%,而常规猪瘟兔化弱毒疫苗免疫组的死亡率为40%,pAd-CMV免疫组和空白对照组猪全部死亡;在攻毒前,重组腺病毒免疫组抗体水平普遍较低,商品化疫苗免疫组能100%检测到抗体,而非重组腺病毒和空白对照没有检测到抗体;攻毒后pAd-E0、pAd-E2和pAd-E0-E2试验组中分别有75%,50%和50%猪体温超过40℃,常规苗试验组80%体温超过40℃,而PAD-CMV组和空白对照组所有试验猪体温均超过40℃,表明重组腺病毒疫苗具有一定的保护效果。表明,仅含有E0基因的重组腺病毒pAd-E0的免疫保护效果和常规疫苗还有距离;含有E2基因和E0-E2基因的重组腺病毒的免疫保护效果不亚于常规疫苗。     

2个猪瘟野毒株E2基因主要抗原区域的扩增及其序列分析

用RT-PCR技术对华东地区2份猪瘟病料的E2基因主要抗原编码区域进行了扩增和序列分析。结果表明这2个毒株的棱苷酸序列同源性为97．321％、氨基酸序列同湃性为100％，但2个毒株的序列与我国的标准强毒Shimen株、疫苗毒HCLV株的差异较大，核苷酸序列、氨基酸序列均只有80％左右，与法国Alfort、意大利C1W株棱苷酸和氨基酸序列的同源性分别为84％～87％和91％。参考国内外对猪瘟病毒基因组的分型方法，将这2株猪瘟病毒归为基因Ⅱ型。     

猪瘟流行毒株E0蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

【目的】表达猪瘟保护性抗原E0蛋白,用以建立猪瘟抗体检测方法,为进一步开发诊断试剂盒和研究E0蛋白的免疫学功能奠定基础。【方法】将猪瘟野毒株FJ237-E0基因插入原核表达载体pET32a中,以BL21(DE3)为表达菌株进行诱导表达,将表达的重组蛋白通过His亲和层析柱进行纯化,以纯化的His-E0融合蛋白作为诊断抗原,通过探索抗原包被量和抗体血清稀释倍数,建立检测猪瘟E0抗体的ELISA方法。【结果】成功克隆了CSFV E0基因,其核苷酸序列为687 bp,编码229个氨基酸。经His亲和层析柱纯化检测纯度为0.587 mg/mL;SDS-PAGE电泳结果显示,表达的E0蛋白分子质量约为50.3 ku,表达的重组蛋白为可溶性蛋白,表达量占菌体总蛋白的30%;ELISA方阵确定的最佳抗原包被量为100 ng,血清稀释倍数为1∶30,建立的ELISA方法与IDEXX公司猪瘟病毒抗体检测试剂盒的阳性符合率为92.3%,阴性符合率为85.7%。【结论】建立的ELISA检测方法,不但为猪瘟抗体监测提供了一种比较实用的血清学监测手段,也为进一步开发猪瘟抗体检测试剂盒奠定了基础。     

猪瘟病毒检测和猪瘟疫苗研究进展

猪瘟（Classical Swine Fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus,CSFV）引起的高度传染性、致死性疾病,是公认对养猪业危害最严重的病毒性疾病之一。自 1810 年首次报告 CSF 疫情至今,CSF给世界养猪业造成了重大经济损失,持续威胁着全球猪肉生产和人类的食品安全。世界动物卫生组织将 CSF 列为最重要的法定报告传染病之一,在我国被列为一类传染病。现阶段 CSF 临床表现形式复杂多变,有死亡率很高的急性型或死亡率变化不定的亚急性型、慢性型、隐性型及持续感染型等,且常与多种疫病混合感染。目前,疫苗免疫接种仍然是全球大多数国家特别是发展中国家防控 CSF 的主要手段, CSFV 抗原 / 抗体试验室诊断和临床检测技术的开发和应用对于 CSF 防控也起到非常重要的作用。随着生物技术的快速发展,更多的 CSFV 抗原 /抗体检测技术和新型疫苗被开发和批准使用。综述 CSFV 抗原和抗体检测技术、CSFV 减毒活疫苗和亚单位疫苗、载体疫苗等新型疫苗开发进展等,以期为更好地防控 CSF 提供参考。     

猪瘟免疫失败的防止措施

介绍了猪瘟免疫失败的防止措施,指出应全面掌握生猪的健康状况、严把疫苗质量关、规范免疫操作、制定科学免疫程序、强化抗体监测、加强猪瘟的净化、加强饲养管理,以期为提高免疫效果提供参考。     

猪瘟病毒E2基因的哺乳动物细胞表达

利用PCR技术扩增出猪瘟病毒主要结构蛋白E2基因的全序列,将其克隆到真核表达载体PEGPF-C1中,获得重组质粒PEGPF-E2,经PCR,酶切鉴定和序列分析证明目的基因的大小、插入位置和读码框完全正确。利用脂质体将阳性质粒PEGFP-E2转染入猪肾来源的细胞PK-15中,G418筛选出阳性的细胞克隆,通过PCR证明E2基因存在于筛选出的阳性细胞克隆中。利用荧光倒置显微观察阳性细胞发现有融合蛋白的表达,利用夹心ELISA猪瘟病毒抗原检测试剂盒检测证明表达的融合蛋白为猪瘟病毒E2基因编码蛋白。     

猪瘟病毒E2基因的克隆及其初步鉴定

[目的]为了研究猪瘟病毒E2蛋白的抗原性质和进一步筛选保护性抗原表位。[方法]克隆猪瘟病毒E2蛋白的部分基因片段,通过自行设计的一对引物,应用RT-PCR从猪瘟兔化弱毒株细胞培养物,扩增出一DNA片段,并对其进行鉴定。[结果]经初步鉴定,该片段大小约703 bp,核苷酸序列测定结果表明该片段为E2蛋白基因。[结论]该研究为筛选CSFV抗原奠定了基础。     

苜蓿多糖对猪瘟兔化弱毒疫苗免疫应答强化作用的研究

用苜蓿多糖作为猪瘟兔化弱毒疫苗的强化剂 ,对 6 0日龄体重 1 8～ 2 0kg的仔猪进行免疫试验。结果表明 ,苜蓿多糖可使猪外周血液的B淋巴细胞增多 ,IgG水平提高 ,可显著增强猪瘟疫苗的免疫效果。     

猪瘟病毒石门株NS3基因在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术,扩增了猪瘟病毒石门株NS3基因的丝氨酸蛋白酶、NTPase、RNA解螺旋酶活性功能区长度为2 000 bp的片段,将其克隆到pET-32a中,构建了原核表达载体pET-NS3,并将其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行了表达,同时对表达产物进行了SDS-PAGE和Western blotting检测。结果表明,IPTG诱导表达得到的pET-NS3融合蛋白的相对分子质量约为97 ku,与预期结果一致,且该重组蛋白能被CSFV阳性血清所识别。     

猪瘟病毒石门株E2基因序列分析

经非猪瘟免疫猪增殖猪瘟病毒石门株,从抗凝血中直接提取病毒RNA进行RT-PCR,获得了猪瘟病毒石门株E2基因片段。克隆后测序,结果表明石门株的E2囊膜糖蛋白与国外报道的5株猪瘟病毒的E2囊膜糖蛋白具有相同的骨架结构,即均具有15个半胱氨酸残基和5个潜在糖基化位点,此外石门株也具有保守序列RYLASLH。同源性比较表明,石门株与日本的ALD株和GPE#+-株同源性最高,而与欧洲的Alfort株同源性最低。与国内的疫苗种毒（482代）、疫苗毒以及国外使用的中国猪瘟兔化弱毒株同源性比较表明,石门株与种毒(482代)同源性最高,其次为国外使用的中国猪瘟兔化弱毒株,而与国内使用的疫苗毒同源性最低。本研究提示国内疫苗毒的E2基因在生产中有较大变异,可能导致抗原漂移。     

猪瘟病毒Npro基因的克隆表达

 为了得到一个表达Npro蛋白的真核表达载体,从而为下一步研究不同时间段细胞主要组织相容性复合体（MHC）表达的变化情况,从分子水平上说明Npro与MHC之间的关系,本研究应用反转录聚合酶链式反应（RT PCR）技术对猪瘟病毒石门毒株Npro基因进行了克隆和测序,结果得到了长度为592bp的目的片段。用BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶分别对重组克隆质粒和转移载体pcDNA30进行双酶切,回收目的基因DNA片段,将目的基因Npro亚克隆至真核转移载体pcDNA30中,经双酶切和序列测定鉴定插入基因和连接方向正确,得到含完整Npro基因的重组载体质粒P Npro。构建成功的真核表达载体以脂质体介导的转染方法将此重组载体质粒转染PK 15细胞,转染24和48h后检测表达情况。经Western blot方法检测表明,此Npro蛋白在PK 15细胞中正确表达。