猪霍乱沙门氏菌C78-1株Δcrp缺失株的构建及其生物学特性初步研究

通过自杀性质粒介导的等位交换技术构建猪霍乱沙门氏菌C78-1株的crp基因缺失株,并对其生物学特性进行初步研究。首先以猪霍乱沙门氏菌C78-1基因组为模板进行PCR,扩增出crp基因上下游片段(1 048和1 743 bp),并分别将其克隆入自杀性质粒pRE112上,构建含缺失320 bpcrp基因的重组自杀性质粒pREΔcrp。运用重组自杀性质粒介导的等位交换技术,两步法筛选C78-1的Δcrp缺失株。进一步的生物学特性研究表明,缺失株的血清型与亲本菌株C78-1一致,且能够稳定遗传缺失的crp基因,但其生化特性和生长速度与C78-1相比发生明显改变,小鼠致死性试验结果表明其毒力较C78-1降低约750倍。以上结果均证实,作者成功构建了猪霍乱沙门氏菌C78-1株的crp基因缺失突变株,缺失株遗传稳定,毒力显著降低,为进一步开发猪霍乱沙门氏菌的弱毒疫苗菌株奠定了基础。     

鼠伤寒沙门菌SL1344株AcrpAasd缺失株的构建及生物学特性初步研究

构建鼠伤寒沙门菌SL1344△cr户△nsd双基因缺失突变株,并对其生物学特性进行初步研究。首先以Y7213（pREAasd）为供体菌,SL1344Acrp为受体菌进行结合转移,通过自杀性质粒介导的等位交换技术两步法筛选sI,1344的AcrpAasd双缺失株。该缺失株在有外源DAP的存在下能够正常生长,且能稳定遗传缺失的“sd基因;其血清型与亲本株SL1344Acrp及强毒株SL1344保持一致;其生化特性与亲本株基本相同,但与强毒株相比变化较明显,且生长速度明显减慢;雏鸡毒力试验结果表明其毒力较SL1344降低约10j倍。鼠伤寒沙门菌SL1344AcrpzSasd缺失株构建成功,为进一步开发以鼠伤寒沙门菌为载体的口服疫苗奠定了基础。     

鼠伤寒沙门菌SL1344株cAMP受体蛋白基因缺失株的构建及其生物学特性

通过自杀性质粒介导的细菌同源重组技术,构建鼠伤寒沙门菌SL1344株的crp基因缺失疫苗候选菌株,并对其生物学特性进行初步研究。首先构建含缺失321bp crp基因的重组自杀性质粒pREΔcrp,然后利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选SL1344的Δcrp缺失株,用PCR鉴定结果表明该缺失株构建成功。生物学特性研究发现,缺失株ΔcrpSL1344保留了亲本菌株SL1344的血清型1,4,5,12：i：1,2,且能够稳定遗传缺失321bp的crp基因;但是,与亲本株SL1344相比,其生化特性发生明显改变,生长速度明显减慢。缺失株ΔcrpSL1344口服感染1日龄雏鸡的LD50为7.40×109 CFU,毒力较亲本株SL1344降低32 456倍。以上研究结果表明,SL1344株crp基因缺失株构建成功,且遗传稳定,毒力明显降低,为进一步将其开发为鼠伤寒沙门菌弱毒疫苗候选菌株奠定基础。     

减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaSL1344株asd平衡致死系统的构建及其特性

为构建能稳定携带外源基因的减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaΔasdSL1344,本研究在减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaSL1344基础上,以χ7213（pREΔasd）为供体菌,ΔcrpΔcyaSL1344为受体菌,利用自杀性质粒介导的等位交换技术成功筛选出缺失编码天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶基因（aspartic semialdehyde dehydrogenase,asd）的ΔcrpΔcyaΔasdSL1344菌株,进一步对其生物学特性进行初步研究。结果显示,其血清型和亲本株ΔcrpΔcyaSL1344及强毒株SL1344相同且该缺失菌株能稳定遗传缺失后的asd基因;其生化特性和生长速度与强毒株SL1344相比有很大差异,与亲本株ΔcrpΔcyaSL1344基本一致,ΔcrpΔcyaΔasdSL1344失去了利用麦芽糖、乳糖、山梨醇等碳源的能力,也不能分解H2S、半乳糖和鼠李糖,但仍保留了利用葡萄糖的能力,其生长速度比强毒株更加缓慢。1日龄雏鸡攻毒试验表明ΔcrpΔcyaΔasdSL1344互补携带asd基因的pYA3493质粒后,ΔcrpΔcyaΔasdSL1344（pYA3493）毒力较强毒株SL1344降低了至少105倍,与亲本株ΔcrpΔcyaSL1344相比毒力仅相差10倍。结果表明,减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaΔasdSL1344菌株构建成功,为深入研究以鼠伤寒沙门菌为载体的口服多价疫苗奠定基础。     

鹅源鼠伤寒沙门菌crp、hfq基因缺失株的构建及生物学特性分析

为构建鹅鼠伤寒沙门菌单基因缺失株并鉴定其生物学特性,本研究以广东地区鹅源鼠伤寒沙门菌流行株A29为研究对象,采用λ-Red同源重组技术,分别构建crp、hfq基因缺失株(A29Δcrp和A29Δhfq)及相应基因回补株,并分别采用相应引物经PCR鉴定。通过细菌培养,对各菌株生物学特性进行比较;通过PCR鉴定各菌株的遗传稳定性;采用K-B纸片扩散法检测各菌株的药物敏感性;将各菌株纯培养物经腹腔注射4周龄小鼠,测定各菌株对小鼠的毒力,并观察感染后小鼠的临床症状及各组织剖检病变与组织病理变化。PCR和测序结果表明,正确构建各基因缺失株和相应回补株。生物学特性试验结果显示,与亲本株相比,A29Δcrp菌落直径极显著变小(P<0.001),不产酸、不产生H₂S,菌体极显著变短(P<0.001);A29Δhfq菌落边缘不整齐,不产生H₂S,菌体极显著变长(P<0.001),表明crp、hfq基因影响细菌的菌落形态、生化特性和形态特征。菌株遗传稳定试验结果显示,菌株传至60代时,基因缺失株仍能够稳定缺失。药敏试验结果显示,与亲本株比较,A...     

鼠伤寒沙门菌oppCDF基因缺失株的构建及生物学特性分析

利用λ-Red同源重组技术构建鼠伤寒沙门菌oppCDF基因缺失株,并检测其生长特性、运动性、生物被膜形成能力、胞内存活能力及LD₅₀毒力。结果显示,与野生型菌株相比,oppCDF基因缺失株的生长特性无明显变化;oppCDF基因缺失株可降低鼠伤寒沙门菌的运动性;oppC与oppF基因缺失后可提高鼠伤寒沙门菌生物被膜形成能力;同时,oppC基因缺失可降低在RAW267.4细胞内的存活能力和其在小鼠体内的毒力,oppF基因缺失可显著增强在RAW267.4内的存活能力和对小鼠毒力的影响,而oppD基因缺失后其在小鼠体内的毒力和RAW267.4内的存活率均无显著变化。研究表明,oppCDF基因与鼠伤寒沙门菌的运动性、生物被膜形成和毒力密切相关,为进一步揭示鼠伤寒沙门菌致病作用中的复杂调控和机制提供了理论基础。     

5株鼠伤寒沙门菌基因缺失株的生物学特性比较

为了探讨crp、cya、sipB、crp/cya、crp/sipB基因缺失株成为鼠伤寒沙门菌减毒候选活疫苗的可能性,对缺失株的生物学特性进行研究。结果显示,缺失株的血清型仍和亲本菌株相同,其中crp、cya、crp/cya、crp/sipB与亲本菌株相比失去了利用麦芽糖、乳糖、山梨醇等碳源的能力,也不能分解H2S、半乳糖和鼠李糖,但仍保留了利用葡萄糖的能力。通过口服方式把5株crp、cya、sipB、crp/cya、crp/sipB基因缺失株接种KM小鼠进行毒力测定和免疫保护性测定,结果它们的半数致死量比野生株的至少高700倍,双基因缺失株的毒力更弱,攻毒后crp、cya、sipB、crp/cya、crp/sipB基因缺失株的免疫保护率分别为90.0%,60.0%,50.0%,60.0%,60.0%。结果表明,crp基因缺失株可作为鼠伤寒沙门菌减毒活疫苗的候选株。     

表达绿色荧光蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建与鉴定

应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白（GFP）的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。在体外稳定试验中，重组菌经LB固体及液体培养基连续传15代后，单个菌落和菌液均呈绿色；在体内稳定试验中，经ICR小鼠连续传代10次，从肝脏、脾脏中分离的细菌经LB固体培养仍为绿色，证明构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌是稳定的。SDS-PAGE结果显示，鼠伤寒沙门氏菌表达的GFP分子量约为27kD，这与预计的分子量大小一致。用免疫剂量的重组细菌接种BALB/C小鼠后，观察1个月未见有异常现象，同时剖栓后也未见脏吕有眼观病变。表达GFP的重组鼠伤寒沙门氏菌的构建为减毒沙门氏菌作为活载体的基因工程疫苗的研制提供一个优良模型，为研究沙门氏菌疫苗和沙门氏菌疾病的致病机理的提供了一个有力的工具，同时在相关疾病的免疫防制基础研究中亦有重要应用价值。     

鼠伤寒沙门菌cya基因的克隆表达及生物信息学分析

研究旨在克隆鼠伤寒沙门菌cya基因并对其进行生物信息学分析。以鼠伤寒沙门菌SL1344株为模板PCR扩增并克隆了鼠伤寒沙门菌cya基因,构建原核表达质粒pET-32a-cya,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,用1 mmol/L IPTG对其进行诱导表达、纯化,同时利用相关的生物信息学软件对其进行生物信息学分析。结果显示,鼠伤寒沙门菌cya基因大小为1 185 bp。经SDS-PAGE和Western blotting分析显示,在原核表达系统中主要以包涵体形式存在,蛋白分子质量大小约为58 ku。生物信息学分析表明,Cya蛋白由394个氨基酸组成,理论分子质量为44.97 ku,分子式为C₂₀₂₆H₃₁₄₆N₅₆₂O₅₇₈S₁₁,等电点（pI）为7.01,其中带负电荷残基总数（Asp+Glu）43个,带正电荷残基总数（Arg+Lys）42个。Cya蛋白无信号肽与跨膜区,为膜内蛋白,含有4个N-糖基化位点、1个O-糖基化位点、27个磷酸化位点、13个线性B细胞结合位点、11个T细胞结合位点。二级结构中α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲所占比例分别为38.07%、19.80%、5.58%和36.55%。本试验结果为进一步研究鼠伤寒沙门菌Cya蛋白的功能及建立以Cya蛋白为抗原的免疫鉴别检测方法奠定了基础。     

鼠伤寒沙门菌sapC基因缺失株的构建及生物学特性分析

旨在研究鼠伤寒沙门菌ABC转运膜蛋白SapC在沙门菌致病机制中的功能。本研究利用λ-Red重组技术构建了鼠伤寒沙门菌sapC基因缺失突变株SMΔsapC,对其进行生长特性、酸性应激试验、多黏菌素B敏感性试验、生物被膜检测、胞内存活和小鼠体内毒力试验。结果显示,基因缺失株SMΔsapC与亲本菌株和互补菌株相比,其生长速度无明显差异;在酸应激条件下,SMΔsapC存活率显著低于亲本菌株;sapC基因缺失降低了鼠伤寒沙门菌生物被膜的形成能力;同时,SMΔsapC基因缺失株在鼠源巨噬细胞内的增殖能力和小鼠体内的毒力显著低于亲本菌株。研究表明,sapC基因影响鼠伤寒沙门菌的抗酸能力、生物被膜形成能力,从而影响沙门菌在体内外的毒力。本研究为进一步阐释鼠伤寒沙门菌的致病机制奠定了基础。     

鼠伤寒沙门菌tolA缺失株的构建及生物学功能研究

为了研究tolA基因在鼠伤寒沙门菌外膜完整性及外膜囊泡(OMVs)形成中的作用,通过自杀载体介导的同源重组技术,构建鼠伤寒沙门菌X3761的tolA基因缺失株△tolA.通过比较鼠伤寒沙门菌野生株X3761与缺失株△tolA的生物学特性,发现敲除tolA基因对X3761的生长特性没有显著影响.革兰染色镜检发现,X376...     

一株鹅源性鼠伤寒沙门氏菌的分离与鉴定

2012年7月,江苏镇江丹阳某养殖户送检3羽病死鹅,无菌采集病料进行细菌分离。此细菌在麦康凯培养基上长出无色菌落且细菌生长良好;能发酵葡萄糖、甘露醇等大多数糖类,不能发酵乳糖、蔗糖、阿拉伯糖和山梨醇,生化特点符合沙门氏菌特性。分离菌血清型为鼠伤寒沙门氏菌,同时16srDNA基因序列分析鉴定结果显示为鼠伤寒沙门氏菌。该分离菌株的药敏结果表明：对链霉素、氯霉素、罗美沙星、萘啶酸等药物多重耐药,而对庆大霉素、卡那霉素、痢特灵、丁胺卡那霉素等药物敏感。     

鼠伤寒沙门氏菌的毒力因子及其致病机理

鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica Typhimurium,ST)是一种革兰氏阴性杆菌,可引起人和动物的自限性肠胃炎,并且据报道一些鼠伤寒沙门氏菌株具有侵袭性,可穿过肠壁并进入体循环,严重影响了公共卫生安全和畜牧养殖业的发展。本文将对鼠伤寒沙门氏菌致病的毒力因子和致病机理进行总结与阐述。     

不同源鼠伤寒沙门氏菌耐药性质粒不相容性分群的初步研究

The incompatibility plasmids of 101 strains Salmonella typhimurium were detected by PCR-based replicon typing. Eighteen pairs of primers were designed to perform 5 triplex-PCRs and 3 simplex-PCRs, recognizing FIA, FIB, FIC, HI1, HI2, I1, L/M, N, P, W, T, A/C, K, B/O, X, Y, F and FII. 94 strains (93.1%) Salmonella typhimurium carried a total of 10 Inc groups. The results suggested that the method was applicable for a large number of strains to trace the diffusion of specific multi-drug resistance plasmids in different environments.     

果寡糖控制雏鸡鼠伤寒沙门氏菌感染的研究

试验研究了不同剂量的果寡糖对雏鸡肠道沙门氏菌感染的抑制作用。选择1日龄健康艾维茵肉仔鸡96只随机均分4组,每组24只。分别饲喂果寡糖添加量为0、0.5%、1.0%、2.0%的饲粮,试验期21d。在16日龄,采用口腔灌注法将所有试验鸡进行108鼠伤寒沙门氏菌攻毒,分别于17日龄、19日龄、21日龄进行盲肠沙门氏菌、pH值及盲肠鲜重三项指标的测定。结果表明:日粮中添加0.5%～2%果寡糖,在19日龄时均能显著降低盲肠沙门氏菌定植数量,各添加水平之间无显著差异。随着鸡日龄的增加,各试验组鸡盲肠沙门氏菌数逐渐减少。果寡糖对盲肠内容物pH值无显著影响;果寡糖使盲肠鲜重有增加趋势。     

鼠伤寒沙门氏菌IsrB基因的克隆及其同源表达

为同源表达鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)的lsrB基因,本研究通过PCR扩增得到S.typhimurium SL1344株的lsrB基因,其全长1020 bp,编码340个氨基酸.通过序列分析,该基因与S.typhimurium LT2的neA基因同源性为100％,与克雷伯氏菌(Klebsiella) A...     

贵州矮马鼠伤寒沙门氏菌的分离鉴定及其致病力研究

为了探究贵州矮马的腹泻病原,试验以腹泻粪样为材料进行病原菌的分离鉴定。经SS和XLD培养基筛选,得到1株菌株S6,经革兰氏染色、生理生化检验以及16S rRNA基因序列比对分析,S6菌株可在SS和XLD琼脂培养基表面生长,革兰氏染色呈阴性;生理生化检验结果与沙门氏菌的生化特性相符;16S rRNA基因序列与已知的鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311（登录号：NR_119108）的亲缘关系最近,序列同源性为99％。形态学和分子系统学分析表明,该菌株为鼠伤寒沙门氏菌。采用PCR方法从S6菌株基因组中得到侵袭蛋白A（invasion protein A,invA）基因,与已知基因序列有6~8 bp不一致,编码的氨基酸发生了一个替换。通过改良寇氏法测定S6菌株对小鼠的半数致死量（LD₅₀）为4.71×10² CFU,属于强致病力菌株。推测S6 invA基因的变异可能与菌株的毒力强弱有关。贵州矮马群体中沙门氏菌的检出率为57％。本研究提示贵州矮马的腹泻病原之一可能是强毒力的鼠伤寒沙门氏菌。     

鼠伤寒沙门氏菌和福氏志贺氏菌流行株耐药质粒的研究

对分离到的９株鼠伤寒沙门氏菌和５株福氏志贺氏菌进行药敏试验、质粒提取和电泳分析，各菌株均分离出２－４条粒带。将含有３．２７×１０＾４，３．０１×１０＾４和６．０１×１０＾４ｂｐ的持粒转化给大肠埃希氏菌ＨＢ１０１，使ＨＢ１０１获得了相应菌的部分耐药性，用转化有３．２７×１０＾４ｂｐ的ＨＢ１０１注射小白鼠，１５ｄ后用相应的原始鼠伤寒沙上氏菌强毒株攻击，结果使小白鼠获得了保护；用含有３．２７×１０＾４ｂ     

鼠伤寒沙门菌T3SS相关基因缺失株的生物学特性分析

为探究沙门菌Ⅲ型分泌系统(STM T3SS)相关基因缺失株的部分生物学特性及致病力,本试验利用λ-Red同源重组技术构建T3SS相关基因缺失株LT2 ΔprgI::scar、LT2 ΔprgJ::scar、LT2 ΔprgH::scar、LT2 ΔprgK::scar、LT2 ΔinvG::scar、LT2 ΔinvC::scar和LT2 ΔspaP::scar,以鼠伤寒沙门菌野生型(STM LT2)作为对照,通过生长曲线测定、遗传稳定性试验、生物被膜形成能力检测、细菌定植试验、细菌泳动性测定和动物致病性试验分析两者间的区别,结果显示：T3SS相关基因缺失株生长性变化不大,能够稳定遗传,但其定植能力、运动能力有不同程度的减弱;对于缺失株LT2 ΔinvC::scar、LT2 ΔprgH::scar、LT2 ΔprgJ::scar和LT2 ΔprgK::scar的成膜能力虽有小幅降低,但仍有较强的成膜能力,其余菌株在缺失后,成膜能力显著降低;LD50测定结果显示,相对于STM LT2,缺失株半数致死量LD₅₀数值均出现上升趋势,分别上升了2.57、4.07、406....