猪腹泻相关病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRV)的多重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的PEDV S基因、TGEV S基因和PRV VP6基因序列设计合成引物,利用这3对引物对同一样品中的PEDV、TGEV、PRV进行多重RT-PCR扩增,结果显示,该方法可以同时扩增PEDV(682 bp)、TGEV(480 bp)和PRV(297 bp)的特异性DNA片段,而对猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的PCR扩增结果均为阴性;敏感性试验结果表明,该多重RT-PCR方法对PEDV、TGEV和PRV的最低检出量分别为3.3×103拷贝/μL、3.2×103拷贝/μL和2.8×103拷贝/μL。利用建立的多重RT-PCR检测方法和单项RT-PCR对20份临床病料进行检测,结果显示,两者的总符合率为100%。结果表明建立的多重RT-PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可以用于这3种病毒的同时检测和疾病的鉴别诊断。     

双重RT-PCR方法检测猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒

为建立特异、敏感的猪流感病毒(SIV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的双重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank登录的SIVM基因保守序列和PRRSV美洲型毒株的N基因保守序列,设计合成了2对特异引物,通过对扩增条件的优化,建立检测SIV和PRRSV的双重RT-PCR方法。检测结果显示:该方法可同时扩增出SIV(345bp)和PRRSV(520bp)的特异性片段;而猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型及阴性鸡胚尿囊液核酸扩增结果均为阴性;对SIV和PRRSV2种病毒混合液的最小检出量分别为102EID50/0.1mL和103TCID50/0.1mL。应用双重RT-PCR和病毒分离法对12份临床疑似样品进行对比检测,结果表明:除双重RT-PCR检测到双阳性的3份混合感染病料中1份未分离到PRRSV外,其余2份均分离出病毒。证明该方法具有良好的特异性、敏感性,可以用于临床样品的早期快速检测。     

双重RT-PGR方法检测猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒

为建立特异、敏感的猪流感病毒(SIV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的双重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank登录的SIV M基因保守序列和PRRSV美洲型毒株的N基因保守序列,设计合成了2对特异引物,通过对扩增条件的优化,建立检测SIV和PRRSV的双重RT-PCR方法.检测结果显示:该方法可同时扩增出SIV(345 bp)和PRRSv(520 bp)的特异性片段;而猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型及阴性鸡胚尿囊液核酸扩增结果均为阴性;对SIV和PRRSV 2种病毒混合液的最小检出量分别为102 EID50/0.1 mL和103TCID50/0.1 mL.应用双重RT-PCR和病毒分离法对12份临床疑似样品进行对比检测,结果表明:除双重RT-PCR检测到双阳性的3份混合感染病料中1份未分离到PRRSV外,其余2份均分离出病毒.证明该方法具有良好的特异性、敏感性,可以用于临床样品的早期快速检测.     

1型、2型牛病毒性腹泻病毒通用RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速检测1型、2型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的通用RT-PCR方法,根据GenBank上收录的64株1型、2型BVDV以及1株猪瘟病毒(CSFV)的全基因组序列,应用Primer 6.0软件设计针对5'-UTR区域的1型、2型BVDV特异性通用引物对,扩增目的片段,并对该方法进行特异性、敏感性、重复性试验及利用该方法开展临床样品检测。结果显示:扩增的目的片段长度约为302 bp;该方法的灵敏度为2.09×102 copies/μL,无非特异性扩增,且重复性良好。对采自山东省发病牛场的13份鼻腔棉拭子和9份牛血清临床样品进行检测,发现有8份鼻腔棉拭子和8份血清为BVDV阳性,随机抽取4份阳性样品送测序,发现3份样品毒株为1型BVDV,1份样品还需进一步鉴定。本研究建立的RT-PCR方法可实现对1型、2型BVDV核酸的特异性检测,也可用于该病的流行病学调查研究。     

仔猪先天性震颤瘟病毒RT-PCR检测方法的建立

旨在建立检测仔猪先天性震颤瘟病毒(APPV)的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法。根据GenBank上登录的APPV基因组序列,设计1对引物,以临床上表现典型震颤仔猪的淋巴结为材料,提取RNA,建立了RT-PCR方法,并进行敏感性、重复性和特异性试验,对其扩增产物测序比对分析;利用该方法,对临床病料进行检测。结果显示,从典型震颤仔猪的淋巴结中均扩增到与预期大小有一致的片段,经测序比对,扩增片段序列与APPV相应片段的核苷酸同源性在89%以上;该方法只能扩增出APPV片段,而其他几种常见猪病毒均为阴性,3次重复检测结果基本一致,可检测最低cDNA浓度为184.11ng/μL;对临床病料检测,典型病例的检出率达100%。试验结果表明,建立的RT-PCR方法具有良好的特异性、重复性、敏感性等优点,可用于临床APPV引起的仔猪先天性震颤早期检测、病毒鉴定和分子流行病学调查。     

猪瘟病毒和不同型猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测方法的建立

为建立能同时检测猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,针对CSFV和PRRSV的基因序列设计3对特异性引物,第1对引物扩增CSFV毒株NS2基因508bp片段,第2对引物扩增PRRSV美洲型经典毒株和变异毒株Nsp2基因338bp/248bp片段,第3对引物扩增PRRSV欧洲型毒株ORF5基因614bp片段。经过反应条件的优化,建立了能同时检测并区分CSFV毒株和PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株及欧洲型毒株的多重RT-PCR方法。该方法可以特异扩增CSFV和PRRSV,而与猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)均无交叉反应;对CSFV和PRRSV 4种重组质粒标准品的检出下限均为1.67×103拷贝/μL。对采集的106份临床疑似病料进行检测,结果CSFV和PRRSV变异株混合阳性4份,占3.77%(4/106);CSFV阳性7份,占6.60%(7/106);PRRSV变异株阳性17份,占16.04%(17/106)。结果表明,建立的多重RT-PCR检测方法可以用于CSFV和PRRSV的临床快速鉴别诊断和流行病学调查。     

猪嵴病毒和猪星状病毒双重RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测猪嵴病毒(PKV)和猪星状病毒(Ast V)的检测方法,本研究根据PKV 3D基因和Ast V ORF2基因设计了两对特异性引物,通过优化反应条件,首次建立了PKV和Ast V双重RT-PCR检测方法。该方法可以同时扩增出PKV的358 bp和Ast V的938 bp特异性片段,而对猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒及大肠杆菌等病原核酸扩增结果均为阴性,具有较强的特异性;对PKV和Ast V的最低检出量分别为1.51×106拷贝/μL和1.19×106拷贝/μL;利用该方法和单项RT-PCR方法对35份来自四川省部分猪场的仔猪腹泻病料样品进行检测。结果显示,PKV和Ast V的阳性检出率分别为80%和31.4%,两者符合率为100%。本研究建立的方法对PKV和Ast V的鉴别诊断和混合感染检测具有重要的应用价值。     

一种基于荧光探针技术的鸭坦布苏病毒核酸检测方法的建立

为建立一种鸭坦布苏病毒荧光RT-PCR核酸检测方法,特针对鸭坦布苏病毒E基因的保守片段设计特异性引物和探针,在鸭坦布苏病毒核酸层面和合成基因质粒层面,经一系列优化调试完成方法初步建立。其后,对该方法的特异性、敏感性、重复性、标准曲线、扩增效率等方面进行了验证。结果显示：该方法特异性100%;敏感性为10copies/μL;重复性CV值在0.07%～0.65%区间;标准曲线相关系数为0.9995,扩增效率为99.0%。综上所述,本试验成功建立了一种性能良好的鸭坦布苏病毒荧光探针RT-PCR核酸检测方法,可为DMTUV的临床诊断和流行性病学调查提供一种技术支撑。     

鸭坦布苏病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种能快速检测鸭坦布苏病毒（Tembusu virus,TMUV）的分子生物学方法,从GenBank中下载了51个具有代表性的黄病毒全基因组序列及白洋淀病毒等5个禽源黄病毒株E基因序列,进行了黄病毒E基因序列分析,应用Primer 5.0软件设计了一对引物,扩增目的片段为549 bp,进行了TMUV RT-PCR检测方法的特异性、敏感性、重复性试验,建立了TMUV RT-PCR检测方法应用该方法对收集的14份临床疑似蛋鸭鸭坦布苏病毒病发病样品进行了检测,共检出6份TMUV核酸阳性样品,检出率达42.86％。结果表明,该方法可用于水禽坦布苏病毒病的临床快速诊断、检测及流行病学调查。     

鲤春病毒血症病毒RT-RAA-LFD检测方法的建立

为建立一种可现场快速准确检测鲤春病毒血症病毒(SVCV)的方法，本研究结合重组酶介导扩增(RAA)和侧向流试纸条(LFD)技术，根据SVCV L基因保守区域设计引物及探针，通过优化反应时间和温度等条件，初步建立了可用于SVCV现场可视化检测的RT-RAA-LFD方法。优化后的检测方法在35℃水浴锅中恒温反应15 min即可实现对SVCV目的基因片段的有效扩增。结果显示，该方法可以特异性的检测SVCV，并且不与病毒性出血败血症病毒、传染性鲑鱼贫血症病毒、病毒性神经坏死病毒等其他常见鱼类病毒发生交叉反应；对SVCV重组质粒标准品的检测限为2.42×10²拷贝/μL，并具有较好的稳定性和重复性；采用该方法和病毒分离、套式RT-PCR、荧光定量RT-PCR、荧光定量RT-RAA共5种方法同时对45份临床样品检测，其中病毒分离、套式RT-PCR和荧光定量RT-PCR均检测到29份阳性样品，荧光定量RT-RAA和本研究建立的方法均检测到28份阳性样品，本研究与前3种方法的阳性符合率为97.8%，与荧光定量RT-RAA的阳性符合率为100%。上述结果表明，本研究建立的SVCV ...     

鸡黄病毒CJD05株E基因克隆与序列分析

为了解福建省鸡黄病毒(CFV) CJD05株来源及其遗传进化关系,根据鸭黄病毒(DFV) BYD-1株E基因全序列设计合成1对引物,特异性扩增CFV CJD05株的E基因,并对其序列进行分析.结果表明克隆获得CFV CJD05株1 503 bp的E基因特异性目的条带,同源性分析表明CFV CJD05株E基因核苷酸序列与DFVBYD-1株、鹅黄病毒(GFV) JS804株的同源性分别为99.2％、99.3％,氨基酸的同源性分别为99.0％、98.6％,表明CFV CJD05株、DFV BYD-1株和GFV JS804株高度同源,与坦布苏病毒(TBSV)的同源性高于其它虫媒介黄病毒.     

鸭黄病毒感染逆转录半套式PCR检测方法的建立

根据GenBank发布的黄病毒Bagaza毒株的NS3基因的保守序列设计了3条引物,建立了一种适用于鸭黄病毒的半套式PCR快速检测方法。采用该方法对鸭黄病毒山东分离株进行检测,结果半套式PCR对2株分离株均能扩增出277bp的特异性条带,而对鸭瘟病毒、禽流感病毒（H9亚型）、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒的扩增结果均为阴性;经检测该方法第1次扩增的敏感性为1×105拷贝/μL,第2次扩增的敏感性为1×102拷贝/μL,第2次扩增的敏感性比第1次高103倍;该方法对山东省各地采集的24份疑似病料可检出22份阳性。表明本试验所建立的套式PCR方法可用于鸭黄病毒感染的临床诊断和流行病学调查。     

鸭黄病毒的分离鉴定

从临床表现为产蛋下降、头颈歪斜、软脚为主要特征的发病蛋鸭卵巢、脑浆、肝、脾等组织中分离到1株病毒。分离毒能致死番鸭胚和鸡胚,人工感染产蛋期的蛋鸭能导致体温升高、产蛋急速下降,卵泡出血和萎缩;分离毒不能凝集鸡和鸽红细胞,能被鸡黄病毒高免血清特异中和;用禽黄病毒特异引物扩增为阳性。上述结果证实分离毒是黄病毒科黄病毒属的鸭黄病毒,是导致蛋鸭产蛋下降的病原。     

禽黄病毒套式RT-PCR检测方法的建立及应用

禽黄病毒病是新发的一种疫病,可引起鸭、鹅和鸡等家禽产蛋和采食量下降及死亡。本研究旨在建立一种快速诊断方法用于临床诊断及流行病学调查。根据GenBank发表的鹅黄病毒JS804株全基因序列,应用Primer Premier 5.0软件设计了2对特异性引物,建立了禽黄病毒套式RT-PCR检测方法。结果:该套式RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高的特点,最低病毒检测量为101.89TCID50/0.1 mL,比普通RT-PCR方法敏感性高1 000倍。应用该方法对江苏地区疑似禽黄病毒病的70份鹅病料、4份鸭病料、12份鸡病料进行检测,总阳性率为58.14%,而用普通RT-PCR方法检测的阳性率仅为17.44%。结果表明,禽黄病毒套式RT-PCR检测方法具有快速、特异、敏感的特点,可用于禽黄病毒感染的临床诊断和流行病学调查。     

白条鸡传染性法氏囊病病毒RT-PCR检测方法的建立和初步应用

设计了一对特异性引物,对具有临床症状、病理变化明显和AGP检测呈阳性的病鸡屠体的肺脏和鼻腔粘液进行RT-PCR扩增。结果显示,6个样品的肺脏全部扩增出特异性基因片段,阳性符合率为100%,鼻腔粘液有5例扩增出阳性基因片段,符合率为80%。将建立的RT-PCR检测方法用于市售白条鸡的检测,90只随机样品中有7只扩增出阳性片段,检出率为7.78%。本试验建立的RT-PCR检测方法为肉食品原料卫生的检验提供了新的技术手段。     

Evaluation of a Campylobacter fetus subspecies venerealis real-time quantitative polymerase chain reaction for direct analysis of bovine preputial samples

The detection and subspeciation of Campylobacter fetus subsp. venerealis (CFV) from veterinary samples is important for both clinical and economic reasons. Campylobacter fetus subsp. venerealis is the causative agent of bovine genital campylobacteriosis, a venereal disease that can lead to serious reproductive problems in cattle, and strict international regulations require animals and animal products to be CFV-free for trade. This study evaluated methods reported in the literature for CFV detection and reports the translation of an extensively tested CFV-specific polymerase chain reaction (PCR) primer set; including the VenSF/VenSR primers and a real-time, quantitative PCR (qPCR) platform using SYBR Green chemistry. Three methods of preputial sample preparation for direct qPCR were evaluated and a heat lysis DNA extraction method was shown to allow for CFV detection at the level of approximately one cell equivalent per reaction (or 1.0 × 10³ CFU/mL) from prepuce. The optimized sample preparation and qPCR protocols were then used to evaluate 3 western Canadian bull cohorts, which included 377 bulls, for CFV. The qPCR assay detected 11 positive bulls for the CFV-specific parA gene target. DNA sequence data confirmed the identity of the amplified product and revealed that positive samples were comprised of 2 sequence types; one identical to previously reported CFV parA gene sequences and one with a 9% sequence divergence. These results add valuable information towards our understanding of an important CFV subspeciation target and offer a significantly improved format for an internationally recognized PCR test.     

鸭坦布苏病毒江苏XZ株的分离和鉴定

从江苏徐州地区分离到的以引起樱桃谷鸭产蛋下降和死亡为特征的1株病毒,命名为XZ株。对该病毒进行电镜观察、血凝试验、ELD₅₀测定、RT-PCR扩增特异性目的基因、序列比对分析和动物回归试验。结果显示,分离毒株能致死鸭胚和鸡胚,电镜下观察到球形病毒粒子,不具有血凝性,对病料和接毒鸭胚尿囊液进行RT-PCR,均可扩增出基因片段,其核苷酸序列与坦布苏病毒奉贤株的相似性最高,为98.7%,与其他坦布苏病毒的毒株也具较高同源性,为86%~98%。用鸭胚分离毒株接种健康产蛋鸭,能复制出同样的疾病。结果表明分离病毒为鸭黄病毒属的坦布苏病毒。     

探针检测鸭黄病毒的地高辛标记DNA的制备与应用

利用RT-PCR方法扩增鸭黄病毒的NS3基因406bp的特异性片段,回收并纯化PCR产物,用地高辛标记,制备核酸探针。特异性试验结果表明,该探针仅与鸭黄病毒的核酸特异性杂交,而与鸭瘟病毒、H9N2禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒的核酸杂交均为阴性。敏感性试验表明,该探针对鸭黄病毒的RNA最低检出限量为100μg/L。对疑似黄病毒感染鸭的肝脏、肺脏、脾脏、输卵管、卵泡膜和泄殖腔棉拭子进行检测,以卵泡膜的检出率最高。该研究为鸭黄病毒感染的诊断和流行病学调查提供了一种可靠的方法。     

检测CSFV、PRRSV和JEV感染的多重RT-PCR方法的建立及初步应用

为了建立1种能够应用于临床样本可以同时检测CSFV、PRRSV、JEV 3种RNA病毒感染的多重RT-PCR方法。根据GenBank收录的CSFV、PRRSV、JEV的基因组全序列,选择3种病毒的特异性保守区序列设计了3对特异性引物,优化多重RT-PCR反应条件,建立了能够同时检测3种病毒混合感染的多重RT-PCR诊断方法。特异性分析表明,应用该方法分别从CSFV、PRRSV、JEV毒株以及3种病毒的混合物中扩增出大小分别为777、451、605bp的3条特异性条带,其他对照组检测均为阴性;敏感性分析表明,该方法最低检测量分别为14.2、10.0、8.0pg的CSFV、PRRSV、JEV的RNA;初步应用性试验表明,52份疑似病料中PRRSV、CSFV和JEV的阳性率分别为46.1%、21.1%和1.92%;CSFV和PRRSV混合感染阳性率为21.1%。CSFV、PRRSV和JEV混合感染阳性率为3.84%。本试验建立的多重RT-PCR检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,可以有效检测CSFV、PRRSV和JEV的混合感染。     

鸭黄病毒病的临床病理学观察及病原学检测

本试验通过病理解剖、组织学检查、电镜观察及RT-PCR等方法对一起鸭产蛋下降性疾病进行初步研究。解剖病鸭发现,脾脏肿大,卵泡膜出血、变性;组织学检查结果表明,病鸭肝细胞呈现严重的脂肪变性,脾脏淋巴细胞数量减少;病料细菌分离结果为阴性;黄病毒RT-PCR检测阳性;电镜下可观察到直径为40～60 nm的病毒粒子;参照黄病毒属NS5基因设计合成引物,扩增得到360 bp的目的片段;遗传进化分析表明:该核酸序列与黄病毒科黄病毒属恩塔亚病毒群(Ntaya virus group)的巴格扎病毒(Bagaza virus)的NS5核酸序列同源性最高。