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产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因在大肠杆菌中的高效表达 总被引:15,自引:3,他引:12
对含有产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)α毒素基因的重组菌株BL21(DE3)(pXETA1)和BL21(DE3)plysS(pXETA1),通过培养性状观察和小鼠接种试验,证明这2株重组菌株均无致病性。随后对这2株重组菌株的表达产物进行了研究,经SDS-PAGE和薄层凝胶扫描分析,IPTG诱导3~4h后的BL21(DE3)(pXETA1)表达的α毒素占菌体总蛋白33.21%,BL21(DE3)plysS(pXETA1)表达的α毒素占菌体总蛋白27.25%,其相对分子质量约37500;经Westernblot分析,表达产物可被α毒素抗血清识别。包涵体粗提物的免疫攻毒试验结果表明,以1倍致死量攻击的免疫小鼠可获得100%(36/36)的保护,以2倍致死量攻击的免疫小鼠可获得94.28%(33/35)的保护,从而说明表达产物具有良好的免疫原性。 相似文献
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抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体基因的表达 总被引:1,自引:0,他引:1
将 2种抗 A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体 ( Sc Fv)基因 Sc Fv-2 E3和 Sc Fv-1 A8克隆至表达载体p UC1 1 9、p HOG2 1和 p ET2 0 b中 ,构建了重组质粒 p UC2 E3和 p UC1 A8、p HOG2 E3和 p HOG1 A8、p ET2 E3和 p ET1 A8后 ,分别转化至受体菌 JM1 0 5、JM1 0 9和 BL2 1 ( DE3 )中 ,得到重组菌株 JM1 0 5( p UC2 E3 )和JM1 0 5( p UC1 A8)、JM1 0 9( p HOG2 E3 )和 JM1 0 9( p HOG1 A8)及 BL2 1 ( DE3 ) ( p ET2 E3 )和 BL2 1 ( DE3 )( p ET1 A8)。 ELISA检测表明 ,经 IPTG诱导后所表达的目的蛋白存在于重组菌株 JM1 0 5( p UC2 E3 )和JM1 0 5( p UC1 A8)及 JM1 0 9( p HOG2 E3 )和 JM1 0 9( p HOG1 A8)的菌培养上清中 ,在重组菌株 BL 2 1 ( DE3 )( p ET2 E3 )和 BL2 1 ( DE3 ) ( p ET1 A8)的胞周质中检测到了 Sc Fv的存在。 SDS-PAGE和薄层扫描分析表明 ,重组菌株 BL2 1 ( DE3 ) ( p ET2 E3 )和 BL2 1 ( DE3 ) ( p ET1 A8)的蛋白表达产物分别占菌体可溶性蛋白的 0 .9%和 0 .7%,其大小约为 2 60 0 0 ,且表达的目的蛋白具有中和磷脂酶 C的活性。 相似文献
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产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因的克隆与核苷酸序列分析 总被引:14,自引:5,他引:14
将含产气荚膜梭菌α毒素基因的质粒pKMA100用限制性核酸内切酶BamHI和HindⅢ双酶切,经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离、透析袋电洗脱法回收0.95kbα毒素基因片段,再将载体pET-28b(+)用BamHI和HindⅢ双酶切,然后将处理好的pET-28b(+)与0.95kb的α毒素基因片段通过T4DNA连接酶进行粘性末端连接,转化至受体菌BL21(DE3)中。经BamHI和HindⅢ双酶切分析和核苷酸序列分析,证明重组质粒pXETA1含有产气荚膜梭菌α毒素基因。确定了α毒素基因的全部核苷酸序列,并证明其具有正确的阅读框架。 相似文献
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应用聚合酶链式反应(PCR)技术,从 A 型产气荚膜梭菌中国标准株C57-1中,扩增出大小约1.2 kb的A 型产气荚膜梭菌α毒素全基因(cpa1254基因),并将其克隆入pMD18-T载体中.转化至受体菌DH5α后,经Amp/IPTG/X-Gal 选择培养,提取质粒,PCR和EcoRⅠ/PstⅠ双酶切鉴定,筛选阳性重组克隆.核苷酸序列分析证实,cpa1254基因阅读开放框架由1 194 bp组成,编码398个氨基酸残基.经GenBank数据库的BLAST检索比对分析,cpa1254基因序列与国外文献报道者同源性达99%,表明本实验所克隆的cpa1254基因即为A型产气荚膜梭菌α毒素基因. 相似文献
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产气荚膜梭菌是一种重要的人畜共患病原菌,在一定条件下可引起多种严重疾病。为了调查不同动物A型产气荚膜梭菌流行情况及α毒素基因同源性,本试验从不同地区共采集病料307份,其中鸡133份(包括肉鸡112份、蛋鸡21份)、鸭65份、犬31份、猪14份、兔子20份、小鼠9份、牛粪便18份、鸵鸟粪便17份。取肠道内容物和粪便进行产气荚膜梭菌分离鉴定和毒素基因分型,并检测cpe、β2毒素基因携带率;从不同地区、不同动物源A型产气荚膜梭菌分离株挑选18株进行α毒素基因扩增,将所得基因序列进行同源性比较。结果显示,307份样品中68份(22.1%)呈产气荚膜梭菌阳性,不同动物源产气荚膜梭菌阳性率介于5.9%~44.4%;68株产气荚膜梭菌分离株α毒素基因阳性率为100%,所有分离株毒素基因分型均为A型,未检测到cpe毒素基因,β2毒素基因总阳性率为63.2%;分离株与NCBI参考菌株α毒素基因相似性介于97.8%~100%。结果表明,不同动物α毒素具有很高的同源性,本调查为研发A型产气荚膜梭菌α毒素通用疫苗提供数据支持。 相似文献
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采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含α毒素突变基因的重组质粒,同时用SDS-PAGE检测不同条件下α毒素突变基因的表达情况。经酶切鉴定证实重组质粒pXMCPA02含有α毒素突变基因且基因序列和阅读框架正确。同时以IPTG为诱导剂诱导α毒素突变基因表达并对其表达条件进行优化。优化表达的结果是:培养基pH7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.8 mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5 h,此时重组菌株pXMCPA02蛋白表达量为35%。从而实现了α毒素突变基因的高效表达,为A型产气荚膜梭菌α毒素基因工程菌苗的生产工艺研究提供了可靠的试验数据。 相似文献
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产气荚膜梭菌α毒素的研究进展 总被引:1,自引:1,他引:0
作者对产气荚膜梭菌α毒素的组成、理化性质、生物学特性、检测、结构功能、作用机理、分子遗传及其与氨基酸的组成和细胞膜之间的关系等方面的研究进展作了简要综述。 相似文献
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产气荚膜梭菌 (Clostridiumperfringens)的致病作用一般由它所产生的胞外酶或毒素诱导。主要有α -毒素、β -毒素、θ -毒素及其他的一些胞外酶。本文针对产气荚膜梭菌α毒素的组成、结构、理化性质、作用机理及分子遗传等方面的研究进展作了简要综述。 相似文献
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抗A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立与中和效应 总被引:2,自引:0,他引:2
用提取的 A 型产气荚膜梭菌 α毒素包涵体免疫 B A L B/c 小鼠后, 取小鼠脾细胞与 S P2/0 骨髓瘤细胞进行融合和克隆化,经间接 E L I S A 筛选,共获得 1 A8、1 C3、1 D5、1 D8、1 F1、1 H1 和 2 E3 7 株稳定分泌单克隆抗体( M c Ab)的杂交瘤细胞株。经鉴定,7 株 M c Ab 的 Ig 亚类有 Ig G1(1 D8)、 Ig G3(1 A8、1 C3 和 2 E3)和 Ig M(1 D5、1 F1 和 1 H1)。细胞培养上清和腹水抗体效价分别为 1∶512~1∶1 024 和 1∶106 ~1∶108 。尤为重要的是,2 E3 杂交瘤细胞株分泌的 M c Ab 不仅能够中和 α毒素的磷脂酶 C活性和溶血活性,而且能够对致死性腹腔感染小鼠产生良好的被动保护作用。 相似文献
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已构建的能表达产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因工程菌株E.coliBL21(DE3)(pXETA1)经动物试验证实没有毒性。从IPTG诱导后的工程菌中提取包涵体,再辅以氢氧化铝胶制成抗原,免疫小鼠30d后,用产气荚膜梭菌强毒株培养物上清及培养菌体攻击,结果免疫鼠能抵抗至少2LD100的攻击,证明E.coliBL21(DE3)(pXETA1)工程菌株表达产物具有良好的免疫原性。 相似文献
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采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含α毒素基因的重组质粒,用SDS—PAGE检测不同条件下α毒素基因的表达情况。经酶切鉴定证实重组质粒pXETA02含有α毒素基因且基因序列和阅读框架正确。结果表明,以乳糖诱导α毒素基因表达的优化条件为:培养基pH7.0,培养温度37℃,菌体生长密度D600达到1.0时分批添加0.5g/L乳糖,诱导5h,此时目的蛋白表达量为23%,实现了α毒素基因的高效表达。从而为C型产气荚膜梭菌α毒素基因工程菌苗的生产工艺研究提供了可靠的试验数据。 相似文献
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为了研究C型产气荚膜梭菌β毒素基因的遗传变异特点,试验采用生物软件设计扩增产气荚膜梭菌β毒素基因的引物,PCR扩增产物纯化后测定核苷酸序列,然后与参考序列进行同源性比对。结果表明:所测菌株与参考菌株核苷酸序列同源性依次为99.5%、99.8%、99.9%,推导的氨基酸序列同源性依次为99.4%、99.4%、99.6%,碱基突变以A-G、C-T之间的转换为主。 相似文献
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已构建的能表达产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因工程菌株E.coliBL21(DE3)(pXETA1)经动物试验证实没有毒性。从IPTG诱导后的工程菌中提取包涵体,再辅以氢氧化铝胶制成抗原,免疫小鼠30d后,用产气荚膜梭菌强毒株培养上清及培养菌体攻击,结果免疫鼠能抵抗至少2LD100的攻击,证明E.coliBL21(DE3)(pXETA1)工程菌株表达产物具有良好的免疫原性。 相似文献