日本血吸虫Wnt1基因的鉴定及在不同发育阶段表达水平分析

为研究Wnt信号通路对血吸虫发育的调节作用,本研究克隆鉴定了日本血吸虫的Wnt1基因(SjWnt1).序列分析显示,SjWnt1蛋白具有Wnt信号蛋白家族的结构功能域,但比高等生物的Wnt1少一个保守的Cys.mRNA和蛋白的定量分析结果显示,SjWnt1表达于血吸虫的整个发育过程,而在虫卵和早期童虫中呈高表达水平,提示SjWnt1对卵胚发育和早期童虫的细胞分化具有调节作用.来源于非适宜宿主及单性感染的发育不良虫体中SjWnt1 mRNA水平比发育正常的虫体高,表明不良发育的虫体相应的Wnt信号阻滞.SjWnt1表达下调后则引起Wnt/β-catenin、Wnt/PCP及Wnt/Ca2+通路的相应下游基因的mRNA水平下降,推测SjWnt1可能通过这3种传递途径行使信号传递的功能.     

日本血吸虫基因重组抗原rSj06868对小鼠的免疫保护效果

为克隆、表达日本血吸虫假想蛋白SJCHGC068068编码基因（暂命名为Sj06868）并观察重组抗原的免疫预防效果。应用PCR技术从日本血吸虫7 d童虫、14 d童虫mRNA反转录制备的cDNA中克隆到Sj06868基因的46-438 bp DNA片段,BLASTn分析未发现其他物种中的同源性序列,也未发现其保守序列和相关功能结构域。以pET32a为表达载体、Sj06868基因在大肠杆菌Rosetta（DE3）中获得高效表达,表达产物rSj068068分子量为36 kDa,能被感染血吸虫14 d兔血清识别。将纯化的重组抗原与佐剂ESSAI ISA 206 CELL混合后免疫BALB/c小鼠,与佐剂对照组和PBS对照组相比,分别获得了31.63%、29.19%减虫率以及55.63%、56.27%肝脏虫卵减少率。用ELISA检测各组血清中抗rSj068068特异性抗体结果显示,免疫组在攻击感染前、佐剂对照组和PBS对照组在感染后均产生了较高水平的特异性抗体。本研究结果说明,Sj068068是日本血吸虫特有的童虫期高表达基因,rSj068068在抗血吸虫疫苗和血吸虫感染的诊断方面均有潜在应用价值。     

日本血吸虫七跨膜基因SjSTMP的鉴定及生物学特性分析

本实验室在扩增血吸虫Wnt信号通路Frizzled受体家族新成员过程中,获得了一个新的七跨膜蛋白(Schistosoma japonicum seven transmembrane protein,Sj STMP)的编码基因,编码含有1141个氨基酸的蛋白质。Sj STMP蛋白仅与Frizzled蛋白具有相似性,有7个穿膜区,N端也具有半胱氨酸富集区,具有作为细胞表面受体的结构基础。Sj STMP的转录随发育调节,在不同发育阶段及不同性别间Sj STMP m RNA水平存在差异,在同一发育阶段的发育正常与发育不良虫体间Sj STMP m RNA水平也存在差异。Sj STMP蛋白在虫体组织内广泛分布,无组织特异性。Sj STMP蛋白功能的进一步确定,将有助于在分子水平了解血吸虫发育调控过程。     

日本血吸虫信号转导蛋白sjwnt10a基因的克隆及其在童虫和成虫中mRNA表达量的变化

利用RACE技术从19日龄的日本血吸虫童虫中扩增了1个Wnt家族基因，并对其进行了生物信息学分析。同源性分析表明，该基因为日本血吸虫新基因，完整开放阅读框（ORF）长1896bp，编码631个氨基酸，理论分子质量为73．3ku。该基因编码的氨基酸序列具有wnt家族蛋白的典型特征，与人、鼠Wnt10a的氨基酸序列同源性均为26％，推测为血吸虫的Wnt10a基因，命名为Sjwnt10a（GenBanK登录号DQ643829）。利用实时荧光定量PCR分析该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体中的表达情况，结果显示该基因在19日龄的日本血吸虫童虫中表达量最高，在14日龄童虫和44日龄雄虫中也有表达，但分别仅为19日龄童虫表达量的8．8％和5．0％，而在31日龄成虫和44日龄雌虫中没有检测到该基因。结果提示，童虫差异表达的Sjwnt10a基因可能对童虫的生长、发育至关重要。     

日本血吸虫7d童虫cDNA文库构建及免疫筛选

为了从7 d童虫cDNA文库筛选出童虫发育阶段特异性表达抗原基因。本研究首先构建了日本血吸虫7 d童虫cDNA文库,其次再采用日本吸血虫感染血清进行筛选。结果显示:建立的文库插入片段为0.5~3.0 kb,文库重组率为98%,初始文库滴度为2.4×10~6 pfu/mL,扩增后滴度为1.6×10~9 pfu/mL,利用感染日本血吸虫10 d和42 d的小鼠血清免疫筛选该文库,初筛和复筛后获得17条有效EST序列,其编码7个基因,分别为复制蛋白(2 ESTs)、肝再生增强因子(3 ESTs)、血小板活化因子(6 ESTs)、钙调理蛋白基因(3 EST)、丝束蛋白(1 ESTs)、核糖体RNA(1 EST)和还原型辅酶脱氢酶基因(1 EST)。该研究结果对今后探讨血吸虫的生长发育机制及筛选血吸虫早期诊断抗原具有重要意义。     

蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2基因mRNA在小鼠睾丸发育过程中的表达

为探讨蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2 mRNA在小鼠出生后睾丸发育过程中的表达规律,本试验以16组出生后不同发育阶段的昆明种健康小鼠的睾丸组织为材料,经Real-time PCR检测小鼠出生后睾丸中Shp2基因mRNA的表达变化。结果显示,Shp2基因mRNA在小鼠出生后睾丸发育过程中连续表达,且第20~31天出现明显波动,20 d时Shp2表达量极显著增加(P<0.01),然后下降(P<0.01),在31 d再次极显著增加(P<0.01),31 d后,Shp2的表达量又逐渐恢复平稳(P>0.05)。上述结果表明,Shp2基因的连续性表达及在特定发育阶段表达量的明显波动,预示着Shp2参与小鼠出生后睾丸发育的全过程,但具体作用如何还有待进一步研究。     

扩展莫尼茨绦虫wnt基因在虫体不同发育体节的差异表达

研究扩展莫尼茨绦虫(Moniezia expansa)wnt基因家族wnt1、wnt2、wnt4、wnt5和wnt11B5个基因在虫体不同发育体节的差异表达及组织分布规律,为进一步揭示Wnt信号通路在扩展莫尼茨绦虫发育中的作用奠定基础。作者采用SYBR GreenⅠqRT-PCR方法分析了wnt1、wnt2、wnt4、wnt5和wnt11B在虫体头颈节、幼节、成节和孕节的mRNA相对转录情况;采用核酸原位杂交方法分析上述5个基因在虫体头颈节、幼节、成节和孕节的mRNA分布情况。结果显示,wnt基因家族成员在虫体各发育体节均有表达,wnt1、wnt4、wnt5和wnt11B基因在虫体头颈节的mRNA转录水平相对较高,而在虫体孕节的mRNA转录水平最低;与之相反,wnt2基因在虫体头颈节的mRNA转录水平最低,而在虫体幼节的转录水平较高。原位杂交的结果表明,在虫体的头颈节,wnt基因主要表达于虫体的吸盘部位;在幼节和孕节,主要表达于虫体的节间腺,而在成节,wnt基因在虫体的雌雄生殖系统(如卵巢、睾丸)均有表达,并且在虫体的节间腺以及表皮也有一定的表达。综上,扩展莫尼茨绦虫5个wnt基因在虫体头颈节以及幼节的mRNA转录水平较高,且在虫体的吸盘、节间腺以及雌雄生殖细胞均有分布,因此初步推测Wnt信号通路可能参与扩展莫尼茨绦虫体节以及生殖细胞的发育过程,当然这一假说还有待进一步验证。     

日本血吸虫幼虫巨大致死基因片段的克隆、表达及免疫效果分析

为研究日本血吸虫(Schistosoma japonnicum)幼虫巨大致死基因(Lethal giant larvae)的生物学功能,本研究应用荧光定量RT-PCR分析SjLgL基因在S.japonnicum不同发育阶段的表达情况,构建重组表达质粒pET-SjLgL进行诱导表达,对重组蛋白进行western blot鉴定;重组蛋白刺激免疫动物进行免疫保护试验,检测IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ的变化.结果表明,SjLgL基因在S.japonnicum不同发育时期均有表达,成虫期略高于童虫,雄虫高于雌虫.Western blot鉴定结果显示,该重组蛋白具有良好的抗原性.免疫保护试验结果表明,免疫小鼠分别获得了22.34％的减虫率和55.49％的肝脏减卵率.血清学检测结果显示重组蛋白免疫小鼠后产生了特异性IgG抗体.细胞因子检测结果表明,重组蛋白刺激免疫动物主要诱发产生Th1型的免疫应答.本实验结果表明该重组蛋白在小鼠体内可诱导产生部分免疫保护效果.     

日本血吸虫凋亡相关基因SjBAK的初步研究

利用PCR技术扩增日本吸血虫凋亡相关基因BAK(Bcl-2 homologous antagonist/killer),并构建重组质粒。应用Realtime PCR技术分析在日本血吸虫非易感宿主大鼠和易感宿主小鼠来源、不同发育阶段虫体中BAK基因的表达状况。结果显示,克隆获得日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)BAK编码基因Sj BAK,其ORF含2142bp,编码713个氨基酸,理论分子量为79.3 k Da,理论等电点为4.9。结构域分析表明该基因编码蛋白具有至少3个BH结构域,属于Bcl家族成员。Real-time PCR结果显示该基因在大、小鼠来源4个不同发育阶段虫体均有表达,其中大鼠来源虫体Sj BAK的表达水平都高于小鼠来源虫体,在感染后32 d和42 d表达差异具有显著统计学意义(P0.05)。由此可推测日本血吸虫凋亡相关基因Sj BAK在血吸虫生长发育中可能发挥重要的作用。     

旋毛虫Serpin基因在不同发育时期的mRNA表达水平变化及虫体表达特性

为研究旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin),基因在不同发育时期的mRNA表达水平变化,本研究应用实时荧光定量PCR技术对不同发育时期的虫体的Serpin在mRNA表达水平进行检测。同时利用鼠抗重组蛋白血清对Serpin在旋毛虫成虫、新生幼虫、成囊前期幼虫及肌幼虫中进行定位,以鉴定该Serpin基因的表达特性。研究结果显示,在成虫时期,3 d时表达量明显高于6 h和5 d的表达量(P﹤0.05);成囊前期表达量很低,其中18 d时表达量最低(P﹤0.05);肌幼虫时期在26 d、38 d和48 d均有大量表达(P﹤0.05)。免疫荧光染色结果表明,Ts Serpin蛋白在5 d成虫期的体表表达;在新生幼虫和14 d成囊前期幼虫的体内体表均有表达;38 d肌幼虫时期明显可见表皮及体内均有表达。本实验为探究旋毛虫在宿主体内免疫逃避机制奠定基础。     

不同龄期柞蚕的表皮生长因子受体(ApEGFR)基因的表达特性分析

根据NCBI公共数据库获取的家蚕表皮生长因子受体基因序列,设计8对针对表皮生长因子受体基因的特异性引物。提取柞蚕中不同龄期和不同组织中总RNA,以Oligo-dT为引物,反转录为第一链cDNA,经PCR扩增,荧光定量PCR检测,结果表明表皮生长因子受体基因在不同发育阶段中的表达有差异。不同发育阶段和整个眠期的柞蚕中,ApEGFR的mRNA均有表达,但在5龄和3眠期的时候的表达量最高。不同组织中,在柞蚕的丝腺中ApEGFR的mRNA表达量最高,表皮最低。     

牛IRF7蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

本研究旨在通过原核表达系统表达牛干扰素调节因子7（interferon regulatory factor 7,IRF7）蛋白,并对其进行纯化,进而制备高纯度的牛IRF7兔多克隆抗体。使用生物信息学软件预测并分析牛IRF7潜在的生物学功能,参考GenBank已公布的牛IRF7基因序列（登录号：NM_001105040.1）设计引物,利用PCR技术从牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）感染的MDBK细胞中扩增牛IRF7基因,连接至pMD19-T克隆载体,提取质粒连接至原核表达载体pET-28a （+）,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建重组质粒pET-28a-IRF7。将重组质粒pET-28a-IRF7转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE进行表达产物的分析与鉴定。通过Western blotting鉴定多克隆抗体的特异性,间接ELISA测定兔抗牛IRF7多克隆抗体效价,经BVDV感染细胞后,实时荧光定量PCR检测抗病毒因子IRF7的表达。生物信息学分析发现,IRF7蛋白不存在跨膜结构域,无信号肽,存在较多磷酸化位点,二级结构主要以无规则卷曲为主,与三级结构的三维模型一致,说明该蛋白可能存在很好的抗原潜力。PCR成功扩增出大小为1 497 bp的IRF7基因片段,成功表达牛IRF7蛋白,分子质量约为60 ku,间接ELISA测得兔抗牛IRF7多克隆抗体效价为1∶128 000,并可与牛IRF7蛋白发生免疫反应,感染BVDV毒株的MDBK细胞中IRF7表达量下降;BVDV感染过表达IRF7后的细胞发现,IRF7能显著促进干扰素-β（IFN-β）的表达（P<0.05）。综上,本研究成功表达纯化了牛IRF7蛋白,并制备兔抗牛IRF7多克隆抗体,为阐明牛IRF7在先天免疫抗病毒应答的分子机制提供了材料。     

Expression Analysis of C-type Natriuretic Peptide and Its Receptor in Buffalo Follicles

In order to investigate the expression pattern of C-type natriuretic peptide（CNP）and its receptors（NPR）in buffalo follicles,firstly,the mRNA expression level of ANP,BNP,CNP,NPR1 and NPR2 in ovary were assayed by Real-time quantitative PCR;Secondly,the protein expression of CNP and NPR2 in buffalo follicles were detected by immunohistochemical stainning method;Lastly,the mRNA expression level of CNP and NPR2 in granule cells and cumulus cells were assayed by Real-time quantitative PCR.The results showed that CNP gene and its receptor NPR2 mainly expressed in buffalo ovary,the protein of CNP and NPR2 expressed in all stages of follicles,CNP mainly expressed in mural granulosa cells and NPR2 primarily presented in cumulus cells,the mRNA expression of CNP gene in granule cells was significantly higher than cumulus cells（P<0.05),whereas the mRNA expression of NPR2 gene in cumulus cells was significantly higher than granule cells（P<0.05).In conclusion,among the main members of natriuretic peptides and its receptors,CNP and NPR2 presented strong expression in buffalo ovary.CNP mainly expressed in mural granulosa cells,but NPR2 primarily presented in cumulus cells which arounding oocytes.     

家蚕葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶家族基因BmGMCβ2的克隆及序列与表达分析

葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶(glucose-methanol-choline oxidoreductases,GMC)家族是昆虫体内一大类以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶的氧化还原酶类,家蚕基因组中含有43个GMC家族基因。以家蚕5龄幼虫cDNA为模板克隆到一个家蚕GMC家族基因,命名为BmGMCβ2(GenBank登录号:JQ965926)。该基因cDNA全长1 875 bp,编码624个氨基酸,预测蛋白质分子质量为69.3 kD,pI为6.21,定位于家蚕16号染色体的nscaf3058上,编码蛋白质含GMC家族共有的ADP-bindingβ-α-β折叠结构域。系统发育分析表明该基因是家蚕GMC家族β亚家族基因成员。RT-PCR检测家蚕不同发育时期和5龄第3天幼虫不同组织中BmGMCβ2基因mRNA转录水平,以5龄盛食期最高,并且主要在表皮、脂肪体和气管中转录表达;Westernblotting分析BmGMCβ2蛋白主要在5龄第3天幼虫的脂肪体中表达。将BmGMCβ2克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,转化E.coli BL21表达菌株,IPTG诱导表达BmGMCβ2融合蛋白,通过His-亲和层析得到纯化的融合蛋白并制备多克隆抗体,为后续研究该蛋白在家蚕生长发育过程中的功能奠定了基础。     

C型利钠肽及其受体在水牛卵泡中的表达分析

为了探明C型利钠肽（C-type natriuretic peptide,CNP）及其受体（natriuretic peptide receptor,NPR）在水牛卵泡中的表达模式,本研究首先采用实时荧光定量PCR技术检测水牛卵巢中利钠肽家族主要成员A型、B型、C型利钠肽（ANP、BNP、CNP）及其Ⅰ型、Ⅱ型受体（NPR1、NPR2）的mRNA表达情况,然后利用免疫组化技术对水牛卵泡中CNP及NPR2蛋白进行定位,最后利用实时荧光定量PCR技术检测颗粒细胞和卵丘细胞中CNP及NPR2的mRNA表达规律。结果显示,水牛卵巢主要表达CNP及NPR2,且在各级卵泡中均有表达,其中,CNP主要在壁层颗粒细胞中表达,NPR2主要在卵丘细胞中表达;颗粒细胞上CNP mRNA表达水平显著高于卵母细胞周围的卵丘细胞（P<0.05）,而卵丘细胞上NPR2 mRNA表达水平显著高于颗粒细胞（P<0.05）。综上所述,在利钠肽主要家族成员和受体中,CNP和NPR2在水牛卵巢中呈现强表达,CNP主要在壁层颗粒细胞中表达,而NPR2主要在卵母细胞周围的卵丘细胞中表达。     

Pax7基因在猪不同组织中的表达特征及其在背最长肌中的发育性表达规律研究

本试验旨在探究Pax7(paired box 7)基因在猪不同组织中的表达特征及其在背最长肌中的发育性表达规律.采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术和Western blotting技术检测了Pax7基因在1日龄马身猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、小肠、下丘脑、小脑、背最长肌、腰大肌、股二头肌12种组织中的mRNA和蛋白质表达谱,以及马身猪和大白猪从出生1日龄到180日龄7个发育阶段(1、30、60、90、120、150、180日龄)背最长肌中的发育性表达规律.结果表明,Pax7基因mRNA在背最长肌、腰大肌、股二头肌、下丘脑和小脑组织中表达,而Pax7蛋白仅在背最长肌、腰大肌和股二头肌中表达.背最长肌中Pax7基因mRNA和蛋白质的发育性表达趋势在马身猪和大白猪中基本一致.在mRNA水平上,30日龄的表达量最高,极显著高于其他日龄(P <0.01);1日龄的表达量次之;其他日龄维持低表达的稳定状态.Pax7蛋白表达量在1日龄时最高,极显著高于其他日龄(P <0.01);30日龄次之;其他日龄维持低表达的稳定状态.从出生1日龄到180日龄,马身猪背最长肌中Pax7蛋白的表达量均显著或极显著地高于大白猪(P <0.05;P <0.01).Pax7 基因的表达与组织、日龄及品种的遗传背景有关.     

催青温度对家蚕二化性品种滞育激素受体基因表达的影响及基因的结构特征

家蚕二化性品种的卵滞育与否受上代环境影响,25℃高温明催青将产滞育卵,而15℃低温暗催青将产非滞育卵。为探究催青温度调控二化性家蚕滞育的分子机制,对从家蚕卵巢细胞中克隆的家蚕滞育激素受体基因(Bmdhr)的5种cDNA进行生物信息学分析,结果表明Bmdhr基因的5种cDNA由相同的mRNA转录本通过不同的剪接方式而来,其中Bmdhr mR-NA-1与Bmdhr mRNA-2编码的氨基酸序列相同,Bmdhr mRNA-4编码的氨基酸序列与家蚕滞育激素BmDHR-1的序列相似度达99.2%。将家蚕二化性品种秋丰的蚕卵用蛾区半分法分成2组,分别以15℃暗催青和25℃明催青,利用实时荧光定量PCR分析催青温度对家蚕不同发育时期及蚕体组织中Bmdhr基因mRNA转录的影响。结果显示:Bmdhr mRNA-1主要在蛹期卵巢中表达,在对滞育激素最敏感的化蛹后4 d时,其转录水平急速上升至峰值,并且高温催青的转录水平高于低温催青;Bm-dhr mRNA-4主要在各发育时期的蚕体血液中表达,特别是在高温明催青条件下,其在蛹期血液中的转录水平是低温暗催青的7.7倍,说明BmDHR-4可能是决定家蚕二化性品种卵滞育与否的关键因子之一;Bmdhr mRNA-5在化蛹后2～3 d的卵巢中转录水平高,且低温催青的转录水平高于高温催青,化蛹后3 d其转录水平开始下降,至化蛹后4～5 d 2种催青处理间的转录水平无显著差异。研究结果为阐明家蚕滞育的分子机制积累了实验数据。     

Study on the Expression Profile of Pax7 Gene and its Developmental Expression in Longissimus Dorsi of Pigs

The aim of this study was to investigate the expression profile of Pax7 (paired box 7) gene in different tissues and its developmental expression in longissimus dorsi of pigs.The expression profiles of Pax7 gene at the levels of mRNA and protein in 12 different tissues including heart,liver,spleen,lung,kidney,stomach,small intestine,hypothalamus,cerebellum,longissimus dorsi,biceeps femoris,psoas major of Mashen pigs at birth and the developmental expression patterns in longissimus dorsi at seven stages (1,30,60,90,120,150,and 180-day old) of Mashen and Large White pigs were studied by quantitative Real-time PCR and Western blotting.The results showed that the Pax7 mRNA was expressed in longissimus dorsi,biceeps femoris,psoas major,hypothalamus,and cerebellum,wherease the Pax7 protein was only expressed in skeletal muscles of longissimus dorsi,biceeps femoris,and psoas major.The developmental expression patterns of Pax7 mRNA and protein in Mashen pig was basically in accordance with those in Large White pig.The mRNA expression amount of Pax7 gene in longissimus dorsi was the greatest at 30-day old (P <0.01),followed by the expression at 1-day old,and kept lower stable levels at other stages both in Mashen and Large White pigs.At the stages of 30-day,90-day,and 180-day old,Pax7 mRNA expression amounts in Mashen pig were significantly higher than those in Large White pig (P <0.01).The Pax7 protein expression at 1-day old was the greatest (P <0.01),followed by it at 30-day old,which were significantly greater than those at other stages,at which Pax7 expression was in lower stable levels.The Pax7 protein expression from one-day old to 180-day old in Mashen pig was significantly greater than those in Large White pig (P <0.05;P <0.01).The expression of Pax7 gene could associated with tissue,age,and background of pig breed.     

家蚕ycaCR基因的表达特征及蛋白质的亚细胞定位

ycaC相关蛋白含有一个保守的ycaC-related结构域,属于异分支酸酶超家族成员。从家蚕蛹cDNA文库中检索到一条EST序列,编码一个含ycaC-related保守结构域的蛋白质,将该cDNA的全长序列命名为BmycaCR(GenBank登录号:GU292794)。通过基因克隆、原核表达和纯化技术得到BmycaCR蛋白,用纯化的蛋白质为抗原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。Western blot检测BmycaCR蛋白在家蚕卵期的表达水平明显高于其它发育时期,蛋白质在5龄幼虫的睾丸、马氏管、气管、卵巢、表皮、肠和脂肪体中均有表达,而在头部、血液和丝腺中没有检测到阳性信号。荧光定量PCR检测BmycaCR在家蚕卵期的转录水平明显高于其它发育时期,在5龄幼虫各组织中,BmycaCR的转录水平由高到低依次为睾丸、气管、脂肪体、卵巢、表皮、肠、血液、马氏管、丝腺和头部。亚细胞定位显示BmycaCR蛋白在细胞核和细胞质中均有分布,可能发挥基本的生物学功能,并在靠近质膜区域有强的荧光信号,可能具有与其它蛋白质相互结合的功能。